专利名称：利用液相色谱法检测、分离纯化天然除虫菊酯有效成分的方法
技术领域：
本发明涉及一种天然除虫菊酯有效成分的检测、分离方法，特别是涉及一种利用液相色谱法检测、分离纯化天然除虫菊酯有效成分的方法。其分离纯化的有效成分可用于农业、林业、生物农药、食品卫生安全等多个领域。
背景技术：
除虫菊(pyrethrum)是一种菊科多年生草本植物，是目前世界上唯一集约化种植的杀虫植物。至今已有165年的栽培和使用历史。我国大量种植的地区是云南，其他地区也有少量种植。天然除虫菊酯(pyrethrins)是从除虫菊中提取出来的杀虫有效成分。除虫菊杀虫活性物质主要包括除虫菊酯I、除虫菊酯II，瓜叶菊酯I、瓜叶菊酯II和茉酮菊酯I、茉酮菊酯II六种杀虫有效成分。其高效、低毒、广谱、低残留的杀虫特性，对人、温血动物和环境没有危害，深受人们的广泛欢迎。经过研究表明除虫菊酯被认为是世界上最安全、最有效的天然杀虫剂，它在绿色食品生产中的地位越来越受到重视。
我国对天然除虫菊酯的研究较少，仅对天然除虫菊组织培养、细胞悬浮培养、除虫菊的提取有一些研究，目前只有一篇文献报道了国内几家企业生产天然除虫菊酯六种有效成分含量的初步研究结果(黄修柱，2004)，而对天然除虫菊酯六种有效成分分离纯化的研究还未见报道。
国外分离纯化、检测天然除虫菊酯六种有效成分使用正相高效液相色谱法(normal-phase HPLC)、毛细管电色谱法(Pol等，2003；Essig等，2001a；Essig等，2001b；Henry III等，2001)。在国外的几篇研究文献中都曾报道了利用反相高效液相色谱不能有效分离得到纯化的上述除虫菊酯六种有效成分(Essig等，2001a；Essig等，2001b)。
众所周知，对于正相高效液相色谱法，其色谱柱具有不易获得，流动相价格高，消耗较高的缺点，而相对于正相高效液相色谱法和毛细管电色谱法，反相高效液相色谱具有色谱分离柱比较普及，流动相易得，消耗低，操作简单、快速，分离效果好等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用反相液相色谱法检测、分离纯化天然除虫菊酯有效成分的方法。这种方法的设备要求低、纯化费用低。
本发明的目的是这样实现的一种利用液相色谱法检测、分离纯化天然除虫菊酯有效成分的方法，其特征在于所采用的液相色谱法是反相高效液相色谱法；液相色谱条件NUCLEODUR(闪电)C18色谱柱，流动相乙腈-水溶液，A液为水，B液为90％乙腈，柱温40℃，检测波长235nm。
上述检测、分离方法中，先将天然除虫菊酯的有机溶剂提取物，用丙酮、乙腈有机溶剂进行稀释如浓度为70％的除虫菊酯原药∶丙酮∶乙腈＝1∶5∶94进行稀释，并抽滤得样品。
上述所得样品，对其中的六种有效成分进行检测时，其液相色谱条件具体为色谱柱长250mm×内径4.6～16mm，填料粒度5～7μm；流动相的流速1～12mL/min；进行梯度洗脱或等度洗脱。
上述所得样品，对其中六种有效成分进行制备时，其色谱条件具体为色谱柱长250mm×内径10～50mm，填料粒度5～10μm；流动相的流速10～100mL/min；进行梯度洗脱或等度洗脱。
上述等度洗脱条件为A相∶B相＝35％∶65％。
上述梯度洗脱条件为0～30分钟，B相60％；30～65分钟B相增加到70％；65～85分钟B相减少到65％；85～90分钟，B相增加到85％；90～100分钟，B相减少到60％。
采用上述反相高效液相色谱条件可成功地分离纯化出天然除虫菊酯的六种有效成分，得到的产品纯度与正相高效液相色谱分离除虫菊酯的效果一致，纯度也达到99％。这种分离方法相对于正相高效液相色谱法和毛细管电色谱法具有如下优点色谱分离柱比较普及，流动相易得，消耗低，操作简单、快速，分离效果好等优点。
而且至今为止，尚无天然除虫菊酯六种单一组分的纯品出售，本发明利用反相高效液相色谱法制备的天然除虫菊酯纯品具有很好的产业前景，可以作为天然除虫菊酯标准品并广泛应用于除虫菊研究、食品检测、进出口商品检测等领域。
图1.梯度分离天然除虫菊酯有效成分的高效液相色谱图。
图中a是瓜叶菊酯II的色谱峰图，b是除虫菊酯II的色谱峰图，c是茉酮菊酯II的色谱峰图，d是瓜叶菊酯I的色谱峰图，e是除虫菊酯I的色谱峰图，f是茉酮菊酯I的色谱峰图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例，对本发明作进一步详述，但本发明并不仅限于此。
