专利名称：一种二维高效液相色谱装置及其应用的制作方法
一种二维高效液相色谱装置及其应用
背景技术：
本发明涉及高效液相色谱，具体地说是一种二维高效液相色谱装置及 其通过同一检测器依次检测复杂体系样品中不同疏水性小分子组分的二维 高效液相色谱方法。
背景技术：
自上世纪70年代以来，高效液相色谱成为发展最快的分析化学分支之 一。尤其是近年以来，随着生命科学和生物工程等领域的迅速发展，因具 有分离检测过程温和，对沸点高、分子量大、极性强、热稳定性差的化合 物特别是有生物活性的物质具有特别的处理能力等优点，高效液相色谱日 益成为分析化学和生物化学实验室必备的分离工具(文献l.王俊德，商振 华，郁蕴璐等.高效液相色谱法.中国石化出版社1992.3第一版pl.)。特 别是将液相色谱和质谱联用，可以进一步增加峰容量，提高对复杂样品的 分离分析能力。
作为一种灵敏度高、选择性强、无歧视性的分析技术，质谱在生物科学 和分析科学领域的应用越来越广泛(文献2. Y. X. Zhu， P. S. H. Wong， M. Cregor， J". F. Gitzen， L A. Coury， P. T. Kissinger, Rapid Commun. Mass Spectrom. 14 (2000) 1695.文献3. L. D. Acevedo， Y. D. Xu， X. Zhang, R. J. Pearce， A. Yergey， J. Mass spectrom. 31 (1996) 1399.)。但质 谱只能分析气态离子，很多液相色谱中常用的非挥发性缓冲盐无法应用于 液质联用系统中，而流动相的组成和流量对质谱检测灵敏度也有很大影响。 这导致了液质联用技术在复杂样品分析中应用的局限性。
在高效液相色谱中，应用范围最广的色谱柱是十八烷基硅胶键合相色 谱柱，即通常所说的C18柱。这种色谱柱基于反相分离机理，根据具体分 析对象，通过调节流动相组成、柱温等条件，能满足多数极性较弱样品的 分离要求；对于强极性和亲水性物质，需要通过添加离子对试剂等手段实 现分离，但常见的离子对试剂多不挥发，无法与质谱在线联用。因此，在 分析复杂样品时，为获取尽可能多的组分信息，常采用挥发性缓冲盐来满 足与质谱联用的要求，同时增加流动相中水相的含量。即使这样，仍会有 相当一部分强极性和亲水性组分在死时间流出，导致这部分样品信息的损 失；同时，流动相中水相含量较高也会在一定程度上抑制质谱检测的灵敏 度。二
亲水反应色谱(Hydrophilic interaction chromatography, HILIC) 是一类采用水溶性流动相，基于正相保留机理，分离亲水性物质的液相色 i普法(文献4. Y. Guo, S. Gaiki， J. Ch扁atogr. A 1074 (2005) 71.)。 其特征在于水是强洗脱剂，亲水性越强的物质保留越强。目前已有多种填
料用于HILIC中，如氨丙基、酰胺基、二醇基、硅胶等(文献5. H. L. Koh， A. J. Lau， E. C. Y. Chan， Rapid commun. Mass spectrom. 19 (2005) 1237. 文献 6 . J. C. Valette， C. Demesmay， J. L. Rocca， E. Verdon， Chromatographia 59 (2004) 55.文献7.T. Yoshida， J. Biochem. Biophys. Methods 60 (2004) 265.文献8. Hiroyuki Tanaka， Xiaojing Zhou， Ohira Masayoshi，J.Chromatogr.A 987 (2003)119.