生物液体的蛋白质组分析的制作方法

专利名称：生物液体的蛋白质组分析的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及生物液体的蛋白质组鉴定，及其在确定母体/胎儿症状的状态中的用途，该症状包括胎儿来源的母体症状，染色体非整倍性，以及与胎儿生长和成熟相关的胎儿疾病。特别地，本发明涉及鉴定羊水的蛋白质组(代表羊水组成的多种蛋白质)和正常的蛋白质组的特征性变化与各种病理性母体/胎儿症状的相关性，这些症状例如羊膜内感染，或染色体缺陷.
相关技术的描述蛋白质组学蛋白质表达模式的大规模分析作为当前DNA克隆方法和基因表达图谱(gene profiling)方法的一种重要和必要的工具出现(Pandey和Mann，Nature405837-46(2000))。在根据同源性方法推导一些结构和可能的蛋白质修饰中，DNA序列信息是有用的，但是，不会提供关于在翻译后修饰、蛋白质水解或区室化(compartmentalization)中的蛋白质功能调控的信息。
传统的基于凝胶的方法，例如一维和二维的凝胶电泳用于小规模的蛋白质检测(＜1,000种蛋白质)，但是这些方法需要大的样本量(Lilley KS，Razzaq A，Dupree PTwo-dimensional gel electrophoresisrecent advances insample preparation，detection and quantitation.Curr Opin Chem Biol.6(1)46-50，2002)。用于克服这种缺陷的方法包括基质辅助或增大表面的激光吸附/电离(MALDI或SELDI)飞行时间(time-of-flight)质谱，该方法能够精确地生成显示样本中蛋白质的质量的图谱。这些图谱或模式用于鉴定和监控各种疾病。将肽作图与串联质谱分析结合，获得第二水平的鉴定，从肽片段上获得氨基酸序列信息。这可以例如通过将MALDI/SELDI或者ESI与四级(quadrupole)时间飞行MS(Qq-TOF MS)结合来实现。后一种方法还可以用于量化特定肽(ICAT技术)。
病理性母体/胎儿症状的诊断有许多病理性母体的和胎儿症状，例如羊膜内感染(IAI)，先兆子痫，早产与分娩，染色体非整倍性，都会在怀孕过程中产生，包括健康状况(well-being)，或者有时威胁母体和/或胎儿或者新生儿的生命。对这种症状进行早期诊断，对于进行及时治疗和介入是关键的。不幸的是，对这些症状的大部分进行早期诊断是困难的，因为临床信号和症状出现较晚，并且通常是非特异性的和不一致的。例如，IAI的临床症状通常包括母体发热和白血球增多，但是这些症状通常出现较晚，不灵敏，也不特异。因此，Gravett等，Am.J.Obstet.Gynecol.1711660-7(1994)中利用非人类的灵长类模型，证明了在用B组链球菌感染进行实验性羊膜内感染后，仅在感染诱导的早产(preterm labor)开始的50％的时间内出现发热和白血球增多，在实验性感染后的28-40小时中发生。因此，为了避免诊断延误，应保证高的怀疑指数和适当采用辅助性实验室检测。通常用于诊断IAI的临床标准包括母体发热(＞37.8℃)，以及如下的两种或多种母体白血球增多(＞15,000/mm3)，母体或胎儿心动过速，子宫疼痛(uterine tenderness)，浑浊恶臭的羊水(foul-smelling amniotic fluid)。
由于临床特征间存在矛盾，用其他的辅助性实验室检测来辅助IAI诊断。这些检测包括测量母体C-反应活性蛋白，直接检测羊水中白血球或，革兰氏染色、羊水培养物的细菌，测量羊水葡萄糖浓度，检测羊水中的白血球酯酶，通过气液层析检测细菌性有机酸羊水白血球，测量各种羊水或者阴道细胞因子(例如，白细胞介素2，4，6，粒细胞菌落刺激因子和肿瘤坏死因子-α)，基质金属蛋白酶-9，乳铁传递蛋白和通过超声波评价胎儿活性(生物物理表现)。测量细胞因子或者其他生物化学因子是昂贵的，通常不能在临床上使用，主要是作为一种研究工具。此外，这些检测的检测效率并不总是一贯地高于传统检测，例如羊水革兰氏染色和培养，羊水葡萄糖浓度，和检测羊水白血球酯酶。先前已经对这些检测的效率进行广泛的评述。(Ohlsson，A.和Wang，E.An analysis of antenatal tests to detect infection atpreterm rupture of the membranes.American Journal of Obstetrics andGynecology 162809，1990)。尽管所有检测都具有合理的灵敏度、特异性和预测值，但是这些检测都不具有作为在IAI诊断中独立于临床特征而使用的充足灵敏度或特异性。
因此，迫切需要可以及早和正确地检测IAI和其他病理性母体/胎儿症状的新方法。
特别期望开发新的、有效和可靠的非侵入性方法，用于诊断染色体非整倍性。目前，在母体血清筛查和超声波检查后，对染色体非整倍性的最后诊断需要进行中间持续三个月的遗传羊水诊断。这是一种侵入性过程，伴随0.5％的流产风险。此外，羊水细胞的染色体分析高强度和费时的过程，需要2周时间。因此，需要可靠的检测，以改善对母体血清或其他生物液体的染色体非整倍性的检测，减少母体筛查的不可接受的高假阳性，提高对羊水诊断后的羊水的诊断速度和效率。通过超声波或者传统的母体血清筛查进行筛查，会完全遗漏其他病理性非整倍性的症状，例如Klinefelter综合症和Turner综合症。
发明概述本发明提供非侵入性的和灵敏的方法，通过生物液体的蛋白质组分析，用以早期诊断、预后和监控病理性的胎儿/母体症状。
本发明还提供生物液体如羊水和母体血清的蛋白质组图谱，使得可以诊断、预后和监控各种病理性的胎儿/母体症状，包括但是不限于，羊膜内感染(IAI)，染色体非整倍性，和与胎儿生长和成熟相关的胎儿疾病。特别地，本发明提供IAI和染色体非整倍性的正常的和病理性的蛋白质组图谱。确定正常的蛋白质组图谱是极其重要的，该图谱能够消除质疑(阴性诊断结果)中的胎儿/母体症状，使得受试者不需要遭受不必要的和可能危险的处理或介入。
本发明还提供确定各种胎儿或母体症状(condition)的存在和状态的特定生物标记，这些症状例如IAI和染色体非整倍性，当存在这种病理性的症状时，这些标记在生物液体例如羊水或母体血清中差别地被表达。这种生物标记和结合到该生物标记上的抗体，可以例如在蛋白质或抗体阵列上呈递，其可用于样本的、非侵入性诊断分析中。
一个方面，本发明涉及用于确定母体或胎儿症状的状态的方法，包括比较从哺乳动物受试者获得的生物液体的检测样本的蛋白质组图谱与正常样本的蛋白质组图谱，或者参考蛋白质组图谱比较，该参考图谱至少包含一种这种症状的独特表达特征(signature)表征。
在本发明的一个实施方案中，哺乳动物受试者是怀孕的雌性，优选为灵长类或人。
在另一个实施方案中，母体症状选自子宫内感染、先兆子痫或早产(preterm labor)。
在另一个实施方案中，胎儿情况(condition)选自染色体非整倍性，先天性畸形，妊娠年龄或胎儿成熟，其中染色体非整倍性可以是Down综合症，三体性-13，三体性-18，Turner综合症或Klinefelter综合症。
任何生物液体可用于实施本发明的方法，包括，但是不限于，羊水、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、乳汁、粘液和唾液，优选为羊水或母体血清。
在另一个实施方案中，检测样本的蛋白质组图谱包括至少两种蛋白质的信息，或至少5种蛋白质，或至少10种蛋白质，至少20种蛋白质，至少50种蛋白质的信息。
在特定实施方案中，蛋白质组图谱是质谱。
在另一个实施方案中，质谱在其3-5kDa范围内包括至少一种独特的表达特征。
在还有另一个实施方案中，质谱在其10-12kDa范围内包括至少一种独特的表达特征。
在另一个实施方案中，母体症状为羊膜内感染，而独特的表达特征为检测样本中的，10-11kDa分子量范围内的额外峰值，这指示羊膜内感染。
在不同实施方案中，通过Western印迹分析生成蛋白质组图谱(profile)。
在另一个实施方案中，生物液体是人的液体，蛋白质组图谱包括一种或多种蛋白质的表达信息，该蛋白质选自巨噬细胞加帽蛋白、嗜中性白细胞明胶酶相关的lipocalin，髓过氧化物酶；L-网素(plastin)；azurocidin；抗菌蛋白FALL-39；Gp340变体蛋白；Ebner唾液腺蛋白同源物(GenBank登录号355392)；白血球弹性蛋白酶抑制剂；钙粒蛋白A；钙粒蛋白B；丝切蛋白(cofilin)；膜突蛋白；抑制蛋白I，cronin样蛋白p57；膜联蛋白II，纤连蛋白；神经胶质来源的连接蛋白；抗凝血酶III；鳞片状上皮细胞(squamous cell)癌抗原1，鳞片状上皮细胞癌抗原2；丝氨酸蛋白酶抑制剂12；半胱氨酸蛋白酶抑制剂A；半胱氨酸蛋白酶抑制剂B；半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；IGFBP-1；维生素D-结合蛋白；载脂蛋白A-I；14-3-3蛋白σ(sigma)；14-3-3蛋白ζ/δ(zeta/delta)；凝胶溶胶蛋白；乳运铁蛋白；磷酸甘油酸激酶1；磷酸甘油酸变位酶1；或转酮醇酶；或其片段、前体或天然存在的变体。
在另一个实施方案中，蛋白质组图谱包括一种或多种蛋白质的表达信息，该蛋白质选自巨噬细胞加帽蛋白；嗜中性白细胞明胶酶相关的lipocalin；髓过氧化物酶；L-网素；azurocidin；抗菌蛋白FALL-39；白血球弹性蛋白酶抑制剂；钙粒蛋白A；钙粒蛋白B；抑制蛋白I，神经胶质来源的连接蛋白；丝氨酸蛋白酶抑制剂12；半胱氨酸蛋白酶抑制剂A或IGFBP-1；或其片段、前体或天然存在的变体。
前述的方法适合用于诊断各种胎儿和母体的症状，包括，但是不限于，羊膜内感染，发育缺陷，包括器官系统的缺陷，肌与骨骼畸形，由染色体非整倍性产生的症状，例如Down综合症，三体性(trisomy)-13，三体性-18，Turner综合症，或Klinefelter综合症。
如果检测样本的蛋白质组图谱实质上与正常样本的蛋白质组图谱相同，可以确定受试者不具有母体或胎儿病症。
如果蛋白质组图谱实质上含有与患病样本相同的独特表达特征，该患者被诊断为患有相应的母体或胎儿病症。
在另一个方面，本发明涉及用于诊断羊膜内感染的方法，包括(a)将生物液体的检测样本的蛋白质组图谱与正常样本的蛋白质组图或者参考蛋白质组图谱比较，该生物液体从怀孕的雌性哺乳动物中获得，其中该蛋白质组图谱提供存在于样本中的蛋白质或其蛋白质水解片段的质量的信息；和(b)如果检测样本的蛋白质组图谱具有处于3-5和/或10-12Kda分子量范围内的独特表达特征，则诊断哺乳动物患有羊膜内感染。
在还有一个方面，本发明涉及用于诊断羊膜内感染的方法，包括(a)将生物液体的检测样本的蛋白质组图谱与正常样本的蛋白质组图谱比较，该生物液体从怀孕的雌性哺乳动物中获得；和(b)如果至少一种选自IGFB-1，抑制蛋白，血浆铜蓝蛋白，L-网素和钙粒蛋白，或其片段、前体或天然存在的变体的蛋白在检测样本中相对于正常样本差别性地表达，则诊断哺乳动物患有羊膜内感染。
一个特定实施方案中，至少IGFBP-1，抑制蛋白，血浆铜蓝蛋白，和钙粒蛋白，或其片段、前体或天然存在的变体之一在检测样本中相对于正常样本被过度表达。
在另一个实施方案中，相对于正常样本，L-网素在检测样本中过低表达。
在还有另一个实施方案中，通过确定如附

图12所示蛋白质水解片段或其片段来检测IGFBP-1的存在。
在另一个方面，本发明涉及诊断染色体非整倍性的方法，包括(a)将生物液体的检测样本的蛋白质组图谱与正常样本的蛋白质组图谱或者参考蛋白质组图谱比较，该生物液体从怀孕的雌性哺乳动物中获得，其中该蛋白质组图谱提供存在于样本中的蛋白质或其蛋白质水解片段的质量(mass)的信息；和(b)如果检测样本的蛋白质组图谱具有处于4-15Kda分子量范围内的独特表达特征，则诊断哺乳动物患有羊膜内感染。
在不同方面，本发明涉及用于诊断胎儿发育缺陷的方法，包括(a)将生物液体的检测样本的蛋白质组图谱与正常样本的蛋白质组图谱或者参考蛋白质组图谱比较，该生物液体从怀孕的雌性哺乳动物中获得；和(b)如果至少一种肌动蛋白调节蛋白或其片段、前体或天然存在的变体在检测样本中相对于正常样本被差别地表达，则确定存在发育缺陷。
在本方法的特定实施方案中，肌动蛋白调节蛋白选自膜突蛋白，p57，凝溶胶蛋白，和14-3-3蛋白。
在还有一个方面，本发明涉及用于诊断母体或胎儿感染或者免疫反应相关的异常的方法，包括(a)将生物液体的检测样本的蛋白质组图谱与正常样本的蛋白质组图谱或者参考蛋白质组图谱比较，该生物液体从怀孕的雌性哺乳动物中获得；和(b)如果至少一种蛋白在检测样本中相对于正常样本差别性地表达，该蛋白选自巨噬细胞加帽(capping)蛋白(MCP)，白血球弹性蛋白酶，嗜中性白细胞明胶酶相关lipcalcin(NGAL)，髓过氧化物酶，L-网素，钙粒蛋白，FALL-39，azyrocidin(CAP37)，蛋白酶和蛋白酶抑制剂，则确定存在母体或胎儿感染或者免疫反应相关的异常。
在还有另一个方面，本发明涉及用于诊断新生儿脓毒症的方法，包括检测从怀孕雌性哺乳动物获得的生物液体的蛋白质组图谱中是否存在Gp-340。
在还有另一个方面，本发明涉及生物液体的蛋白质组图谱，包含一种或多种蛋白的信息，该蛋白选自巨噬细胞加帽(capping)蛋白，嗜中性白细胞明胶酶相关的lipocalin，髓过氧化物酶；L-网素；azurocidin；抗菌蛋白FALL-39；Gp340变体蛋白；Ebner唾液腺蛋白同源物(GenBank登录号355392)；白血球弹性蛋白酶抑制剂；钙粒蛋白A；钙粒蛋白B；丝切蛋白(cofilin)；膜突蛋白；抑制蛋白I，cronin样蛋白p57；膜联蛋白II，纤连蛋白(fibronectin)；神经胶质来源的连接蛋白；抗凝血酶-III；鳞片状上皮细胞癌抗原1，鳞片状上皮细胞癌抗原2；丝氨酸蛋白酶抑制剂12；半胱氨酸蛋白酶抑制剂A；半胱氨酸蛋白酶抑制剂B；半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；IGFBP-1；维生素D-结合蛋白；载脂蛋白A-1；14-3-3蛋白σ；14-3-3蛋白ζ/δ；凝溶胶蛋白；乳运铁蛋白；磷酸甘油酸激酶1；磷酸甘油酸变位酶1；和转酮酶(transketolase)；或其片段、前体或天然存在的变体。
在另一个方面，本发明涉及生物液体的蛋白质组图谱，包含一种或多种蛋白的信息，该蛋白选自巨噬细胞加帽蛋白；嗜中性粒细胞明胶酶相关lipocalin；髓过氧化物酶；L-网素；azurocidin；抗菌蛋白FALL-39；白血球弹性蛋白酶抑制剂；钙粒蛋白A；钙粒蛋白B；抑制蛋白I，神经胶质来源的连接蛋白；丝氨酸蛋白酶抑制剂12；半胱氨酸蛋白酶抑制剂A；或IGFBP-1；或其片段、前体或天然存在的变体。