实施例11.仪器和试剂高效液相色谱仪配带紫外检测器。二元泵。手动进样器。气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)。氮吹仪。超声波脱气机。色谱纯乙腈、丙酮和氯化钠均为分析纯。试验水为二次蒸馏水。
2.色谱条件2.1分析检测及半制备色谱条件色谱柱NUCLEODUR(闪电)C18柱(长250mm×内径4.6～16mm，填料粒度5～7μm)；流动相乙腈水溶液，A液为水，B液为90％乙腈，流速1～12mL/min。梯度洗脱条件为0～30分钟，B相60％；30～65分钟B相增加到70％；65～85分钟B相减少到65％；85～90分钟，B相增加到85％；90～100分钟，B相减少到60％。柱温40℃；检测波长235nm；进样量10～120μL。
2.2制备色谱条件色谱柱NUCLEODUR(闪电)C18柱(长250mm×内径10～50mm，填料粒度5～10μm)；流动相乙腈水溶液，A液为水，B液为90％乙腈，流速10～100mL/min。梯度洗脱条件为0～30分钟，B相60％；30～65分钟B相增加到70％；65～85分钟B相减少到65％；85～90分钟，B相增加到85％；90～100分钟，B相减少到60％。柱温40℃；检测波长235nm；进样量1～10mL。
3.样品前处理按常规，将天然除虫菊酯的有机溶剂提取物，用丙酮、乙腈等有机溶剂进行适当稀释(如浓度70％的除虫菊酯原药，按原药∶丙酮∶乙腈＝1∶5∶94进行稀释)，抽滤后装入棕色瓶中，于4℃冰箱中保存备用。
4.反相高效液相色谱分离天然除虫菊酯六种成分梯度洗脱程序的确定通过等度(A相∶B相＝35％∶65％)和梯度程序分离试验，发现梯度程序比等度运行的运行时间短(至少短30min)、分离效果好，六种组分均能达到基线分离。确定梯度洗脱条件为0～30分钟，B相60％；30～65分钟B相增加到70％；65～85分钟B相减少到65％；85～90分钟，B相增加到85％；90～100分钟，B相减少到60％。检测结果如附图1。
5.反相高效液相色谱收集六种成分时间的确定收集时间的准确性，关系到收集的六种成分的纯度，即必须准确地确定收集时间。收集时间计算如下溶液从检测池流到检测器出口大约需要1/12min，然后从检测器出口至收集瓶中的时间需要(根据管子长度来计算流量，管子流量为0.2ml，流速为1min/L，即消耗时间为1/3min)1/3min，加上检测池洗脱时间，总共需要5/12min。考虑到存在计算误差，确定从出峰开始计算1/2min后开始收集六种洗脱液。
6.纯度计算通过附图1a-f的峰高比可以计算出六种成分的纯度，其纯度都达到了99％。
7.六种组分的鉴定通过GC-MS分析，与图谱库中的图进行比较对照，得出结果如下第一个峰(附图1-a)是瓜叶菊酯II，第二个峰(附图1-b)是除虫菊酯II，第三个峰(附图1-c)是茉酮菊酯II，第四个峰(附图1-d)是瓜叶菊酯I，第五个峰(附图1-e)是除虫菊酯I，第六个峰(附图1-f)是茉酮菊酯I。
8.反相高效液相色谱六种有效成分的损失率计算通过峰面积比可以计算出六种成分的损失率，结果见表1。
表1 除虫菊酯六种物质的损失率
实施例2将本发明所述方法应用于检测天然除虫菊酯六种有效成分和半制备方案将天然除虫菊酯样品按照实施例1步骤3处理后，上反相高效液相色谱，采用实施例1所给出的分析检测及半制备色谱条件下，我们以出峰顺序为例，能够有效分离纯化这六种组分。
在35.78min出第一个峰，37.94min第一峰结束，推迟1/2min收集第一个峰，直到峰出完后推迟1/3min结束收集；在39.68min出第二个峰，42.16min第二峰结束；在51.40min出第三个峰，53.28min第三峰结束；在71.22min出第四个峰，73.96min第四峰结束；在74.98min出第五个峰，78.46min第五峰结束；在89.00min出第六个峰，90.46min第六峰结束；后面五种物质与第一峰收集方式、结束收集时间程序一样。把收集到的六种溶液，经过NaCl盐析，氮吹仪吹干，得到六种固体物质，再用丙酮将其分别溶解后，加乙腈稀释到与盐析前同样的溶液体积，再进液相，从图谱可以看到出峰情况，只有单一峰，通过峰面积(或峰高)百分比可以看到其纯度达到99％。利用GC-MS确定其分子结构，与图谱库中图比较得出第一个峰是瓜叶菊酯II，第二个峰是除虫菊酯II，第三个峰是茉酮菊酯II，第四个峰是瓜叶菊酯I，第五个峰是除虫菊酯I，第六个峰是茉酮菊酯I。