文献 9 . H. Schlichtherle-Cerny， M. Affolter， C. Cerny， Anal. Chem. 75 (2003) 2349.)，用于分离糖、多肽、药物等极性小分子。因采用高有机相含量模 式，不会降低质谱的检测灵敏度，HILIC非常适合和质谱联用。但与C18柱 相比，HILIC柱有保留窗口窄，峰容量小的缺点。因此，如果能够发展一种 新的液相色谱方法，针对生物样品、环境样品、天然产物提取液、体液等 复杂体系样品中分子量小于1000的，性质各异，含量不等，蕴含大量样品 信息、单根色谱柱选择性有限、分辨率和峰容量难以满足分离要求的非挥 发性小分子物质，根据反相色谱柱和亲水反应柱各自的分离特点，分别分 析复杂样品中的疏水性和亲水性组分，并利用质谱作检测器，将会大大提 高方法的峰容量和分辨率，获得更多的样品信息。
发明内容
本发明的目的是提供一种二维高效液相色谱装置及其通过同一检测器 依次检测复杂体系样品中不同疏水性小分子组分的二维高效液相色谱方 法；通过该装置，可使复杂体系中的疏水性组分和亲水性组分分别在相应 的色谱柱上进行分离，并在线依次通过同一检测器记录分离结果。本发明 能够和蒸发光散射检测器和质谱等特殊检测器联用，进一步增加峰容量和 选择性。
为实现上述目的，发明采用的技术方案如下
一种二维高效液相色谱装置，由五个高压液相色谱溶剂输送泵、 一个溶 剂混合器、 一个十通阀、 一个六通阀、两根分别适用于疏水性组分和亲水 性组分分离的液相色谱分析柱和一根组分转移柱构成；
第一维高压梯度溶剂输送泵和自动进样器、第一维分析柱依次连接， 第一维分析柱后接十通阀的⑥位；十通阀的⑦位与②位、④位与⑩位分别 连通，③位接混合器的一个入口，混合器的另一个入口接一个溶剂输送泵， 混合器的出口接六通阀的⑥位，六通阀的①位和④位接组分转移柱，②位 和③位分别接第二维分析柱和第二维高压梯度溶剂输送泵，六通阀的(D位 为废液出口，第二维分析柱后接十通阀的①位，十通阀的⑤位接检测器， ⑧位为废液出口，⑨位堵死。
当所采用的检测器(11)为有流量限制的检测器时(如质谱)，在第 二维分析柱(9)与十通阀(4)的①位之间的连接管路上设有分流装置(12)，
其分流支路与外管路相通。
第一维中的色谱分析柱可以是性能类似的所有亲水反应色谱柱；第二
维中的色谱分析柱可以是性能类似的所有反相色谱柱；第一维分析柱采用 内径为2. 1 mm的亲水反应色谱柱，用于亲水性组分的分离；第二维采用内 径为4.6mm的反相色谱分析柱，用于疏水性组分的分离；组分转移柱采用 与第二维分析柱内径和填料相同的色谱柱，用于疏水性样品在两维间的转 移。
所述二维高效液相色谱系统可用于依次分离检测复杂体系样品中不同 疏水性的小分子组分，即依次分析其中亲水性组分和疏水性组分；
复杂体系样品，如生物样品、环境样品、天然产物提取液、体液等复 杂体系样品中分子量小于1000的，性质各异，含量不等，蕴含大量样品信 息、单根色谱柱选择性有限、分辨率和峰容量难以满足分离要求的非挥发 性小分子物质，或某些特定样品中亲/疏水性相差极大的几类组分的在线依 次定性和定量分析。
本发明具有如下优点
本发明系统适用于复杂体系样品中多种不同疏水性小分子组分的分离 检测，应用时操作简便，只需两次预实验，分别确定两维的分离条件和十 通阀及六通阀的切阀时间，即可实现自动批量分析工作；灵活性好，可以 根据具体分析对象的特点和分析要求调整多个实验参数，从而达到针对特 定样品的优化分离结果；可以采用质谱、蒸发光散射等特殊检测器，进一 步提高分析的分辨率，增加峰容量和选择性；非常有利于代谢组学、系统 生物学等目前热点研究领域所关注的具有重要意义的非挥发性小分子物质 的分离分析，提供更全面的样品信息。