本发明还涉及羊膜内感染的生物液体的蛋白质组图谱，包括确认是否存在选自IGFB-1，抑制蛋白，血浆铜蓝蛋白，L-网素或钙粒蛋白的蛋白质的信息。
在另一个方面，本发明涉及羊膜内感染的生物液体的蛋白质组图谱，表现为提供存在于生物液体中的蛋白质或其蛋白质水解片段的分子量信息，包括在3-5KDa和/或10-12KDa分子量范围内的独特表达特征信息。
在另一个方面，本发明涉及基本上如附图1A-1C任何之一所示的、或者基本上如附图2A-C任何之一所示的、或者基本上如附图3A-C任何之一所示的、或者基本上如附图4A或4B所示的、或者基本上如附图6-10任何之一所示的蛋白质组图谱。
在特定实施方案中，以微阵列形式分析蛋白质组图谱。
附图简介附图1A-C.灵长类羊水中的感染诱导的差别性的蛋白质表达。/SELDI-TOF分析结合到化学定义的常相(Normal phase)芯片阵列上的羊水提取物。A)在235激光强度下收集的整个光谱显示了峰值强度的差别。B)详细光谱显示了对照和感染组在约10-12KDa区域的差别。C)详细光谱显示了对照和感染组在约3-5KDa区域的差别。实线用于表示表达中的显著差别(独特的表达特征)，这可用于开发诊断性的检测。
附图2A-C.时程(time course)分析灵长类羊水对感染的反应(GBS)。在接种细菌之前和在感染后连续收集羊水，并如下所述进行SELDI-TOF分析。附图2A感染前；2B感染后12小时；2C感染后36小时。
附图3A-C.人羊水中的感染诱导的差别性蛋白质表达。SELDI-TOF分析结合到化学定义的Normal Phase芯片阵列上的羊水提取物。A)在235激光强度下收集的整个光谱显示了峰值强度的差别。B)详细光谱显示了对照和感染组在约10-12KDa区域的差别。C)详细光谱显示了对照和感染组在约3-5KDa区域的差别。
附图4A和4B.用普通(generic)MALDI-TOF质谱分析仪获得的质谱，使用来自人羊水A)对照，未发生子宫内感染，和B)样本，发生子宫内感染。
附图5.SDS-PAGE考马斯蓝染色凝胶。A)汇集的4种人对照AF样本；B)单一的对照AF样本；C)汇集的4种人的被感染AF样本；D)单一的被感染AF样本。
附图6.检测人羊水中的差别性蛋白质表达。A)对照AF样本(汇集的)；B)被感染的AF样本(汇集的)。
附图7.检测人羊水中的差别性蛋白质表达。A)对照AF样本(汇集的)；B)被感染的AF样本(汇集的)。
附图8显示对人羊水和母体血清中的差别性蛋白质表达。A)对照样本(汇集的)；B)被感染的样本(汇集的)。
附图9显示用蛋白质阵列(arrays)检测母体血清中的差别性表达的蛋白质。1)蛋白质阵列的伪彩色(pseudocolor)图像显示相应蛋白与其抗体结合；2)放大的阵列区域；3)钙粒蛋白IP的Western印迹。
附图10显示母体血清中的差别性蛋白质表达模式，用独特的模式辨别三体性。
附图11.重新鉴定羊水蛋白的蛋白质序列(de novo protein sequence)的示意图。PRO1_HUMAN(P07737)抑制蛋白I(SEQ ID NOs5-11)。
附图12.IGFBP-1的重新鉴定和蛋白质水解片段序列(SEQ ID NO1)。Ms/MS确定的存在于样本0426se_H1_12和0425se_H1_13的肽序列显示在小写(lower case)中(SEQ ID NOs2和3)。这些肽序列来自感染的羊水，用胰蛋白酶消化，在凝胶条带上电泳，并进行MS/MS分析。在对来自感染的羊水的用胰蛋白酶消化后的～10.5-12Kda条带进行1-D凝胶电泳(小分子量范围，附图5)、Western印迹(附图6)和MS/MS分析(附图13)，检测到IGF-BP-1的蛋白质水解片段，其存在于下划线序列的区域中(SEQ ID NO4)。
附图13.来自感染的羊水的～10.5-11KD的胰蛋白酶消化ID凝胶条带的LCQ-MS图谱。LCQ-MS表明在样本中存在亲本的离子呈递潜能蛋白(ionsrepresenting potential protein)。
附图14.附图13中的17.55-18.21分钟保持(retention)时间的峰值的质谱。
附图15.附图14中显示的434.9峰值的亲本离子的MSIMS图谱。
附图16.IAI的生物标记免疫检测。16a)灵长类对照(-)和被感染的(+)AF。16b)人对照(-)和被感染的(+)AF。16c)人对照(-)和被感染的(+)AF。维生素D结合蛋白(VDBP)未被调节(unregulate)的对照标记。IGFBP-1条带呈现完整的蛋白质(-30kDa)和蛋白质水解片段(-11kDa)。16d)免疫沉淀检测汇集母体血清中的IGFBP1。对照(-)和被感染的(+)血清。16e)免疫沉淀检测汇集的母体血清中钙粒蛋白B。对照(-)和被感染的(+)血清。
优选实施方案的详细描述A.定义除非另外定义，在此所用的科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。对于在本申请中所使用的许多术语，Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第2版，J.Wiley & Sons(纽约，NY 1994)给本领域技术人员提供全面的教导。
术语“蛋白质组”用于此是描述在特定时间内，生物样本中的蛋白质的重要部分。蛋白质组的概念从根本上区别于基因组。基因组实质上是静止的，而蛋白质组对内部和外部事件相应时，持续地发生改变。
术语“蛋白质组图谱”用于此是指在特定时间内，生物样本如生物液体中的大量蛋白质的表达图谱的表示。蛋白质组图谱可以如被表示为质谱，但是还可以包括基于蛋白质的物理化学或生物化学特征的其他表示方法。因此，蛋白质组图谱可以例如基于蛋白质的电泳特征的差别，通过双向凝胶电泳确定，例如通过2-D PAGE确定，而且可以被表示为，如双向凝胶电泳中的大量斑点。即使缺乏被明确鉴定的蛋白质时，差别性表达图谱也具有重要的诊断价值。例如可以通过免疫印迹，检测单个蛋白质斑点，用蛋白质微阵列检测多个斑点和蛋白质。蛋白质组图谱通常表示或含有信息，该信息从少数峰值到表示50个或更多峰值的复杂图谱。因此，例如，蛋白质组图谱含有或表示至少2种，或至少5种或至少10种或至少15种，或至少20种，或至少25种，或至少30种，或至少35种，或至少40种，或至少45种，或至少50种蛋白质。
术语“病理症状”以广义使用，包括所有的变化和现象，包括受试者的健康状况(well-being)。病理性的母体症状包括，但是不限于羊膜内感染，胎儿或母体来源的症状和情况，例如，先兆子痫，和早产分娩(preterm labourand delivery)。病理性的胎儿症状包括，但是不限于染色体缺陷(非整倍性)，例如Down综合症，妊娠年龄(gestational age)和胎儿成熟的所有异常。
术语“病理性的[母体或胎儿]症状的状态”以广义在此使用，是指病理性症状的缺乏、存在、程度、阶段、性质、进展或衰退。
术语“独特的表达特征”用于此来描述生物样本(例如，参比样本)的蛋白质组图谱中的独特特征或基序，在统计学上显著地区别于相应的正常生物样本(从相同类型来源获得，例如生物液体)的蛋白质组图谱。
术语“羊膜内感染(IAI)”、“羊水感染”、“羊膜炎”(anmionitis)和“临床绒毛膜羊膜炎(chorioamnionitis)”可以互换使用，是指怀孕过程中的羊水和子宫内容物的急性感染，包括，但是不限于细菌感染。
“患者反应”可以用指示对患者的益处的任何终点评价，包括，而不是限制，(1)抑制病理性症状的进展，至少在某种长度上，(2)预防病理性的症状，(3)减轻一种或多种与病理性症状相关的症状，至少在某种长度上；(4)延长治疗后的存活时间；和/或(5)降低在治疗后的特定时间点的死亡率。
术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其中目的在于阻止或减缓(减轻)所靶向的病理性的症状或异常。需要治疗的那些症状包括已经出现异常的那些以及倾向于发生异常的那些和异常将被阻止的那些。
“先天性畸形”是非遗传的、但是出生就有的畸形。
B.详细描述本发明涉及用于根据母亲或胎儿的生物液体的蛋白质组图谱，早期、可靠和非侵入性地检测母体和胎儿症状的方法和装置(means)。本发明利用本领域熟知的蛋白质组技术，被描述在例如如下教科书中，这些教科书的内容在此被明确地引入作为参考Proteome ResearchNew Frontiers inFunctional Genomics(Principles and Practice)，M.R.Wilkins等，编辑，SpringerVerlag，1007；2-D Proteome Analysis Protocols，Andrew L Link，编辑，HumanaPress，1999；Proteome ResearchTwo-Dimensional Gel Electrophoresis andIdentification Methods(Principles and Practice)，T.Rabilloud编辑，SpringerVerlag，2000；Proteome ResearchMass Spectrometry(Principles and Practice)，P.James编辑，Springer Verlag，2001；Introduction to Proteomics，D.C.Liebler编辑，Humana Press，2002；Proteomics in PracticeA Laboratory Manual ofProteome Analysis，R.Westermeier等人，编辑，John Wiley & Sons，2002。
本领域技术人员将会认识到，许多与在此描述的那些类似或相当的方法和材料可用于实施本发明。实际上，本发明无论如何不限制于所描述的方法和材料。
1.生物液体中表达的蛋白质和多肽的鉴定按照本发明，可以用各种本领域已知的方法来进行生物液体的蛋白质组分析。
通常，比较不同来源的样本的蛋白质图谱(蛋白质组图谱)，这些来源例如正常的生物液体(正常样本)和检测生物液体(检测样本)，检测在一种疾病中被上调或下调的蛋白质。然后，切取这些蛋白质，用于鉴定和完全表征，例如采用肽质量指纹识别和/或质谱分析和测序方法，或者正常的和/或疾病特异性的蛋白质组图谱被直接用于诊断感兴趣的疾病，或者用于证实这种疾病的存在与否。
在比较分析中，用完全相同的方式处理正常和检测样本是重要的，以恰当地呈递(represent)相对丰富的蛋白质，获得精确的结果。总蛋白质的所需量将取决于所用的分析技术，本领域技术人员容易地确定。通常通过双向凝胶电泳(2-DE)，根据pI和分子量分离存在于生物样本中蛋白质。首先用等电聚焦(一向凝胶电泳)，根据其电荷分离蛋白质。该步骤可以用例如固定的Ph梯度(IPG)条带来进行，该条带可以购买得到。第二向(dimension)是常规的SDS-PAGE分析，其中聚焦IPG条带用作样本。在进行2-DE分离后，用传统染料可视化蛋白质，例如考马斯蓝或者银染色，用已知技术和设备产生图像，例如，Bio-Rad GS800显像密度计和PDQUEST软件，它们都可以购买得到。然后，从凝胶上切取单独的斑点，脱色，进行胰蛋白酶消化。肽混合物通过质谱(MS)分析。可替代地，可以例如通过毛细管高压液相层析(HPLC)来分离肽，单独或者汇集在一起进行MS分析。
质谱分析仪由离子源、质量分析器、离子检测器和数据获取单元组成。首先，在离子源中使肽离子化。然后，在质量分析器中按照质量与电荷的比例，分离被离子化的肽，检测分离的离子。质谱分析被广泛地应用于蛋白质分析，特别是从发明了基质辅助激光吸附电离/飞行时间(MALDI-TOF)和电子喷射电离(ESI)方法以来。有多种版本的质量分析器，包括，例如MALDI-TOF和三极或四极-TOF，或偶联到ESI上的离子捕获质量分析器。因此，例如Q-Tof-2质谱仪采用一种正交(orthogonal)的时间飞行分析器，该分析器使得可以在整个质谱范围内同时检测离子。进一步的详细描述，参见例如Chemusevich等人，J.Mass Spectrom.36849-865(2001)。
如果需要，肽片段和甚至该片段所来源的蛋白质的氨基酸序列可以通过本领域已知的技术来确定，例如质谱法的某种改变形式，或者Edman降解。
2.从早期和非侵入性的诊断中获益的胎儿-母体症状a.羊膜内感染羊膜内感染(IAI)是怀孕过程中发生的羊水和子宫内容物的急性细菌感染。前瞻性研究表明，在所有分娩4％-10％中发生IAI(Newton，E.R.，Prihoda，T.J.，和Gibbs，R.S.Logistic regression analysis of riskfactors for intra-amniotic infection.Obstet.Gynecol.73571，1989；Soper，D.E.，Mayhall，C.G.，和Dalton，H.P.Risk factors for intraamniotic infectiona prospectiVe epidemicologic study.American Journal of Obstetrics andGynecology 161562，1989；和Lopez-Zeno，J.A.，Peaceman，A.M.，Adashek，J.A.和Socol，M.L.A controlled trial of a program for the active management of labor.N.Engl.J Med.326450，1992)。用于描述IAI的其他术语包括羊水感染、羊膜炎和临床绒毛膜羊膜炎。临床上，通过母体发热、子宫疼痛(uterine tenderness)、白血球增多和胎儿心动过速来诊断羊膜内感染，应当与组织学的绒毛膜羊膜炎区别开。羊膜内感染是母体和新生儿发病的重要诱因。羊膜内感染占围产期(peripartum period)发热病例的10-40％有关，与早期新生儿脓毒病和肺炎病例的20-40％有关(Newton，E.R.Chorioamnionitis and intraamnioticinfection.Clin.Obstet.Gynecol.36795，1993)。在2-6％的患有IAI的患者中发生母体细菌病，并且产后感染发病率升高。在患有IAI的患者中，功能紊乱的分娩和剖腹产的危险性也升高。Duff等人报道，在分娩发生羊膜内感染的患者中，发生75％功能紊乱的分娩和34％剖腹产(Duff，P.，Sanders，R.，和Gibbs，R.S.The course of labor in term pregnancies with chorioamnionitis.American Journal of Obstetrics and Gynecology 147391，1983)。