实施例3将本发明所述方法应用于天然除虫菊酯六种有效成分的制备采用实施例1给出的制备型液相色谱条件，本发明可以进行除虫菊酯精油产品的分离纯化，制备出除虫菊酯各种单体物质。
参考文献[1]黄修柱.2004.天然除虫菊素母药中主要成分质谱分析研究[J].农药科学与管理，25(4)6～9. Pol J，Wenclawiak BW.2003.Direct on-line continuous supercriticalfluid extraction and HPLC of aqueous pyrethrins solutions[J].Analytical chemistry，751430-1435. Essig K，Zhao Z.2001a.Method development and validation of ahigh-performance liquid chromatographic method for pyrethrumextract[J].Journal of Chromatographic Science，12(39)473-480. Essig K，Zhao Z.2001b.Preparation and characterization of a pyrethrumextraction standard[J].LCGC(www.chromatographyonline.com)，7(19)722-730. Henry III CW，McCarroll ME，Warner IM.2001.Separation of theinsecticidal pyrethrin esters by capillary electrochromatography[J].Journal of Chromatography A，905317-327.
权利要求
1.一种利用液相色谱法检测、分离纯化天然除虫菊酯有效成分的方法，其特征在于所采用的液相色谱法是反相高效液相色谱法；色谱条件NUCLEODUR闪电C18色谱柱，流动相乙腈-水溶液，A液为水，B液为90％乙腈，柱温40℃，检测波长235nm。
2.如权利要求1所述的利用液相色谱法检测、分离纯化天然除虫菊酯有效成分的方法，其特征在于所述经处理过的天然除虫菊酯样品进行检测或小量分离时，其液相色谱条件为色谱柱长250mm×内径4.6～16mm，填料粒度5～7μm；流动相的流速1～12mL/min；进行梯度洗脱或等度洗脱。
3.如权利要求1所述的利用液相色谱法检测、分离纯化天然除虫菊酯有效成分的方法，其特征在于所述经处理过的天然除虫菊酯样品进行分离制备其六种有效成分纯品时，其液相色谱条件为色谱柱长250mm×内径10～50mm，填料粒度5～10μm；流动相的流速10～100mL/min；进行梯度洗脱或等度洗脱。
4.如权利要求2所述的利用液相色谱法检测、分离纯化天然除虫菊酯有效成分的方法，其特征在于所述检测、分离时所用的梯度洗脱条件为0～30分钟，B相60％；30～65分钟B相增加到70％；65～85分钟B相减少到65％；85～90分钟，B相增加到85％；90～100分钟，B相减少到60％；所述检测、分离时所用的等度洗脱条件为A相∶B相＝35％∶65％。
5.如权利要求3所述的利用液相色谱法检测、分离纯化天然除虫菊酯有效成分的方法，其特征在于所述分离制备其六种有效成分纯品所用的梯度洗脱条件为0～30分钟，B相60％；30～65分钟B相增加到70％；65～85分钟B相减少到65％；85～90分钟，B相增加到85％；90～100分钟，B相减少到60％；所述分离制备其六种有效成分纯品所用的等度洗脱条件为A相∶B相＝35％∶65％。
全文摘要
本发明涉及一种利用反相液相色谱法检测、分离纯化天然除虫菊酯有效成分的方法，其色谱条件为NUCLEODUR (闪电)C18色谱柱，流动相乙腈－水溶液，A液为水，B液为90％乙腈，柱温40℃，检测波长235nm。采用本发明能够成功地分离纯化天然除虫菊酯六种有效成分，得到的产品纯度达到99％。这种分离方法具有如下优点色谱分离柱比较普及，流动相易得，消耗低，操作简单、快速，分离效果好。其分离纯化的有效成分可以作为标准品并广泛应用于农业、林业、生物农药、食品卫生安全等多个领域。
文档编号G01N30/88GK1815217SQ20061005410
公开日2006年8月9日 申请日期2006年3月2日 优先权日2006年3月2日
发明者李正国, 段伟, 王国民, 夏玉先, 杨迎伍 申请人:重庆大学, 重庆重大生物技术发展有限公司