由于亲水性组分和疏水性组分分别在各自适用的色谱柱上进行分离， 利于分别调整两维的分离条件，获得更好的分离效果；普适性强，既可以 用于复杂体现样品中非挥发性小分子物质的全组分分析，为代谢组学、系 统生物学等研究领域提供全面和可靠的样品信息，也可以实现某些特定样 品中亲/疏水性相差极大的几类组分的同时定性和定量分析；减少工作量， 提高工作效率，简化了样品的预处理过程，无需手动控制疏水性组分在两 维间的转移，进一步降低分析过程中的偶然误差；易于实现，本发明系统 所采用的所有组件均为商品化模块，此外，还可以根据具体的分析对象采 用不同填料的商品化色谱分析柱完成两维分析。
图la为本发明装置的结构及操作流程示意图之一； 图lb为本发明装置的结构及操作流程示意图之二； 图lc为本发明装置的结构及操作流程示意图之三。 图2a为本发明装置中的检测器为质谱时的结构及操作流程示意图之
图2b为本发明装置中的检测器为质谱时的结构及操作流程示意图之
图2c为本发明装置中的检测器为质谱时的结构及操作流程示意图之
图3为HILIC色谱柱单独分离混合标样色谱图，图中l.尿嘧啶，2. 尿苷，3.对羟基苯曱酸，4.对氯苯曱酸，5.假尿苷，6.巴马汀，7. propanolol， 8.尼古丁， 9.马尿酸，10. Trp-Phe， 1L异烟酸，12. atenolol;
图4为RP色谱柱单独分离混合标样色谱图，图中13.苯酚，14. 2，6-二甲基苯酚，15.苯，16.甲苯，17.萘，18.邻氯甲苯，19.联苯，20. 1,2，4-三甲苯，21.苊，22. 2,3-二甲萘，23. 4-氯代联苯，24.荧蒽，25.芘。
图5为组分转换柱的捕集能力考察图，众十通阀切换信号，用于标示
十通阀的切换时间。
图6为二维依次分离混合标样色谱图，是单个检测器在一张色谱图上 依次记录两维的分离结果。
图7为忍冬提取液分析紫外检测色谱图，其中，上HILIC Si单柱；
中C18单柱；下两柱依次分离。
图8为忍冬提取液分析总离子流图，其中，上HILIC Si单柱；中 C18单柱；下两柱依次分离。
具体实施例方式
如附图l所示，两维依次分离HPLC系统由以下三部分组成。
1. 高效液相色谱仪。基本配置包括五个高压溶剂输送泵、 一个混合器、 一个检测器(或两个串联检测器)，还可选配一个自动进样器。
2. 电动高压二位切换阀。包括一个六通阀和一个十通阀。
3. 色谱柱。包括一根用来分析疏水性组分的反相(RP)色谱分析柱、 一根用来分析亲水性组分的亲水反应色谱(HILIC)分析柱以及一根组分转 移柱。两根分析柱的尺寸以及组分转移柱的类型和尺寸取决于两根分析柱 的设置顺序。基本原则是，第一维分析柱内径较细(在常规液相色谱中为 2. 1 mm I. D.)，第二维分析柱内径较粗(在常规液相色谱中为4. 6 mm I. D.)， 两根分析柱的柱长没有特殊要求，但在满足仪器适用的条件下优先选择较 长的分析柱以获得较高峰容量。组分转移柱的填料类型与第二维分析柱一 致或类似，内径与第二维分析柱一致，长度没有特殊要求，但在满足捕集 组分要求的条件下，优先选择较短的柱子。
一种二维高效液相色谱装置，由五个高压液相色谱溶剂输送泵、 一个溶 剂混合器、 一个十通阀、 一个六通阀、两根分别适用于疏水性组分和亲水 性组分分离的液相色谱分析柱和一根组分转移柱构成；
第一维高压梯度溶剂输送泵1和自动进样器2、第一维分析柱3依次 连接，第一维分析柱3后接十通阀4的⑥位；十通阀4的⑦位与②位、④ 位与⑩位分别连通，③位接混合器5的一个入口，混合器5的另一个入口 接一个溶剂输送泵6，混合器5的出口接六通阀7的⑥位，六通阀7的①位 和④位接组分转移柱8，②位和③位分别接第二维分析柱9和第二维高压梯 度溶剂输送泵IO，六通阀7的⑤位为废液出口，第二维分析柱9后接十通 阀4的①位，十通阀4的⑤位接检测器11，⑧位为废液出口，⑨位堵死。