羊膜内感染还与新生儿的发病率和死亡率相关，特别是在早产婴儿中。总之，在患有IAI母亲生出的低出生重的新生儿中，围产期死亡率增加3-4倍(Gibbs，R.S.，Castillo，M.A.，和Rodgers，P.J.Management of acute地chorioamnionitis.American Journal Of Obstetrics and Gynecology136709，1980；Gilstrap，L.C.，III，Leveno，K.J.，Cox，S.M.，Burris，J.S.，Mashburn，M.，和Rosenfeld，C.R.intrapartum treatment of acute chorioamnionitisimpacton neonatal sepsis.Am.J.Obstet.Gynecol.159579，1988)。呼吸窘迫综合症、心室内出血和新生儿脓毒病也增加Morales，W.J.The effect of chorioamnionitison the developmental outcome of preterm infants at one year.Obstetrics andGynecology 70183，1987)。最近，IAI被暗示与新生儿周室白血病(periventricular leukomalacia)和脑瘫痪(cerebralpalsy)有关；在羊膜内感染的情况下，脑白质(cerebral white matter)损伤和脑瘫痪的危险性增加9倍Bejar，R.，Wozniak，P.，Allard，M.，Benirschke，K.，Vaucher，Y.，Coen，R.，Berry，C.，Schragg，P.，Villegas，I.，和Resnik，R.Antenatal origin of neurologic damage innewborn infants.I.Preterm infants.Am.J.Obstet.Gynecol.159357，1988；Grether，J.K.和Nelson，K.B.Maternal infection and cerebral palsy in infants ofnormal birth weight.JAMA 278207，1997)。最后，在至少10％的具有完整胎膜的早产妇女中存在亚临床IAI，表明IAI是一种重要的和可预防的早熟的诱因(Romero，R.，Avila，C.，Brekus，C.A.，和Morotti，R.The role of systemic andintrauterine infection in preterm parturition.Annuals of the New York Academy ofSciences 622355，1991)。Newton的文献综述证明，41％发生率的临床IAI发生在小于27周的怀孕期，15％发生在27-37周的怀孕期，2％发生在38周或更长的怀孕期内(Newton等人，同上文)。在无任何临床的羊膜内感染信号，并具有完整胎膜的早产中，从10-20％的妇女的羊水中获得下生殖道固有的细菌(Romero等，同上文)，而在23-24周终止妊娠的早产中，多达67％妇女的羊水中获得下生殖道固有的细菌(Watts，D.H.，Krohn，M.A.，Hillier，S.L.，和Eschenbach，D.A.The association of occult amniotic fluid infection withgestational age and neonatal outcome among women in pretenn labor.ObstetGnecol 79351，1992)。大部分这种患者生产迅速，并且在许多人中产生临床上明显的IAI。这些观察结果支撑一种假设，即升高的初始亚临床的子宫内感染领先于早产，是过早分娩(preterm deliverries)的重要诱因。
b.先兆子痫先兆子痫被定义为伴随蛋白尿、浮肿或者两者的母体高血压，在7％怀孕者中发生，并且在妊娠前3个月不会终结。虽然不知晓其诱因，但是更常见于分娩后期(extremes of age in childbearing)、母体糖尿病、具有多胎怀孕(multiple gestations)和预先存在的母体肾脏疾病和高血压的怀孕中。先兆子痫与围产期死亡率相关，会引起惊厥，特征在于母体癫痫和母体死亡率升高。目前先兆子痫的最主要治疗方法是进行引产和用硫酸镁抗惊厥预防。在使用硫酸镁治疗之前，观察到的母体死亡率为20-30％。但是，及时诊断使得可以用硫酸镁、进行抗惊厥治疗，抗高血压和引产，母体死亡率降低到接近零。
不幸的是，基于通常公认的症状和征兆的先兆子痫的诊断往往是困难的，并且发生疾病的后期。通常，胎儿的生长或健康状况受到威胁是首个被公认的先兆子痫的表现。先兆子痫的实验室标记包括定量蛋白尿，尿酸和肌氨酸酐的血清浓度升高。对于早期的先兆子痫，目前还没有可获得的血清标记，也没有获得鉴定将会发生先兆子痫的妇女的标记。最近，一项研究证明，包括leptin和尿酸的预计的血清标记与随后发生的先兆子痫相关(Gursoy T，等人.Preeclampsia disrupts the normal physiology of leptin.Am JPerinatol.19(6)303-10，2002)。但是，需要更多的工作来验证这些发现。需要开发用以先兆子痫的早期和可靠的标记来允许进行治疗和介入以优化新生儿和母亲的结果。
c.早产和分娩早产被定义为第37个完全怀孕周之前的生产。在美国，早产发生率占所有成活生产的10-11％，尽管对早产进行侵入性处理，该比例在升高。一般地，早熟及其结果导致早产80％的围产期死亡，而不是由于先天性畸形，每年增加约50亿美元的国家卫生保健预算。早产的危险因素包括非白种种族(non-white race)、年龄小、低社会经济状况、母体体重小于55kg、未产妇女、前3个月出血、多胎妊娠(Meis PJ，Michielutte R，Peters TJ，等人.Factorsassociated with preterm birth inCardiff，WalesII.Indicated andspontaneouspretenn birth.Am J Obstet Gynecol 173597-602，1995)。
不幸的是，对处于自然早产危险中的患者的预报通常是令人失望的(Creasy RK，Iams JD.Preterm labor and delivery.In Maternal-Fetal Medicine，Creasy RK，Resnik R(编辑)。W.B.Saunders Company，Philadelphia，PA4thedition，1999.Pages 498-531)。定义处于极度早产危险中并将可能从早期干涉中获益的群体的先前尝试包括风险评分指数、生物化学检测子宫颈的胎儿纤连蛋白、超声波测量子宫颈长度、和家族的子宫活动监控。这些程序花费昂贵，并且受到不能精确地预测的妨碍，妨碍患者可以从早期干涉或预防中获益。所有人都受到约30％的低阳性预测值的困扰，大部分患者被鉴定为“处于危险”的足月分娩。介入，包括药物处理来抑制子宫收缩是有效的，但是依赖于对早产的早期和可靠的诊断。因此，对于降低与早产相关的巨大开支和新生儿死亡率和发病率来说，用于鉴定处于极度早产危险中的患者的早期和可靠标记是必需的。
d.染色体非整倍性染色体非整倍性是围产期发病率和死亡率的频繁诱因。在200名活出生儿中，染色体非整倍性的发生率为1。这种畸形的重要原因是染色体非整倍性，从双亲遗传得到异常数量的染色体。最常见的染色体非整倍性之一是三体性-21(Down综合症)，在800名活出生儿中有1名患有该病(Hook EB，Hamerton JLThe frequency of chromosome abnormalities detected inconsecutive newborn studiesDifferences between studiesResults by sex and byseverity of phenotypic involvement.In Hook EB，Porter IH(编辑)PopulationCytogenetics，63-79.纽约，Academic Press，1978)。三体性-21的最主要危险因素是母体年龄超过35岁，但是80％患有三体性-21的儿童是由年龄小于35岁的妇女生育的。其他常见的非整倍性症状包括三体性13和18、Turner综合症和Klinefelter综合症。
由于80％患有三体性-21的儿童是由年龄小于35岁的妇女生育的，单独采用基于母体年龄设计的出生前诊断筛选程序是无效的。因此，出生前筛选程序应补充母体血清筛选与胎儿染色体非整倍性相关的分析物，超声波或者两者的结合。被广泛使用的候选血清标记包括α-胎蛋白(AFP)，未被偶联的雌激素三醇，人绒毛膜促性腺激素(choriogonadotrophic hormone)(hHCG)，和抑制素-A。但是，仅有2-5％的阳性筛选率，三体性-21和其他非整倍性的检测率是令人失望的，检测率仅为70-86％(Cuckle H.Biochemicalscreening for Down syndrome.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol.92(1)97-101，2000)。此外，真阳性检测率，即在阳性检测中的三体性-21仅为1-2％，产生了超过98％的假阳性比例。
在母体血清筛选和超声波后对染色体非整倍性的确定诊断需要中间3个月遗传羊水诊断。这种侵入性的操作与0.5％的妊娠丢失危险相关。此外，羊水细胞的染色体分析是一个劳动强度大而且费时的方法，需要2周时间。因此，需要可靠的检测来提高从母体血清中检测染色体非整倍性，降低难以接受的母体筛选的高假阳性，并且提高从羊水诊断后的羊水进行诊断的速度和效率。
3.用生物液体的蛋白质组图谱诊断母体/胎儿症状本发明提供用于通过蛋白质组分析生物液体，诊断前述的和其他类似母体/胎儿症状的早期、可靠和非侵入性的方法，生物液体例如羊水、血清、血浆、尿液、脑脊髓、乳汁、粘液或唾液。
如前面指出，在本发明的内容中，所用的术语“蛋白质组图谱”是指在特定时间，生物样本如生物液体中的大量蛋白质的表达图谱的表示特征。蛋白质组图谱可以例如被表示为质谱，但是还包括基于蛋白质的任何物理化学或生物化学特征的其他表示方法。虽然，有可能鉴定和测序在生物液体的蛋白质组的蛋白质的全部或一些，但是对于按照本发明产生的蛋白质组图谱的诊断用途来说是不必要的。当存在将要被诊断的疾病或病理性的症状时，特定疾病的诊断可以基于正常的蛋白质组图谱和从某些条件下获得的同样的生物液体的蛋白质组图谱之间的特征性差异(独特的表达特征)。独特的表达特征可以是存在于检测或参考生物样本的蛋白质组图谱中的任何独特的特征或基序，其在统计学上显著区别于从相同类型来源获得的相应正常生物样本的蛋白质组图谱。例如，如果蛋白质组图谱以质谱的方式表示，独特的表达特征通常是峰值或者多个峰值的组合，在数量和质量上区别于相应的正常样本的质谱。因此，质谱中出现新峰值或者新峰值的组合，或者质谱中所存在的峰值或者所存在的峰值的组合的振幅或形状的统计学上的显著改变，被认为是独特的表达特征。当将从哺乳动物受试者获得的检测样本的蛋白质组图谱与包含病理性的母体或胎儿症状的独特表达特征的参比样本的蛋白质组图谱相比时，如果哺乳动物与参比样本共有独特的表达特征，则被诊断为患有这种病理性的病症。
可以通过将从将被诊断的受试者获得的生物液体的蛋白质组图谱与相同种类的并用相同方式获得和处理的正常生物液体的蛋白质组图谱比较，诊断特定的病理性的母体/胎儿症状。如果检测样本的蛋白质组图谱与正常样本的蛋白质组图谱基本上相同，该受试者被认为未患有病理性的母体/胎儿症状。如果检测样本的蛋白质组图谱相对于正常样本的蛋白质组图谱，具有独特的表达特征，该受试者被诊断为患有所检测的母体/胎儿病症。
可替代地或另外地，将检测样本的蛋白质组图谱与参比样本的蛋白质组图谱比较，该参比样本从被独立地诊断为患有所检测的病理性母体/胎儿症状的受试者的生物液体中获得。在这种情况下，如果检测样本与参比样本的蛋白质组图谱共有至少一种特征或者表示独特表达特征的组合，则受试者被诊断为患有病理性的症状。
在本发明的方法中，正常生物样本的蛋白质组图谱具有重要的诊断作用，如上所讨论，如果检查样本的蛋白质组图谱与正常生物样本的蛋白质组图谱实质上相同，该患者被诊断为未患有被鉴定的病理性的母体/胎儿症状。这种“阴性”诊断具有重要意义，其去除了对患者进行不必要的治疗和干涉，这种治疗或干涉可能具有潜在的副作用，或对患者、胎儿或新生儿造成危险。分析数据，确定差别是否具有统计学显著性。
在分析前，用常规的蛋白质分离方法，去除以实质上相同表达水平存在于正常的和患病蛋白质组组中的蛋白质(共同蛋白质，例如白蛋白和免疫球蛋白)，可以提高本发明的诊断方法的灵敏度。不是独特的表达特征部分的这种共同蛋白去除会导致灵敏度和诊断精确度提高。可替代地或另外地，在计算分析结果的过程中，可以消除共同蛋白的表达特征(或者去除信号)，通常采用光谱选择算法，其是机械引导的(machice oriented)以产生诊断呼叫。在下面实施例中详细描述的结果提供特征为羊膜内感染(IAI)的蛋白质组图谱，统计学上显著地区别于正常的羊水蛋白质组图谱。此外，实施例分别提供了特征为IAI和Down综合症的表达标记和独特的表达特征。
比较蛋白质组图谱的统计学方法在本领域是公知的。例如，在为质谱的情形下，蛋白质组图谱被定义为光谱水平轴上的关键质量/电荷(M/Z)位置上的峰值振幅值。因此，特征性蛋白质组图谱可以用由给定M/Z值上的光谱振幅的组合形成的模式来表征。通过用合适的算法，比较检测样本的蛋白质组图谱(模式)与参比或正常样本的蛋白质组图谱(模式)，确定特征性表达特征存在与否或者两种图谱是否基本上相同。公开了用于分析蛋白质组图谱的统计学方法，例如在Petricoin III，等，The Lancet 359572-77(2002).；Issaq等人，Biochezn BiophysCommun 292587-92(2002)；Ball等人，Bioinformatics 18395-404(2002)；和Li等人，Clinical Chemistry Journal，481296-1304(2002)中。
在特定实施方案中，将从患者获得的样本应用于蛋白质芯片，通过质谱分析生成蛋白质图谱。如上所述，用合适的生物信息软件分析光谱中的峰值的图谱。
4.筛选分析本发明的蛋白质组图谱可进一步用于筛选分析，鉴定用于治疗特定的母体/胎儿症状的药物候选。这种筛选分析是基于检测分子将含有特征为将被治疗的母体/胎儿症状的表达特征的蛋白质组图谱转化为缺乏该表达特征的蛋白质组图谱的能力。在一特定实施方案中，检测测试化合物将病理性的表达图谱转化为正常的表达图谱的能力。在另一个实施方案中，筛选分析检测测试化合物将特征为病理性的症状的独特表达特征转化为相应的正常表达特征的能力。
可以通过处理患病生物样本，并比较处理前后的蛋白质组表达图谱，体外进行这种筛选分析。可替代地或另外地，可以通过用测试化合物处理具有靶病理性母体/胎儿症状的实验动物，在处理前后获取该动物的生物液体的样本，比较两种样本的蛋白质组图谱，进行药物筛选。在该分析中，还有可能在处理后的不同时间点上获取生物液体样本，跟踪处理的时程(follow the time course of treatment)。还可以用这些方法学类表征药物试剂的毒性，以及用于鉴定特定治疗方法的最佳候选。
测试化合物可以是例如肽、非肽的有机小分子、蛋白质、多肽、抗体(包括抗体片段)、反义分子、寡核苷酸decoy和先前被用作药物或药物候选的任何其他类型的分子。
生物液体可以是例如羊水、血清(如母体血清)、血浆、尿液、脑脊髓、乳汁、粘液或唾液。
可以将所鉴定的治疗活性化合物配制在常规的药物制剂中。本领域知晓的制剂纲要可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，最新版，MackPublishing Company，Easton，PA.参考该手册是本领域的常规技术。
5.蛋白质和抗体阵列上面讨论的诊断和筛选分析都可以采用蛋白质阵列来进行。近年来，蛋白质阵列被公认是检测蛋白质、监控蛋白质表达水平和研究蛋白质相互作用和功能的有力手段。采用自动化手段，可以同时进行大量检测，进行高通量的蛋白质分析。在最早开发用于DNA阵列的微阵列或芯片形式中，可以用最少材料进行这种检测，而获得大量数据。
虽然，如上所述通过2D凝胶电泳和质谱进行蛋白质组分析是非常有效的，但是并不总是产生所需的高灵敏度，并且会丢失许多以低丰度表达的蛋白质。蛋白质微阵列除了其高效率外，还提供了改进的灵敏度。
蛋白质阵列是通过将蛋白质固定在固体表面上形成的，例如玻璃、硅片、微孔板，硝化纤维，PVDF膜和微珠，用各种本领域熟知的共价和非共价的连接化学方法。固体支持物在进行偶联操作前后应当是化学稳定的，具有良好的斑点形态，显示最少的非特异结合，不在检测系统中产生背景，并且与不同检测系统相容。
总之，蛋白质微阵列采用与通常用于读取DNA阵列相同的检测方法。类似地，与用于读取DNA阵列相同的仪器被应用于蛋白质阵列。
因此，捕获阵列(例如抗体阵列)用荧光标记的来自两种不同来源的蛋白来探查，例如来自正常的或患病的生物液体。在这种情形下，读数是基于荧光信号的改变，反映目标蛋白质的表达水平的改变。可替代的读数包括，但是不限于荧光共振能量转移、表面胞质基因组共振、转动循环(rolling circle)的DNA扩增、质谱分析、共振光散射和原子场显微镜。
进一步详细描述参见，例如Zhou H，等人，Trends Biotechnol.19S34-9(2001)；Zhu等，Current Opin.Chem.Biol.540-45-(2001)；Wilson和Nock，Angew Chem Int Ed Engl 42494-500(2003)；以及Schweitzer和Kingsmore，Curr Opin Biotechnol 1314-9(2002)。生物分子阵列还被公开在美国专利6,406,921，2002年6月18日出版，其全部包括在此完全引入作为参考。
根据如下非限制性实施例，本发明的其他详细内容将是显然的。
实施例1一般操作羊膜内感染的灵长类模型该操作得到Institutional Animal Care Utilization Committee of the OregonNational Primate Research Center的许可，对人护理的指导方针如下。如先前所述(Haluska GJ，等人，Temporal changes in uterine activity and prostaglandinresponse to RU 486 in rhesus macaques in late gestation.，Arra J Obstet Gynecol1571487-95(1987)和Gravett MG，等人，An experimental model forintra-amniotic infection and preterm labor in rhesus monkeys.Am J ObstetGynecol 1711660-7(1994))，给时控(timed)妊娠的19只怀孕的恒河猴(Macaca mulatta)长期插入导管，并进行手术后的饲养。
简而言之，在妊娠的约第110天(妊娠期为167天)，使怀孕动物饲养习惯护套和拴系系统(jacket and tether system)(Ducssay CA，等人，Simplifiedvest and tether system for maintenance of chronically catheterized pregnantrhesus monkeys.Lab.Anim Sci 38343-4(1988))。在习惯该系统后，在妊娠的第119天到126天，在全身麻醉下进行子宫内手术。手术植入母体股动脉和静脉导管，胎儿动脉和静脉导管，两条开口的羊膜内压力导管，myometrial肌电电极和胎儿心电图(electrocardio graphic)电极。手术后，所有动物接受硫酸特布他林(terbutaline sulfate)(每天两次3-5小时静脉注射1mg)1-5天，以控制子宫过敏。动物还接受cefazolin(每12小时静脉内注射250mg)，至少持续到接种细菌之前的48小时。
在手术后稳定8-13天后(妊娠126-138天)，通过羊膜内接种a)106菌落形成单位(cfu)的B组链球菌(streptococcus)，III型，悬浮在生理盐水中(n＝7)，b)107cfu的Ureaplasma parvum(先前的Ureaplasma urealyticum，serovar1)悬浮在10B培养基中(n＝6)，或c)106-107cfu的Mycoplasaa hominis(n＝6)，悬浮在含有10％蔗糖和无内毒素的胎牛血清的磷酸缓冲盐水中，建立实验性羊膜内感染(IAI)。B组链球菌分离物最初从患有脑膜炎的婴儿中获得。Ureaplasma parvum来自患有绒毛膜羊膜炎和新生儿脓毒病的患者的胎盘和膜的低传代(low passaged)临床分离物。Mycoplasma hominis是患有产后子宫内肌肉炎(endomyometritis)的患者的子宫内膜分离物。
在试验阶段(每天接种前和接种后的每4-12小时)，连续从所有动物中收集羊水样本，用于定量细菌培养物，通过血球计分析白血球，和细胞因子和前列腺素浓度(先前报道的Gravett MG，等人，An experimental model forintra amniotic infection and preterm labor in rhesus monkeys.Am J ObstetGynecol 1711660-7(1994))，和用于蛋白质组分析。
从手术到分娩，连续记录胎儿心电图和子宫活动(肌电图和羊膜内压)。将子宫收缩性记录为每小时的收缩曲线的面积，表达为毫米水银时间秒/小时的每小时收缩面积(hourly contraction area)(HCA)。
感染前和此后连续地通过阴道触诊母体子宫颈。每次检查都记录一致性、消除和扩张。在分娩后，除了一只动物通过阴道生产外，所有的动物通过剖腹产，获得胎儿、蜕膜、胎盘将内膜细菌培养物，以证实发生感染，进行组织病理性研究来证明发生绒毛膜羊膜炎。
在如上进行所述羊膜内接种后，快速产生感染。子宫收缩性从基线水平的100升高到10,000mmHg x秒/小时，发生在用B组链球菌接种后的33±9小时内，在用Ureaplasma parvum接种后的43±14小时内；和在用Mycoplasma hominis接种后的62±14内。如先前报道(Gravett等人，AmJ.Obstet Gynecol 1711660-7(1994))，在所有情形下，子宫收缩引起进行性子宫颈膨胀和消退。子宫收缩性升高在促炎症细胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-8以及前列腺素E2和F2α显著增加之前。无动物表明，IAI的临床信号发生在分娩开始之前。在所有情形下，都证实了绒毛膜羊膜炎。
人类研究(妇女中的亚临床的IAI)研究群体从309位妇女中选出，如先前所述(Hitti J，等人，Amniotic fluidtumor necrosis factor-α and the risk of respiratory distress syndrome amongpreterm infants.Am J Obstet Gynecol 17750-6(1997))，她们是从1991年6月25日到1997年6月30日，在妊娠22-34周在华盛顿大学医学中心(Universityof Washington Medical Center)或西雅图的联合医院进行早产，具有完整的胎膜。所有妇女提供书面的同意意见，该研究方案得到所有参与医院的Institutional Review Boards的许可。在试验记录中，所有的参与者具有完整的胎膜。早产被定义为有规律的子宫收缩，＜10分钟的频率，具有文献记载的子宫颈变化或者子宫颈扩张＞1厘米或者消除＞50％。
亚临床IAI定义为阳性AF微生物培养物和/或AF白细胞介素-6(IL-6)浓度＞2ng/ml，绒毛膜羊膜炎的组织证据(定义为在10个不相连的视野内，每个400X视野中存在＞10多型核白血球，不存在子宫触痛或发热)。本发明人先前已经报道AF IL-6浓度＞2ng/ml占所有研究群体的75％或更高，与通过聚合酶链式反应的细菌检测相关(Hitti等人，Clin Infect Dis 241228-32(1997))。排出子宫颈扩张(dilatation)＞4厘米或者在接收时发生膜破裂的妇女。如果具有多胎妊娠、子宫颈环扎、胎盘、胎盘剥落、糖尿病、高血压和先兆子痫的妇女还满足试验标准，则被认为是符合条件的。
在超声波引导下，对所有的试验参与者进行腹部穿刺羊水(transabdominal aminocentesis)诊断，并且在登记时通过静脉穿刺收集母体静脉血。从该试验群体中，确定用于如在此报道的蛋白质组分析的亚组(表1A和B)。该亚组包括三个11位患者的组组I-患者具有上面定义的亚临床IAI的迹象；组II-随机选择的患者亚组，不具有文献记载的子宫内感染，但是发生妊娠＜34周的早产，和组III-患者未被感染，但是具有对产科(tocaytic)治疗响应的早产，患者在近足月(term)时生产(在＞35个妊娠周)。在母亲年龄、种族或生育状况(parity)没有差别(表1A和B)。但是，登记(enrollment)时，患有子宫内感染的患者具有稍微较早的妊娠年龄(gestationage)(p＝0.10)，并且与未被感染的早产患者或者足月生产(term delivery)的那些妇女相比，在显著较早的妊娠年龄生产(分别为27.3±0.9周比29.8±1.0周和37.0±0.9周，p＜0.0001)。此外，那些患有子宫内感染的患者具有较短的从登记到生产的间隔(2.1±5.6天，而其他两组分别为8.4±6.3天和46.9±5.6天，p＜0.0001)。91％患有子宫内感染的那些患者在登记后的7天内生产。将样本存储在-20℃下，直到进行分析，并且解冻不超过两次(not thawed morethan twice)。
在被感染的11位患者中，从4位收集到微生物(两位具有大肠杆菌，一位具有白色假丝酵母(Candida albicans)，一位具有混合的厌氧性生物)；所有这些患者在7天之内生产。7位其他患者根据羊水IL-6浓度超过2,000pg/ml来确定。在这些患者中，平均的白细胞介素-6的羊水浓度为27.7±7.8ng/ml，而未被感染的早产患者中为0.68±0.20ng/ml，在早产和足月生产的那些妇女中为0.25±0.13ng/ml(p＜0.01)。
表1A.试验群体的特征
数据表示为平均标准方差。通过ANOVA分析连续数据，用卡方(chi-square)检验分析分类数据。缩写PMD，早产＜35周；IUI，子宫内感染；PML，未生产的早产(premature labor without delivery)。
表1B.筛选结果
*该集合中的两个阳性样本表示亚临床感染，这两位受试者的AF具有低的细菌含量，通过PCR操作证明是阳性的。这表明绘制蛋白质图谱可被用于鉴定亚临床的羊膜内感染。
在前面的表格中，数据被表示为平均标准方差。通过ANOVA分析连续数据，用卡方检验分析分类数据。缩写PMD，早产＜35周；IUI，子宫内感染；PML，未生产的早产。
表1C.筛选检测结果的Fisher检验显著值
11位患有隐秘(occult)的IAI患者中的四位中获得微生物(两位具有大肠杆菌，一位具有白色假丝酵母，一位具有混合的厌氧性生物)。其他七位感染的患者根据显著升高的AF IL-6浓度＞2ng/ml而确定。在这些患者中，IL-6的平均AF浓度为27.7±7.8ng/ml，而那些未被感染的早产妇女的浓度为0.68±0.20ng/ml，而在具有早期收缩(preterm contraction)但是足月生产的组III的妇女中的浓度为0.25±0.13ng/ml(p＜0.01)。
羊水的蛋白质组分析通过LC-MS/MS分析进行蛋白质鉴定将100μg来自对照和感染样本的羊水用吲哚乙酰胺(iodoacetamide)还原，并溶解在15％SDS-PAGE凝胶中。在80V下进行电泳，将样本中的蛋白质分开。电泳后，用考马斯蓝R-250染色凝胶，用Bio-Rad GS800显像密度计和PDQUEST软件来采集图像。从凝胶上切取各个泳道的明显条带，脱色，采用Courchesne和Patterson的方法(Methods Mol Biol 112487-511(1999))，在37℃下，用胰蛋白酶消化凝胶24-48小时。用0.1％TFA提取肽，在speedvac中干燥。将提取物溶解在0.1％TFA中，用Millipore的ZipTipc18移液管尖头(Marvin L.，等人，Identification of proteins from one-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis usingelectrospray quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry.RapidCommun Mass Spectrom.14(14)1287-92，2000)，使用连接到CapLC(Waters，Inc)上的Q-Tof-2质谱分析仪(Micromass，UK)和/或在连接到110Capillary LC System(Agilent Technologies，Foster City，CA)上的离子阱(iontrap)(LGQ，ThermoFinnigan，San Jose，CA)进行纯化。