如图2所示，当检测器ll为有流量限制的检测器时，在第二维分析柱 9与十通阔4的①位之间的连接管路上设有分流装置，其分流支路与外管路 相通。
具体操作流程如下
第一步，如附图la所示，上样。用自动进样器将样品转入第一维分析 柱，用第一维的初始流动相将没有保留的组分冲出第一维分析柱，这部分 组分通过混合器时，与溶剂输送泵6打出的流动相混合，使得这部分组分 的溶剂转换为在第二维分析柱上洗脱能力相对较弱的流动相，然后进入组 分转移柱并保留在柱上。与此同时，第二维分析柱用其相应初始流动相进 行平衡。在此过程中，检测器不采集样品的有用信息。虽然第一维分离的 第一步不能通过检测器实时监测，但当仪器稳定性好时，通过预实验，完 全可以确定实验条件，而常规的液相色谱系统的稳定性已经足够满足这一 要求。
第二步，如附图lb所示，第一维分离和组分转移。当第一维柱上没有 保留的组分全部流出柱后，切换十通阀，使第一维分析柱与检测器直接相 连，此时，第一维分析柱在优化条件下分离有保留样品，检测器记录第一 维分离的结果。同时，溶剂输送泵6继续提供流动相， 一方面将残存在混 合器中的样品组分彻底冲洗到组分转移柱上；另一方面，进一步降低组分 转移柱上流动相相对于第二维分析柱的洗脱强度。这一过程可以有效降低 第二维分析时由于组分溶剂过强造成的峰展宽和峰前伸现象。而第二维分 析柱继续用初始流动相进行平衡。这一过程所需的时间由混合器体积决定， 当混合器中的所有组分全部转移到组分转移柱上之后，溶剂输送泵6停止 供液，样品组分停留在组分转移柱上等待分离。
第三步，如附图lc所示，第二维分离。当第一维分离完成后，同时切 换十通阀和六通阀，使组分转移柱上保留的组分进入第二维分析柱进行分 离，同一检测器继续记录第二维分离结果。此时，第一维柱平衡柱系统。
这样，复杂样品中的亲水性组分和疏水性组分依次在相应的色谱柱上 进行分离，并将结果记录于同一检测器上。通过商品化高效液相色谱仪的 系统控制器，全部过程可以自动完成，并可以实现批量分析。
这一方法尤其适合于与质谱联用。对于生物样品、体液、天然产物萃 取液、环境样品等包含大量信息的典型复杂样品，质谱可以进一步提供更 高的峰容量和分辨率。如附图2所示，当与质谱联用时，第二维柱后需加 装分流装置12以满足质谱分析对流量的要求。其它操作流程如上所述。
实施例l:单柱分离条件优化
配制含25个组分的标准样品混合溶液，其中包括12种亲水性样品(尿 嘧啶、尿苷、假尿苷、盐酸巴马汀、尼古丁、 pr叩arolol、 atenolol、对
氯苯甲酸、对羟基苯甲酸、马尿酸、异烟酸、Trp-Phe)和13种疏水性样 品(苯、苯酚、2，6-二甲基苯酚、甲苯、邻氯甲苯、1，2，4-三甲苯、联苯、
4-氯代联苯、萘、2，3-二甲萘、苊、芘、荧蒽)。
分别用单根色谱柱对该混合标样进行分离。
HILIC柱分离条件如下:Atlantis HILIC Silica色谱柱(3 Wn， 2.1 X150 mm)， A相lOOmM NHX00H水溶液，B相乙腈。梯度洗脱(93XB相 保持8min，然后在12min内降至85% B，保持5 min)。流速0. 25 mL/min， 检测波长254 nm。分离谱图见附图3。
RP柱分离条件如下Hypersil 0DS2色谱柱(5 Mm， 4.6 X150mm)， A相20 mM TEAP水溶液(用三乙胺将20rnM磷酸水溶液的pH值调至4. 0)， B相乙腈。梯度洗脱(60y。B相保持5min，然后在20min内升至80% B)。 流速1 mL/min，检测波长254 nm。分离谱图见附图4。
对于全部25种组分，单根柱无法实现全分离。
实施例2组分转移柱的捕集能力考察