2-维(2-D)凝胶电泳将去除或未去除白蛋白的羊水(400-2000μg)溶解在IEF缓冲液中，室温下，再水合到24cm IPG条带(pH3-10)上12小时。再水合后，IPG条带在70-90kVhrs下进行1-D电泳。然后在进行第二向SDS-PAGE分析之前，IPG条带用DTT平衡缓冲液I和IAA平衡缓冲液II连续地平衡15分钟。然后将IPG条带加载到4-20％SDS-PAGE凝胶上，在120V下进行电泳12小时，将蛋白质溶解在第二向(dimension)中。用考马斯蓝R-250染色，用Bio-RadGS800显像密度计(densitometer)和PDQUEST软件获取图像。从凝胶上切取单一的斑点，脱色，37℃下，在凝胶内用胰蛋白酶消化24-48小时。用0.1％TFA提取肽，并用Millipore的ZipTipc18移液管尖头(2-D Proteome analysisprotocolsMethods in Molecular Biology112，1999)进行纯化。
HPLC分离(fractionation)在去除白蛋白和IgG(1-15mg蛋白)后，将人的羊水样本溶解在20mMTris-HCI，pH 7.5中。用装载在制备了自动取样器和UV吸收(absorbance)探测器的Waters 1525HPLC中的TSK凝胶DEAE-5PW柱进行阴离子交换层析。用线性的盐洗脱梯度来分离蛋白质。以1分钟的间隔收集级分。汇集级分，用胰蛋白酶消化，用质谱仪(Q-Tof-2)分析肽混合物。
质谱分析(1)Q-Tof-2在凝胶内消化后，在连接到Micromass CapLC上的Micromass Q-Tof-2质谱仪中分析样本。Q-Tof-2装备了常规的Z-喷雾或nanospray源，并且连接到Integrafrit C 18 75um ID×15cm融合硅毛细管柱上。该仪器由安装了Windows NT和MassLynx 3.5软件的Compaq工作站控制，并获取数据。Q-Tof-2用Glul血纤维蛋白肽(Fibrinopeptide)B校准，该肽直接灌注或注射到CapLC中。用MS/MSMS测量方法来获取MS/MSMS光谱。扫描质量(mass)400-1500，用于MS测量，扫描质量50-1900用于MSMS。在安装了Windows 2000和SEQUEST(版本1.3)和/或LUTEFISK的PC上进行原始数据分析。生成峰值列表，用内置的自动功能来进行峰值抓取(peak-picking)，并对各个峰值进行质心拟合(centroid fitting)。
(2)LCQ-MS切取来自干燥的考马斯蓝染色的凝胶的蛋白质斑点，在0.5ml的20mM碳酸氢铵、50％乙腈溶液中再水合/洗涤30分钟。然后通过真空离心干燥凝胶区域，然后通过在20nM顺序梯度的改进胰蛋白酶中再水合，进行原位消化(ProMega，Madison，WI，USA)，采用Courchesne和Patterson.Identificationof proteins by matrix-assisted laser desorption/ionization masses，MethodsMol.Biol.112487-511(1999)的方法。然后通过真空离心浓缩胰蛋白酶消化物，通过反向层析进行分离，并通过型号LCQ离子阱质谱仪(ThermoFinnigan，San Jose，CA)分析肽。用ZorbaxC-18 0.5mm×150mm微孔柱分离样本，用1100 Capillary LC System(Agilent Technologies，Foster City，CA)，采用10μLmin-1流速，和浓度梯度为0-40％B(溶于水的75％乙腈)进行1小时以上。将肽直接导入标准的ThermoFinnigan电子喷射源中。用标准的LCQ软件，以自动方式获取MS/MS光谱，然后进一步用SEQUEST(ThermoFinnigan)分析。对于进一步的详细描述参见，Courchesne，P.L.和Patterson，S.D.，同上文。
数据分析(1)Sequest和DTASelect如Yates等人，Methods Mol.Biol.112553-69(1999)所描述，用SEQUEST软件(ThermoFinnigan)对串联质谱(MS/MS)进行自动分析。SEQUEST将连续串联质谱与数据库肽序列匹配。利用组合的非冗余(non-redundant)的蛋白质序列的数据库，用默认参数进行检索，该数据库从Protein InformationResource(发布日期)和SwissProt(发布日期(release date))获得。用XcaliburDatabase Manager(ThermoFinnigan)构建数据库。S-羧基酰胺化半胱氨酸是仅被考虑的改变。
用DTASelect(The Scripps Research Institute，Tabb，2002)进一步分析Sequest结果。DTASelect组织并过滤SEQUEST的鉴定结果。使用默认参数，除了如下1)排除在蛋白质描述中包括一串“角蛋白(keratin)”的任何数据库匹配(matches)和2)对于双倍带电(doubly charged)离子，来自LCQ质谱仪的光谱用2.4的交叉相关截取值(cross correlation score cut-off)过滤。对各个光谱和通过DTASelect选择的序列对进行眼测(visually inspected)，将最终结果输入到电子数据表(Microsoft Excel)或者数据库(Microsoft Access)中，进行处理。
进一步详细描述，还可以参见Tabb DL，等人，DTASelect and ContrastTools for Assembling and Comparing Protein Identifications from ShotgunProteomics.J.Proteome Res.121-26(2002)。
(2)Lutefisk
用计算机程序Lutefisk 1900v1.2.5(Taylor JA，Johnson RS.Implementationand uses of automated de novo peptide sequencing by tandem mass spectrometry.Anal Chem 73(11)2594-604(2001)，对所有光谱进行自动重新测序。Lutefisk生成光谱的肽序列，其一些被充分地描述，用于基于同源性的序列检索。考虑修饰、丙烯酰胺、氨基甲酰胺甲基化和磷酸化。
MALDI检测操作和参数在客户定制的时间飞行发射质谱仪上(Jensen ON，等人，Directobservationof UV-crosslinked protein-nucleic acid complexes by matrix-assistedlaser desorption ionization mass spectrometry.Rapid Commun Mass Spectrom7(6)496-501(1993))进行MALDI质谱分析，该质谱仪装备了两阶段延时提取源(two-stage delayed extraction source)。将约1μL的样本溶液与1μL SA混合(溶解在最终浓度为60∶40水/乙腈0.1％TFA的芥子酸)。将1.0μL的这种分析物/基质溶液液滴沉淀到预结晶样本探针上，在空气中干燥。通过用(355nm)Nd:YAG激光(Spectra Physics)照射样本，并在23kV下以700ns/l.OkV延迟(delay)操作离子源，制备质谱。每个质谱记录为20个连续光谱的总和，每个光谱通过单个光子脉冲来制备。来自添加标准物的离子用于质量校准。
羊水的SELDI分析将来自羊水样本的总共0.5-3.0μg蛋白质点样到常相NP20(SiO2表面)、反相H4(疏水表面C-16(长链脂肪族)，或固定的镍(IMAC)SELDIProteinChip芯片(Ciphergen Biosystems，Inc.Fremont，CA)上。在室温下温育1小时，用5μl水洗涤NP1和H4芯片，去除未被结合的蛋白质和干扰物质(即缓冲液、盐、去垢剂)。在空气中干燥2-3分钟后，加入两份0.5μl的溶于50％乙腈(v/v)，0.5％三氟乙酸(v/v)中的饱和芥子酸溶液，在CiphergenProtein Biology System II(PBSII)中，用时间飞行质谱仪进行质量分析，Issaq，J.H等人The SELDI-TOF MS Approach to proteomicsProtein Profilingand Biomarker Identification.Biochem Biophys Res Commun.5；292(3)587-92，2000。
多克隆抗体和Western免疫印迹用来自相应蛋白质的免疫原性肽生成兔多克隆抗体(DSL Laboratories，Webster，TX)。然后用亲合纯化的抗体进行Western印迹。将100μg的AF蛋白质溶解在4-20％SDS-PAGE中，并转移到PVDF膜上。对于母体血清，将300μg蛋白质用于免疫沉淀，使用IGFBP1单克隆抗体(DSLLaboratories)，并对产物进行western印迹。对于检测母体血清中的钙粒蛋白B，将150μg的去除白蛋白的母体血清用于western印迹。用溶于PBST中的5％脱脂奶，在室温下封闭膜45分钟，并用1μg/ml第一抗体(IGFBP-1，azurocidin，维生素D结合蛋白和钙粒蛋白-B，来自DSLhic.，Santa Cruz，CA)在4℃下温育过夜。在用TBST洗涤三次后，膜用IgG-HRP第二抗体(Sigma)温育，并用增强化学发光可视化。
实施例2在羊水中表达的蛋白质和多肽的鉴定使用实施例1中所述的材料与方法，鉴定在正常的和被感染的羊水中所表达的蛋白质和多肽。对人和灵长类羊水样本(汇集的和单独的)进行如实施例1所述的蛋白质分离(1-D，2-D和HPLC分离)。被分开的蛋白质(凝胶条带、斑点和级分)用胰蛋白酶消化，生成肽集合(pool)。用串联MS分析肽集合，以分析它们的氨基酸序列和组成。
采用光谱验证(verification)程序，选择5000种MS光谱。用重新测序程序(Lutefisk，Peaks)，分析这些光谱文件，生成对应于各肽的氨基酸序列。从肽集合中生成的新(de novo)序列用于检索实施例1所述的蛋白质和DNA数据库。
采用同源性作图和序列验证，发现在羊水中表达各种蛋白质。根据已知的结构相似性(序列同源性作图)分析被检测的蛋白质的潜在功能。发现属于与大量疾病有关的重要功能种类的蛋白质。在人羊水中首次发现的蛋白质和多肽列举在下文表2的这些潜在的功能分类中。
分别地标记免疫测定所证实的被差别性地表达的蛋白质以及在被感染羊水中更为广泛或者独特地出现的蛋白质。在本文中，相对丰度被定义为代表测试样本中的特定多肽或蛋白质的肽的量，相对于参比样本。因此，如果在被感染的羊水在出现比未被感染的参比羊水样本中更多来源于相同蛋白的肽，则该蛋白质更加丰富地被呈递在被感染的羊水中。
表3列举已知存在于羊水中的蛋白质和多肽，它们的存在通过本发明的分析再次确定。作为与感染相关的事件的已知标记的蛋白质被分别地标记。
表2.在人的羊水中首次发现的蛋白质和多肽。
*免疫分析中证明被差别性地表达的蛋白质#在被感染的羊水中，更加丰富或独特地检测到的代表这些蛋白的肽。
表3.先前已知存在于羊水中的蛋白质和多肽，用重新测序鉴定。
*感染相关事件的已知标记。
在羊水中首次发现的其他蛋白质被提供在如下的表4中。
表4
IPI＝国际蛋白质索引(index)
子宫内病征的诊断标记在上面的表格中列举的蛋白质是用于检测和监控子宫内病征的有前景候选物。一些这种症状和相应的蛋白质标记将在下文中详细讨论。
肌动蛋白调节的和相关的蛋白作为发育缺陷的标记膜突蛋白(膜组织伸展刺突蛋白)，列举在表2的结构蛋白中，已知其负责将跨膜蛋白连接到肌动蛋白细胞骨架上，与各种细胞信号路径相关(Speck O，等人Moesin functions antagonistically to the Rho pathway to maintainepithelial integrity.Nature 2；421(6918)83-7，2003)。已经显示，Rho家族的GTP酶及其效应子调节肌动蛋白修饰分子的活性，例如丝切蛋白(cofilin)和抑制蛋白(也作为结构蛋白列举在表2中)，引起与生长锥延伸或者收缩相关的细胞骨架的变化(Tang BL.Inhibitors of neuronal regenerationmediatorsand signaling mechanisms.Neurochem Int，42(3)189-203，2003)。冠蛋白样蛋白p57(另一种列举在表2中的结构蛋白)也与肌动蛋白的交联和加帽有关(Weitzdoerfer R等人Reduction of actin-related protein complex 2/3 in fetalDown syndrom.Biochem Biophys res Commun.293836，2002)，并且在已知的发育缺陷是失调。凝溶胶蛋白(参见，列举在表2中的转运蛋白/结合蛋白的凝溶胶蛋白前体)，另一种肌动蛋白调节蛋白也在发育上被调控，而且在器官系统中是重要的(Arai M，Kwiatkowski DJ.Differential developmentallyregulated expression of gelsolin family members in the mouse.DevDyn，215，297，1999)。已知14-3-3蛋白是上皮标记，其参与信号转换和分化路径，对于大脑和其他重要器官的发育是关键的(Wu C，Muslin AJ.Role of14-3-3proteins in early Xenopus development.Mech Dev，119，45，2002)。
因此，所列举的肌动蛋白调节蛋白和其他相关分子在发育过程中具有重要作用，它们首次在人羊水中鉴定，可用于检测各种器官系统的发育缺陷，例如中枢神经系统心血管系统和其他的肌肉骨骼畸形，它们可能是由例如染色体非整倍性造成。这对Profiling I来说，尤其如此，已经证明Profiling I在被感染的羊水中差别性地表达，并且这种差别性表达已经通过免疫分析证实。
感染和免疫反应相关异常的标记本发明检测巨噬细胞加帽蛋白，白血球弹性蛋白酶，嗜中性粒细胞明胶酶(gelatenase)相关lipocalicn，myleoperoxidase，L-网素(淋巴细胞胞质蛋白)和钙粒蛋白(参见表2中的免疫反应相关基因的目录)，感染的羊水是这些蛋白在羊膜内感染时存在与调控的首个证明。这些蛋白质的数种是对感染、炎症和应激响应的免疫细胞的已知应答者。巨噬细胞加帽蛋白(MCP)是Ca(2+)敏感性蛋白，其调节肌动蛋白丝，参与炎症过程(Dabiri GA，Molecular cloning of human macrophage capping protein cDNA.A uniquemember of the gelsolin/villin family expressed primarily in macrophages J BiolChem 15；267(23)16545-52，1992)。类似地，钙粒蛋白是钙结合蛋白，已知在损伤和伤口愈合中起作用(Thorey IS.等人，The Ca2+-binding proteinsS100A8and S100A9 are encoded by novel injury-regulated genes.J Biol Chem21；276(38)35818-25，2001)。白血球弹性蛋白酶和嗜中性白细胞明胶酶相关lipocalcin(NGAL)与细菌抑制和细菌溶解机制相关(Goetz DH.等人.Theneutrophil lipocalin NGAL is a bacteriostatic agent that interferes withsiderophore-mediated iron acquisition.Mol Cell 10(5)1033-43，2002)。
除了上面的免疫调节物，本发明人还首次在被感染的羊水中发现两种抗菌蛋白Fall-39和azurocidin。抗菌蛋白Fall-39(LL-37)结合到细菌的脂多糖(lps)上，在骨髓、睾丸和嗜中性粒细胞中表达。Fall-39刺激肥大细胞脱粒，是肥大细胞的潜在趋化因子。除了抗菌活性外，Fall-39潜在地能够将肥大细胞补充到炎症病灶上。在存在基础培养基E时，合成的FALL-39抵抗大肠杆菌D21和Bacillus megaterium Bmll的活性很高。已经有人提出了Fall 39的保护作用，当皮肤屏障的完整性被破坏时，其参与第一道防线，防止局部感染和系统性细菌侵入(Agerberth B，等人FALL-39，a putativehuman peptide antibiotic，is cysteine-free and expressed in bone marrow andtestis.Proc Natl Acad Sci U S A，3；92(1)195-9，1995)。
Azurocidin(CAP37)是一种阳离子抗菌蛋白，从人的嗜中性粒细胞中分离得到，与宿主防御和发炎十分相关。Azurocidin在炎症过程中被释放，调节单核细胞/巨噬细胞功能，例如化学趋向性，提高存活，和分化(PereiraHA.CAP37，a neutrophil-deriVed multifunctional inflammatory mediator.JLeukoc Biol；57(6)805-12，1995)。
蛋白酶和蛋白酶抑制剂在蛋白调节中起重要作用，从而控制多个关键的生理学机制。本发明人已经首次确定，在人的羊水中，包含羊膜内感染，表达蛋白酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)家族(Serpin，鳞片状上皮细胞癌抗原1&2，神经胶质来源的连接蛋白)。丝氨酸蛋白酶抑制剂的serpin超家族在控制许多生物学路径中的蛋白酶中起重要作用，与构象疾病相关，例如淀粉样变性病(amyloidoses)、朊病毒脑病和享廷顿病(Huntington)和阿茨海默氏病(Alzheimer disease)(Lomas DA，Carrell RW，Serpinopathies and theconformational dementias.Nat Rev Genet；3759，2002)。
另外，在羊膜内感染中，本发明人确定的半胱氨酸蛋白酶抑制剂的表达，半胱氨酸蛋白酶抑制剂是公知的蛋白酶抑制剂，其参与免疫调节(Vray B，Hartmann S，Hoebeke J.Immunomodulatory properties of cystatins.Cell MolLife Sci；59(9)1503-12，2002)。
所列举的蛋白质是感染和/或免疫反应相关异常的有前景的标记。
值得注意的是，相对于正常的羊水，在被感染的羊水中更加丰富或独特地检测到肽呈递(representing)巨噬细胞加帽蛋白，嗜中性白细胞明胶酶相关lipocalin，髓过氧化物酶前体，L-网素，azurocidin，抗菌蛋白Fall-39，钙粒蛋白A，抑制蛋白I，神经胶质来源的连接蛋白，serpinI2，和半胱氨酸蛋白酶抑制剂A，和/或在免疫测定中显示出差别性的表达。
因此，这些蛋白特别重要地作为羊膜内感染和/或免疫反应相关异常的标记。
在人的羊水检测到的其他疾病(感染)特异蛋白在人的被感染羊水中检测到列举在表2中的Gp-340变体蛋白，该蛋白是一种先前在肺部鉴定的清除剂(scavenger)的受体。已知这种蛋白会结合到细菌上(链球菌及其变体)。在被感染的羊水中检测到这种蛋白补充了一种本发明的灵敏的蛋白质组方法，用于鉴定IAI的生物标记。因此，在被感染的羊水中鉴定的Gp-340变体蛋白使之可用于检测新生儿脓毒病)。
IGFBP-1(蛋白质水解片段)如表2中所示，IGFBP-1被证明在被感染的羊水中差别性的表达。胰岛素样生长因子(IGF)系统与胎儿和胎盘生长密切相关，在子宫内膜中通过自分泌/旁分泌机制调节甾类激素作用。IGF-I和IGF-II刺激增殖和分化，并且在体外以多个细胞类型维持分化细胞功能。子宫内膜基质细胞生产IGF-I和IGF-II以及高亲合性的IGF-结合蛋白(IGFBPs)。六种高亲合性的IGFBP的mRNA在人的子宫内膜中表达，IGFBP调节IGF的作用。人的子宫内膜中最丰富的IGFBP是IGFBP-1，是由预蜕膜化/蜕膜化的子宫内膜基质细胞在较晚的分泌阶段和怀孕过程中分泌。这与临床产科学和妇科医学有关，有证据表明IGFBP-1在先兆子痫、子宫内生长受限、多囊性卵巢综合症以及滋养层和子宫内膜赘生物中具有病理生理作用。
IGFBP-1的蛋白质水解片段在人的羊水和母体血清中存在和调控，开辟一条新的用于监控与怀孕相关的子宫内的和母体的症状的途径。
对于进一步的详细描述参见，下文的实施例12。
实施例3子宫内感染后的灵长类和人的羊水的蛋白质表达模式在235激光强度下收集结合到化学确定的常相芯片阵列上的AF提取物的完整光谱SELDI-TOF MS分析结果，显示在被感染的和未被感染的灵长类和人AF之间，在3-5kDa和11-12kDa区域存在数个峰值强度差异。
子宫内感染后的灵长类羊水的蛋白质表达图谱与相应的正常表达图谱比较，显示在附图1A-C中。如附图1A-C中所阐明，对照和被感染的羊水的完整(global)蛋白表达图谱是明显不同的。较小质量范围内的羊水图谱的详细光谱(附图1B和1C)表明，约在3-5Kda和10-12Kda的范围内，对照的和被感染的样本之间的蛋白质表达图谱具有明显和特征性的差别。这阐明了对子宫内感染反应的蛋白质表达的总体调控以及能够检测诊断子宫内感染的独特表达特征。
附图2显示灵长类羊水对感染反应的时程分析(GBS)。在接种细菌之前，收集羊水，并且在感染之后进行连续收集，进行如实施例1中所述的SELDI-TOF分析。附图2A显示感染前的蛋白质蛋白图谱，附图2B为感染后12小时，而附图2C为感染后36小时。
如附图2C中所示，子宫内感染的诊断性峰值(10-11KDa)在急性感染的36小时内明显达到高表达水平。这表明诊断性蛋白质图谱可用于监控疾病状态和对处理的反应。
附图3显示对结合到化学确定(chemicaily defined)的常相芯片阵列上的人羊水提取物的SELDI-TOF分析结果。附图3A显示235激光强度下的完整光谱。附图3B显示在10-12kDa区域内，被感染的和对照样本之间的差异的详细光谱。附图3显示在3-5kDa区域内，被感染的和对照样本之间的特征性差异的详细光谱。
如附图3A-C中所示，对照和被感染的羊水的完整蛋白质表达图谱是明显不同的。在较小质量范围内的羊水图谱的详细光谱(附图3B和C)表明，在对照和被感染样本之间，过度表达的蛋白质(3-5Kda和10-12Kda范围)明显不同。对蛋白峰值相对强度的分析表明，存在两个明显不同的诊断簇(10-12kDa和3-5kDa范围)。这阐明了对子宫内感染反应的蛋白质表达的总体调控以及能够在人和灵长类模型中检测诊断子宫内感染的独特表达特征。
值得注意的是，人羊水的诊断图谱与灵长类羊水的诊断图谱十分一致(实施例3和4)。
实施例4使用不同的质谱仪生成诊断性的图谱用不同类型的质谱仪检测诊断性的蛋白质蛋白图谱。已经检查不同的质谱仪是否生成类似的诊断图谱。如果诊断性图谱基本上不依赖于质谱仪的类型，在羊水中检测到的差别性蛋白表达给子宫内感染提供诊断性的特征。
附图4显示在普通MALDI-TOF质谱仪上获得的质量光谱(Jensen ON，等人，Direct observation of W-crosslinked protein-nucleic acid complexes bymatrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry.Rapid CommunMass Spectrom 7(6)496-501(1993))，使用未发生子宫内感染的人对照(A)的羊水和发生子宫内感染的样本(B)。
如附图4A和B中所示，用可替代的质谱仪，检测10-12KDa范围内的子宫内感染的诊断性图谱，其与用SELDI-TOF仪器检测的图谱类似。这表明差别性蛋白质表达图谱是恒定的(robust)，可用大量的现有质谱仪来检测。
总之，已经发现羊水蛋白质和多肽表现出诊断疾病状态的差别性表达图谱。在此提供的结果证明，可以用多种质谱分析方法检测疾病特异性图谱。在人和灵长类之间进行图谱或蛋白质表达图谱的比较。该图谱用于监控时程(感染或处理)的结果。
实施例5量化羊水中的蛋白和多肽表达，用于诊断和预后监控
SDS-PAGE用丙酮从含有高浓度盐的羊水(AF)中沉淀蛋白质。在15％SDS-PAGE上，对100μg的羊水蛋白质进行电泳。凝胶用考马斯蓝R-250染色。用Bio-Rad凝胶扫描仪扫描凝胶图像。
附图5显示A)4种人对照AF汇集样本；B)单一的对照AF样本；C)4种被感染的AF汇集样本；和D)单一的被感染的AF样本的SDS-考马斯蓝染色凝胶。
附图5显示在10-15Kda范围内，对照和被感染的蛋白质表达水平的显著差别。一般认为，用质谱仪检测的具有该质量的蛋白质和蛋白质水解片段中的一些生成反应该蛋白质表达水平的诊断性图谱，具有诊断性和预后用途。
实施例6来自子宫内感染的羊水的Western印迹分析在200V下，在4-20％SDS-PAGE上对100μg的AF蛋白电泳60分钟，转移到PVDF膜上，以90mM处理75分钟。该膜用5％奶PBST在室温下封闭45分钟，并且用1μg/ml第一抗体(Santa Cruz and Dako)在4℃下温育过夜。在用TBST洗涤3次后，该膜用第二抗体IgG-HRP(Sigma)在室温下温育90分钟，用ECL(Pierce)可视化。
结果显示在附图6中A)对照AF样本(汇集的)；B)感染的AF样本(汇集的)。附图6表明，与未被感染的AF相比，IGFBP1(11KDa)、抑制蛋白和血浆铜蓝蛋白(130KDa)在被感染的AF中高水平表达。与对照AF样本相比，被感染样本中的L-网素水平较低。用MS方法(重新测序)，还从人的被感染样本中鉴定这些蛋白，列举在上文的实施例2中。
实施例7来自子宫内感染的羊水的免疫沉淀分析将2毫克的第一抗体与600μg的AF蛋白混合，并在4℃下温育过夜。加入15μl蛋白G琼脂糖珠，室温下在摇床上温育60分钟。用IP缓冲液洗涤洗涤珠6次。
结果显示在附图7中，其中(A)显示对照羊水样本(汇集的)，(B)显示被感染的羊水样本。附图7表明，与对照羊水相比，血浆铜蓝蛋白(～130KDa)和钙粒蛋白(～16KDa)在被感染的羊水中的表达水平较高。
实施例8人的羊水和母体血清中的差别性蛋白表达的检测已经检查，在羊水中差别性地表达的蛋白质是否可用作一种引导，检测母体血清中的类似蛋白质。这使得能够开发用于诊断和监控的快速而非侵入性的检测方法。结果显示在附图8中，其中(A)显示对照羊水样本(汇集的)，(B)显示被感染的羊水样本(汇集的)。附图8表明，在对子宫内感染反应时，较小的IGFBP-1蛋白质水解片段一致地在AF和母体血清中被差别性地表达。
实施例9来自子宫内感染的羊水的蛋白微阵列分析抗体IGFBP-1(DSL)；补体C3，结蛋白(Desmin)，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，NSE抗体(DAKO)；钙粒蛋白，血浆铜蓝蛋白，TIMP-1，网素和Profiling(Santa Cruz)。
抗体打点将抗体溶解在40％甘油，60％PBS，pH 7.5中，浓度为100μg/ml，用Arrayer(Cartesian)打点到乙醛载玻片上。
室温下，在湿润的腔室中温育3小时，接着，室温下，载玻片在含有1％BSA(w/v)的PBS溶液，pH 7.5中温育1小时，轻轻搅拌。
蛋白质的生物素化将生物素-NHS以50mg/l溶解在双蒸(DD)水中。将10μl这种溶液添加到母体血清蛋白溶液(以5mg/ml溶解在10mM PB中，pH8.5)中，在摇床上温育3小时。加入5μl乙醇胺来终止反应。将生物素化的蛋白质稀释在200μl的TNB缓冲液中，并添加到抗体阵列中，在4℃下温育过夜。在TNT缓冲液中洗涤3次后，加入链霉抗生物素蛋白-HRP，在室温下温育30分钟。用Cy5-tyramide荧光检测抗原-抗体的相互作用。在PE荧光扫描仪上扫描载玻片，进行量化。用图像分析程序，将对照的和被感染的载玻片的图像重叠，生成相对丰度的伪色彩图像。该结果显示在附图9中，其是显示相应的蛋白与其抗体结合的蛋白质阵列的伪色彩(pseudocolor)图像。绿色表示被感染的样本，红色表示对照样本。部分II是放大的阵列区域，显示钙粒蛋白在被感染血清样本中的表达水平较高(绿色)。部分III是钙粒蛋白IP的western印迹，显示在被感染的羊水样本中表达水平类似地升高。
实施例10
进一步分析以被感染羊水的独特诊断特征呈现的蛋白质已经证明，对照的和被感染的羊水的SELDI-TOF图谱在10-12Kda的质量范围显示具有独特的特征(附图1，2和3)，代表阳性感染的样本。溶解在1-D凝胶中的对照和被感染的羊水(附图5)也具有质量范围为10-12Kda的条带，在汇集的或单独的被感染的羊水样本中，该条带更为丰富。如附图13中所示，分离这些1-D凝胶条带，并用LCQ-MS进行进一步分析，所鉴定的肽代表IGF-BR-1和S-100钙结合蛋白。如附图8中所示，用抗IGF-BPl抗体Western印迹分析对照和被感染的羊水，也证明了蛋白质水解片段(～11KDa)在感染中被差别性地表达。
对羊水多肽进行测序，还确定在被感染的羊水中存在IGF-BPl和钙粒蛋白(表3)。
所鉴定的新的IGFBP-1的蛋白质水解片段的序列显示在附图12中(SEQID NO1)。在该附图中，在对被感染的羊水进行1-D凝胶电泳、胰蛋白酶消化和MS/MS分析后，存在于样本“0426seq_HI_12”和“0425seq_HI-113”中的肽序列显示在小写中(lower case)(SEQ ID NOs2和3)。在对来自被感染羊水的胰蛋白酶消化的～10.5-12Kda的条带进行1-D凝胶(小分子量范围，附图5)、Western印迹(附图6)和MS/MS分析(附图13)，检测到IGF-BP-1的蛋白质水解片段，表示为下划线序列区域(SEQ ID NO4)。
实际上，MS/MS分析和序列检索结果证明显示在附图13中的质谱中的母离子(parent ion)434.89表示IGF-BP-1序列(RSPGSPEIR)，还显示在附图12的IGF-BP-1的蛋白质水解片段的序列图谱上。母离子1082.97代表S-100钙结合蛋白(即，钙粒蛋白A和B)，还通过对AF重新测序独立地鉴定(表2和3)。
附图14显示在附图13中的17.55-18.21分钟的保持时间峰值的质谱。显然，主要峰值出现在质量434.9上。附图15显示附图14中的434.9峰值的母离子的MS/MS光谱。根据数据库检索，母体离子对应于IGFBP-1的部分序列。
实施例11IAI生物标记的免疫检测为了评价在IAI中鉴定的蛋白质的差别性表达，从11-kDa SELDI-TOFMS图谱中选择两个标记(钙粒蛋白B和IGFBP-1)，在完整的(global)蛋白质表达分析中，鉴定一种免疫调节分子(azurocidin)和一种未被调节的蛋白(维生素D结合蛋白)。如附图16中所示，western印迹分析证实了所有的三种显示出差别性表达的生物标记，这与在IAI羊水中进行的蛋白质鉴定试验结果一致。
采用被开发来抵抗IGFBP-1和钙粒蛋白B的特异抗体，研究在汇集母体血清中是否能够鉴定到被差别性地表达的蛋白质，血清来自有限数量患者(n＝5)，血清是可获得的。IGFBP-1和钙粒蛋白B的11kDa蛋白质水解片段对应于11-kDa峰值，与对照羊水相比，该片段差别性地存在于被感染的羊水，在该有限分析中，在对IAI反应的母体血清中也检测到该片段(附图16d和e)。在母体血清中未检测到Azurocidin。
实施例12表征染色体非整倍性的诊断性图谱对蛋白质组作图的有效性(utility)进行检查，用母体血清筛选更加精确地鉴定三体性-21。用(对照(n＝6)，三体性-21(n＝6)和三体性-18(n＝4)的组进行该研究，充分表征的母体血清样本(相同情形下与羊水样本匹配，用标准的染色体作图方法检测，确定存在三体性)，用上述用于子宫内感染模型的SELDI-TOF方法学进行分析。
附图10显示在母体血清中的差别性的蛋白质表达图谱，具有辨别三体性的独特模式。如较早所描述，将1毫克的母体血清(在用蛋白质分离柱除去白蛋白和免疫球蛋白后，BioRad technologies)用于进行母体血清提取物的SELDI-TOF分析，该提取物结合到化学确定的常相芯片阵列上。在235的激光强度下收集的整个光谱显示出峰值强度上的差别。A)对照血清；B)三体性-21(Down′s)血清；C)三体性-18血清。详细的光谱显示在4-15Kda范围内，独特于各种情况的差别。箭头指示诊断性峰值，该峰值被组合用于表示一种算法，以开发诊断性的筛选检测。这进一步阐明，检测各种生物液体(例如母体血清)中的蛋白质表达图谱能够更加精确地和以非侵入的途径鉴定胎儿-母体症状。
在利用临床上相关的微生物的试验灵长类模型中和在感染不同微生物的妇女中，在SELDI-TOF MS中检测在发生IAI的情形下显著过度表达的11-kDa峰值，确认这种特征对由广泛的病原体引起的IAI的特异性。该过度表达的簇可能代表一种对感染的基础子宫内的免疫反应，因为该独特的簇中的一组被鉴定蛋白质，即钙粒蛋白，是S-100钙结合蛋白家族的成员，由急性发炎组织中的巨噬细胞和上皮细胞表达。来自该簇的第二种候选，IGFBP-1的特异的蛋白质水解片段，指示对感染反应的潜在蛋白酶相关机制。完整的IGFBP-1是存在于AF中的主要IGFBP，由胎膜和母体蜕膜合成。虽然，IGFBP的蛋白质水解断裂是一种被充分表征的现象(Maile等人.IGFbinding protein hydrolysis in various clinical states.InThe IGF System，InRosenfeld CR，Roberts C，Jr.，编辑.Totowa，NJHumana Press，1999)，在本研究中描述的特定片段先前未被描述。
在第二种方法中，用LC-MS/MS，对在对照和IAI的AF中表达的蛋白质进行表征，首次在IAI中鉴定了相当多的感染和免疫反应相关分子。巨噬细胞加帽蛋白(MCP)是一种Ca+2-敏感蛋白，其调节肌动蛋白丝，与炎症过程相关(Dabri等人.J Biol Chem 26716545-52(1992))。白血球弹性蛋白酶和嗜中性白细胞明胶酶相关lipocalcin(NGAL)与细菌抑制和细菌溶解机制相关(Goetz等，Mol Cell1)1033-43(2002))。
除了上面的免疫调节物外，在对感染反应时，在AF中检测到抗菌蛋白Fall-39和azurocidin，给子宫内免疫反应提供新的视角。抗菌蛋白Fall-39(LL-37)结合到细菌脂多糖上，是肥大细胞的一种潜在趋化因子，作为第一道防线，防止局部感染和系统性的细菌侵入(Agerberth等人，ProcNatlAcadsCI usa 92195-9(1995))。Azurocidin(CAP37)是一种阳离子抗菌蛋白，从人的嗜中性粒细胞分离得到，与宿主防御和感染密切相关(pEREIRA，j.IEUKOC bIOL 57805-12(1995))。Gp-340变体蛋白是先前在肺部鉴定的清除剂(scavenger)受体，结合细菌(Prakobhol等人，J Biol Chem27539860-6(2000))。这些蛋白的鉴定补充了用于鉴定IAI的生物标记的灵敏的蛋白质组方法。
目前可获得的用于确认对IAI的诊断的实验室检测包括，测量母体C-反应活性蛋白，直接检查AF中的白血球或者革兰氏染色细菌，AF微生物培养或PCR，测量AF葡萄糖和IL-6的浓度，以及检测AF白血球酯酶。仅对羊水进行细菌培养和广谱的细菌rDNA聚合酶链式反应是灵敏的和对IAI特异。但是，对生殖器支原体进行微生物培养或者基于PCR的检测并不是可以广泛获得，羊水诊断要求获得羊水。基于蛋白质组的方法的一个优点是候选的肽生物标记可以开发快速的点服务(point-of-service)和低成本(cost-effective)的诊断免疫分析方法。用其他AF和血清筛选检测进行类推(例如，用于神经管缺陷的α-胎蛋白)，在被感染的羊水中鉴定的肽也在母体血清中检测到，并且用于非侵入性的诊断检测中。在前面的实施例特别是那些利用汇集的母体血清的实施例中呈现的数据证明，这些方法的可行性，在这些方法中，IGFBP-1限制性片段和钙粒蛋白B是两种这样的生物标记，它们存在于IAI过程中的AF和母体血清中，但是在不存在感染时则不存在这种生物标记。
总之，对AF的基于蛋白质组分析被用于在实验性非人灵长类模型和一群具有早产和occult IAI的妇女中鉴定IAI的生物标记。通过SELDI-TOF MS作图鉴定诊断性的蛋白质表达图谱，在检测IAI时，该图谱是灵敏和特异的。高通量分析在AF中表达的蛋白质，首次鉴定数种免疫调控分子的表达。在诊断性11kDa峰值(IGFBP-1和钙粒蛋白B)中检测蛋白质的免疫检测证明在IAI过程中在羊水和母体血液中存在和差别性表达这些生物标记。在此呈递的数据作为用于快速和非侵入性分析的基础，以检测怀孕过程中的神秘IAI。这是一个重要突破，因为这使得临床医生和研究人员为特定研究和在治疗试验中，确定特定亚组的处于高度早产危险的妇女。最后，这些研究证明，基于蛋白质组方法用于鉴定传染性和炎症过程和怀孕的病理生理性的症状的特定生物标记和诊断性图谱的用途。因此，在此提供的数据证明，羊水以及其他生物液体如血清中的蛋白的差别性表达，提供了一种用于快速、非侵入性的和精确的诊断、预后和监控各种母体/胎儿症状和染色体非整倍性的有效方法。
在整个前述说明书中，本发明参考确定的实施方案被讨论，但是这些实施方案不是如此被限制的。实际上，除了在此给出和描述的那些，根据前面的说明，本发明的各种修改对于本领域的技术人员来说是显然的，并且落入附随的权利要求的保护范围内。
在整个说明书中引用的所有参考文献，以及其中引用的参考文献，在此全文清楚地引入作为参考。
序列表<110>普罗特奥格尼克斯公司(PROTEOGENIX，INC.)ROSENFELD，RonNAGALLA，SriGRAVETT，Mike<120>生物液体的蛋白质组分析<130>39767-0002PCT<140>Unassigned<141>Herewith<150>US 10/400,005<151>2003-03-25<160>11<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>259<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Ser Glu Val Pro Val Ala Arg Val Trp Leu Val Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Thr Val Gln Val Gly Val Thr Ala Gly Ala Pro Trp Gln Cys Ala Pro20 25 30Cys Ser Ala Glu Lys Leu Ala Leu Cys Pro Pro Val Ser Ala Ser Cys35 40 45Ser Glu Val Thr Arg Ser Ala Gly Cys Gly Cys Cys Pro Met Cys ALa50 55 60Leu Pro Leu Gly Ala Ala Cys Gly Val Ala Thr Ala Arg Cys Ala Arg65 70 75 80Gly Leu Ser Cys Arg Ala Leu Pro Gly Glu Gln Gln Pro Leu His Ala85 90 95Leu Thr Arg Gly Gln Gly Ala Cys Val Gln Glu Ser Asp Ala Ser Ala100 105 110Pro His Ala Ala Glu Ala Gly Ser Pro Glu Ser Pro Glu Ser Thr Glu115 120 125Ile Thr Glu Glu Glu Leu Leu Asp Asn Phe His Leu Met Ala Pro Ser130 135 140Glu Glu Asp His Ser Ile Leu Trp Asp Ala Ile Ser Thr Tyr Asp Gly145 150 155 160Ser Lys Ala Leu His Val Thr Asn Ile Lys Lys Trp Lys Glu Pro Cys165 170 175Arg Ile Glu Leu Tyr Arg Val Val Glu Ser Leu Ala Lys Ala Gln Glu180 185 190Thr Ser Gly Glu Glu Ile Ser Lys Phe Tyr Leu Pro Asn Cys Asn Lys195 200 205Asn Gly Phe Tyr His Ser Arg Gln Cys Glu Thr Ser Met Asp Gly Glu210 215 220Ala Gly Leu Cys Trp Cys Val Tyr Pro Trp Ash Gly Lys Arg Ile Pro225 230 235 240Gly Ser Pro Glu Ile Arg Gly Asp Pro Asn Cys Gln Ile Tyr Phe Ash245 250 255Val Gln Asn
<210>2<211>14<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Ala Leu Pro Gly Glu Gln Gln Pro Leu His Ala Leu Thr Arg1 5 10<210>3<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Arg Ile Pro Gly Ser Pro Glu Ile Arg1 5<210>4<211>94<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Ala Leu His Val Thr Asn Ile Lys Lys Trp Lys Glu Pro Cys Arg Ile1 5 10 15Glu Leu Tyr Arg Val Val Glu Ser Leu Ala Lys Ala Gln Glu Thr Ser20 25 30Gly Glu Glu Ile Ser Lys Phe Tyr Leu Pro Asn Cys Asn Lys Asn Gly35 40 45Phe Tyr His Ser Arg Gln Cys Glu Thr Ser Met Asp Gly Glu Ala Gly50 55 60Leu Cys Trp Cys Val Tyr Pro Trp Asn Gly Lys Arg Ile Pro Gly Ser65 70 75 80Pro Glu Ile Arg Gly Asp Pro Asn Cys Gln Ile Tyr Phe Asn85 90<210>5<211>139<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Ala Gly Trp Asn Ala Tyr Ile Asp Asn Leu Met Ala Asp Gly Thr Cys1 5 10 15Gln Asp Ala Ala Ile Val Gly Tyr Lys Asp Ser Pro Ser Val Trp Ala20 25 30Ala Val Pro Gly Lys Thr Phe Val Asn Ile Thr Pro Ala Glu Val Gly35 40 45Val Leu Val Gly Lys Asp Arg Ser Ser Phe Tyr Val Asn Gly Leu Thr50 55 60Leu Gly Gly Gln Lys Cys Ser Val Ile Arg Asp Ser Leu Leu Gln Asp65 70 75 80Gly Glu Phe Ser Met Asp Leu Arg Thr Lys Ser Thr Gly Gly Ala Pro85 90 95Thr Phe Asn Val Thr Val Thr Lys Thr Asp Lys Thr Leu Val Leu Leu100 105 110Met Gly Lys Glu Gly Val His Gly Gly Leu Ile Asn Lys Lys Cys Tyr
115 120 125Glu Met Ala Ser His Leu Arg Arg Ser Gln Tyr130 135<210>6<211>10<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Pro Ser Val Trp Ala Ala Ala Gly Pro Arg1 5 10<210>7<211>14<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>7Ser Thr Gly Gly Ala Pro Thr Phe Asn Val Thr Val Thr Lys1 5 10<210>8<211>16<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>8Thr Phe Val Asn Ile Thr Pro Ala Glu Val Gly Val Leu Val Gly Lys1 5 10 15<210>9<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>9Asp Ser Pro Ser Val Trp Ala Ala Val Pro Gly Lys1 5 10<210>10<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>10Asp Ser Pro Ser Val Trp Ala Ala Val Pro Gly Lys1 5 10<210>11<211>16<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>11Thr Phe Val Asn Ile Thr Pro Ala Glu Val Gly Val Leu Val Gly Lys1 5 10 1权利要求
1.用于确定母体或胎儿症状的状态的方法，包括将从哺乳动物受试者获得的生物液体的测试样本的蛋白质组图谱与正常样本的蛋白质组图谱或者参比蛋白质组图谱比较，该参比蛋白质图谱包含至少一种表征所述症状的独特表达特征和确定所述母体或胎儿症状的状态。
2.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物受试者是怀孕的雌性。
3.权利要求2的方法，其中所述怀孕雌性是人。
4.权利要求3的方法，其中所述母体症状选自羊膜内感染、先兆子痫或早产。
5.权利要求3的方法，其中所述母体症状选自染色体非整倍性、先天畸形、妊娠年龄或胎儿成熟。
6.权利要求1的方法，其中所述生物液体选自羊水、血清、血浆、尿液、脑脊髓、乳汁、粘液或唾液。
7.权利要求3的方法，其中所述生物液体是羊水或母体血清。
8.权利要求1的方法，其中测试样本的蛋白质组图谱包含至少两种蛋白质的信息。
9.权利要求1的方法，其中蛋白质组图谱是质谱。
10.权利要求9的方法，其中蛋白质组图谱在质谱的3-5kDa范围内包含至少一种独特的表达特征。
11.权利要求9的方法，其中蛋白质组图谱在质谱的10-12kDa范围内包含至少一种独特的表达特征。
12.权利要求9的方法，其中母体症状是羊膜内感染，独特的表达特征是测试样本中的10-12kDa分子量范围内的额外峰值，其指示羊膜内感染。
13.权利要求12的方法，其中生物液体是羊水或母体血清。
14.权利要求1的方法，其中蛋白质组图谱通过Western印迹分析生成。
15.权利要求1的方法，其中生物液体是人的液体，而蛋白质组图谱包括一种或多种蛋白质的表达信息，该蛋白质选自巨噬细胞加帽蛋白，嗜中性白细胞明胶酶相关lipocalin，髓过氧化物酶；L-网素；azurocidin；抗菌蛋白FALL-39；Gp340变体蛋白；Ebner唾液腺蛋白同系物(GenBank登录号355392)；白血球弹性蛋白酶抑制剂；钙粒蛋白A；钙粒蛋白B；丝切蛋白；膜突蛋白；抑制蛋白I，cronin样蛋白p57；连接蛋白II，纤连蛋白；神经胶质来源的连接蛋白；抗凝血酶-III；鳞片状上皮细胞癌抗原1，鳞片状上皮细胞癌抗原2；丝氨酸蛋白酶抑制剂12；半胱氨酸蛋白酶抑制剂A；半胱氨酸蛋白酶抑制剂B；半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；IGFBP-1；维生素D-结合蛋白；载脂蛋白A-I；14-3-3蛋白σ；14-3-3蛋白ζ/δ；凝溶胶蛋白；乳运铁蛋白；磷酸甘油酸激酶1；磷酸甘油酸变位酶1；或转酮酶；或其片段、前体或天然存在的变体。
16.权利要求15的方法，其中蛋白质组图谱包括两种或多种所述蛋白的表达信息。
17.权利要求15的方法，其中蛋白质组图谱包括所有所述蛋白的表达信息。
18.权利要求15的方法，其中生物液体是羊水。
19.权利要求15的方法，其中蛋白质组图谱是正常样本的蛋白质组图谱。
20.权利要求15的方法，其中蛋白质组图谱是测试样本或参比样本的蛋白质组图谱。
21.权利要求15的方法，其中相对于所述正常样本，一种或多种所述蛋白在所述测试样本中被差别性地表达。
22.权利要求21的方法，其中蛋白质组图谱包括一种或多种蛋白的表达信息，该蛋白选自巨噬细胞加帽蛋白；嗜中性白细胞明胶酶相关lipocalin；髓过氧化物酶；L-网素；azurocidin；抗菌蛋白FALL-39；白血球弹性蛋白酶抑制剂；钙粒蛋白A；钙粒蛋白B；抑制蛋白I，神经胶质来源的连接蛋白；丝氨酸蛋白酶抑制剂12；半胱氨酸蛋白酶抑制剂A；或IGFBP-1；或其片段、前体或天然存在的变体。
23.权利要求22的方法，其中蛋白质组图谱包括两种或多种所述蛋白的表达信息。
24.权利要求22的方法，其中蛋白质组图谱包括所有所述蛋白的表达信息。
25.权利要求22的方法，其中所述受试者被诊断为羊膜内感染。
26.权利要求22的方法，其中所述受试者被诊断为发育缺陷。
27.权利要求26的方法，其中所述发育缺陷是器官系统发育中的缺陷。
28.权利要求27的方法，其中所述器官系统是中枢神经系统或者心血管系统。
29.权利要求28的方法，其中所述发育缺陷是肌肉与骨骼的畸形。
30.权利要求28的方法，其中所述发育缺陷是由于染色体非整倍性造成。
31.权利要求22的方法，其中测试样本的蛋白质图谱基本上与正常样本的蛋白质组图谱相同，该受试者被确定为无所述母体或胎儿症状。
32.权利要求22的方法，其中蛋白质组图谱包括一种或多种蛋白质的表达信息，该蛋白质选自由列举在表3和4中的蛋白质组成的组。
33.权利要求22的方法，其中蛋白质组图谱含有与参比样本相同的独特表达特征。
34.权利要求32的方法，其中独特的表达特征表征羊膜内感染。
35.权利要求34的方法，其中所述受试者被诊断为患有羊膜内感染。
36.用于诊断羊膜内感染的方法，包含(a)将从怀孕的雌性哺乳动物获得的生物液体的测试样本的蛋白质组图谱与正常样本的蛋白质组图谱，或者参比蛋白质图谱比较，其中所述蛋白质组图谱提供存在于所述样本中的蛋白质或其蛋白质水解片段的质量的信息；和(b)如果测试样本的蛋白质组图谱在3-5和/或10-12Kda分子量范围内具有独特的表达特征，诊断所述哺乳动物患有羊膜内感染。
37.权利要求36的方法，其中蛋白质组图谱表示为质谱的形式。
38.权利要求37的方法，其中所述哺乳动物是灵长类。
39.权利要求38的方法，其中所述灵长类是人。
40.权利要求39的方法，还包括监控所述羊膜内感染的进程的步骤。
41.权利要求39的方法，其中生物液体是羊水或母体血清。
42.用于诊断羊膜内感染的方法，包含(a)将从怀孕的雌性哺乳动物获得的生物液体的测试样本的蛋白质组图谱与正常样本的蛋白质组图谱比较；和(b)如果相对于正常样本，至少一种蛋白质在所述测试样本中被差别性地表达，则诊断所述哺乳动物患有羊膜内感染，该蛋白质选自IGFB-1，钙粒蛋白，azurocidin，抑制蛋白，血浆铜蓝蛋白，或L-网素，或其片段、前体或天然存在的变体。
43.权利要求42的方法，其中所述哺乳动物是灵长类。
44.权利要求43的方法，其中所述灵长类是人。
45.权利要求44的方法，其中所述生物液体是羊水或母体血清。
46.权利要求42的方法，其中相对于所述正常样本，至少IGFBP-1，钙粒蛋白，azurocidin，抑制蛋白，和血浆铜蓝蛋白，或其片段、前体或天然存在的变体之一在所述测试样本中被过度表达。
47.权利要求42的方法，其中相对于所述正常样本，L-网素在所述测试样本中低表达。
48.权利要求46的方法，其中通过鉴定如附图12所示的蛋白质水解片段或其片段，检测IGFBP-1的存在。
49.权利要求48的方法，还包括监控所述羊膜内感染的状态的步骤。
50.用于诊断染色体非整倍性的方法，包含(a)将从怀孕的雌性哺乳动物获得的生物液体的测试样本的蛋白质组图谱与正常样本的蛋白质组图谱，或者参比蛋白质图谱比较，其中所述蛋白质组图谱提供存在于所述样本中的蛋白质或其蛋白质水解片段的质量的信息；和(b)如果测试样本的蛋白质组图谱在4-5Kda分子量范围内具有独特的表达特征，诊断所述哺乳动物患有染色体非整倍性。
51.权利要求50的方法，其中染色体非整倍性是Down综合症。
52.用于诊断胎儿发育缺陷的方法，包含a)将从怀孕的雌性哺乳动物获得的生物液体的测试样本的蛋白质组图谱与正常样本的蛋白质组图谱或者参比蛋白质组图谱比较；和b)如果相对于正常样本，至少一种肌动蛋白调节蛋白或其片段、前体或天然存在的变体在所述测试样本中被差别性地表达，则确定存在所述发育缺陷。
53.权利要求52的方法，其中所述肌动蛋白调节蛋白选自膜突蛋白，p57，凝溶胶蛋白和14-3-3蛋白。
54.用于诊断母体或胎儿感染或免疫反应相关异常的方法，包含(a)将从怀孕的雌性哺乳动物获得的生物液体的测试样本的蛋白质组图谱与正常样本的蛋白质组图谱或者参比蛋白质组图谱比较；和(b)如果相对于正常样本，至少一种蛋白质在所述测试样本中被差别性地表达，则确定存在所述母体或胎儿感染或免疫反应相关异常，该蛋白质选自巨噬细胞加帽蛋白(MCP)，白血球弹性蛋白酶，嗜中性白细胞明胶酶相关lipcalcin(NGAL)，髓过氧化物酶，L-网素，钙粒蛋白，FALL-39，azyrocidin(CAP37)，蛋白酶或蛋白酶抑制剂。
55.用于诊断新生儿脓毒病的方法，包含在从怀孕的雌性哺乳动物的生物液体的蛋白质组图谱中检测Gp-340的存在。
56.生物液体的蛋白质组图谱，包含一种或多种蛋白质的信息，该蛋白质选自巨噬细胞加帽蛋白，嗜中性白细胞明胶酶相关lipocalin，髓过氧化物酶；L-网素；azurocidin；抗菌蛋白FALL-39；Gp340变体蛋白；Ebner唾液腺蛋白同系物(GenBank登录号355392)；白血球弹性蛋白酶抑制剂；钙粒蛋白A；钙粒蛋白B；cofilin；膜突蛋白；抑制蛋白I，cronin样蛋白p57；连接蛋白II，纤连蛋白；神经胶质来源的连接蛋白；抗凝血酶-III；鳞片状上皮细胞癌抗原1，鳞片状上皮细胞癌抗原2；丝氨酸蛋白酶抑制剂12；半胱氨酸蛋白酶抑制剂A；半胱氨酸蛋白酶抑制剂B；半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；IGFBP-1；维生素D-结合蛋白；载脂蛋白A-I；14-3-3蛋白σ；14-3-3蛋白ζ/δ；凝溶胶蛋白；乳运铁蛋白；磷酸甘油酸激酶1；磷酸甘油酸变位酶1；和转酮酶；或其片段、前体或天然存在的变体。
57.生物液体的蛋白质组图谱，包含一种或多种蛋白质的信息，该蛋白质选自巨噬细胞加帽蛋白；嗜中性白细胞明胶酶相关lipocalin；髓过氧化物酶；L-网素；azurocidin；抗菌蛋白FALL-39；白血球弹性蛋白酶抑制剂；钙粒蛋白A；钙粒蛋白B；抑制蛋白I，神经胶质来源的连接蛋白；丝氨酸蛋白酶抑制剂12；半胱氨酸蛋白酶抑制剂A；或IGFBP-1；或其片段、前体或天然存在的变体。
58.生物液体的蛋白质组图谱，包含一种或多种蛋白质的信息，该蛋白质选自列举在表3和4中的蛋白质。
59.权利要求56-58的任何一项的蛋白质组图谱，确认一种或多种所述蛋白质或其片段、前体或天然存在的变体的存在。
60.表征羊膜内感染的生物液体的蛋白质组图谱，包含确定存在一种蛋白质的信息，该蛋白质选自IGFB-1，抑制蛋白，血浆铜蓝蛋白，L-网素或钙粒蛋白。
61.表征羊膜内感染的生物液体的蛋白质组图谱，表示为提供在所述生物液体中存在的蛋白质或其蛋白质水解片段的分子量的信息的形式，包含3-5KDa和/或10-12Kda分子量范围内的独特表达特征。
62.权利要求60的蛋白质组图谱，表示为质谱。
63.权利要求61的蛋白质组图谱，其中生物液体是羊水或母体血清。
64.基本上如附图1A-1C的任意一个中所示的蛋白质组图谱。
65.基本上如附图2A-C的任意一个中所示的蛋白质组图谱。
66.基本上如附图3A-C的任意一个中所示的蛋白质组图谱。
67.基本上如附图4A或4B的任意一个中所示的蛋白质组图谱。
68.基本上如附图6-10的任意一个中所示的蛋白质组图谱。
69.权利要求63-67任一个的蛋白质组图谱，以微阵列的形式分析。
70.蛋白质阵列，包含一种或多种固定在固体支持物上的蛋白质，该蛋白质选自列举在表2-4中的蛋白质。
71.抗体阵列，包含固定在固体支持物上的能特异地结合到一种或多种列举在表2-4中的蛋白质的抗体。
全文摘要
本发明涉及生物液体的蛋白质组的鉴定，及其在确定母体/胎儿症状的状态中的用途，该症状包括胎儿来源的母体症状，染色体非整倍性，以及与胎儿生长和成熟相关的胎儿疾病。特别地，本发明涉及鉴定羊水的蛋白质组(代表羊水组成的多种蛋白质)和正常的蛋白质组的特征性变化与各种病理性母体/胎儿症状的相关性，这些症状例如羊膜内感染，或染色体缺陷。
文档编号G01N33/543GK1795387SQ200480014441
公开日2006年6月28日 申请日期2004年3月23日 优先权日2003年3月25日
发明者罗恩·罗森菲尔德, 斯里·纳加拉, 迈克·格雷维特 申请人:普罗特奥格尼克斯公司