以HILIC柱为第一维分析柱，根据单柱分离谱图，确定十通阀切换时间 为2.7min，此时HILIC柱上无保留的组分全部流出。组分转移柱采用与第 二维分析柱内径和填料相同的C18色谱柱(柱长50 mm)，用于疏水性样品 在两维间的转移。为考察组分转移柱对此部分组分的捕集能力，在六通阀5 号位连接检测器，观察是否有组分流出。流路中与P5相连的混合器体积为 2.6 mL， P5流量设为0.75 mL/min，因此，从十通阀切换开始计时，经过 3.5min，混合器中的残留组分将被全部冲至组分转移柱上。如果此柱不能 完全捕集组分，在6.2min之内会观察到峰信号。如附图5所示，在30 min 内没有观察到峰，说明该柱能够完全捕集第一维流出的组分。
实施例3用依次分离流路方法分离该混合标样。
根据单根柱分离优化结果，设定分析条件如下。流路如附图1所示。第 一维用HILIC柱，流动相条件与实施例l相同。第二维用RP柱，流动相与 实施例1相同，但梯度与实施例1相比，延迟6. 2 min。设定泵5流速为 0.75mL/min，流动相为含5%乙腈的水溶液。十通阀切换时间为2. 7 min; 6.2 min时停溶剂输送泵6;第一维分离结束，十通阀和六通阀同时切换时 间为30min。 UV检测器采用常规检测池，检测波长为254 nm。如附图6所 示，亲水性组分和疏水性组分依次得到分离，分离结果记录于同一色谱图 中。
实施例4依次分离流路与质谱联用分析忍冬提取液。 第一维分析柱采用内径为2. 1 mm的亲水反应色谱(如HILIC Si)柱， 用于亲水性组分的分离；第二维采用内径为4.6 mm的反相(如C18)色谱 分析柱，用于疏水性组分的分离；组分转移柱采用与第二维分析柱内径和 填料类型相同的色谱柱，用于疏水性样品在两维间的转移。通过在第二维 柱后加装分流装置，即可以实现与质谱在线联用，进一步增加峰容量和分 辨率。
流路如附图2所示，串联UV检测器和质谱。柱配置和液相色谱条件如 上。第二维柱后分流比为1 : 4，这样，第一维进入质谱流速为250叱/min， 第二维进入质谱流速为200 A/min。质谱釆用ESI离子源，负离子模式。
单根柱分别分离样品和采用依次分离方法分离样品的紫外检测色谱图见附 图7，对应的总离子流图见附图8。
实施例5自动批次分离样品能力及分离重现性的考察 通过系统控制器，在室温下对该混合标样进行连续自动进样分析。考察 6次进样所有25种组分的保留时间和峰面积的重现性。结果如附表1所示， 保留时间的相对标准偏差(RSD， ％)为0.01-0. 43%，峰面积的相对标准偏 差(RSD， ％)为O. 17-4. 19%。结果表明，该方法可同时满足复杂样品组分 定性定量分析的要求。
表l. 25种组分的分析重现性(n=6)
RSD (%)保留时间(t)峰面积(Area)
尿嘧啶0. 120. 30
尿苷0.220.52
对羟基苯甲酸0. 280. 51
对氯苯甲酸0, 142. 46
假尿苷0. 431. 69
巴马汀0. 301.57
propanolol0. 224. 19
尼古丁0. 380. 35
马尿酸0.100. 55
Trp-Phe0.193.00
异烟酸0. 150. 38
atenolol0. 060.31
苯酚0.010. 29
2,6-二甲基苯酚0. 021. 77
苯0. 021. 23
甲苯0. 031.28
萘0. 041. 72
邻氯甲苯0. 041.37
联苯0. 060. 58
1,2，4陽三甲苯0. 060. 66
'苊0.070. 76
2，3-二甲萘0. 070. 17
4-氯代联苯0. 080. 24
荧蒽0. 092. 80
芘0. 091.48
权利要求
1.一种二维高效液相色谱装置，其特征在于由五个高压液相色谱溶剂输送泵、一个溶剂混合器、一个十通阀、一个六通阀、两根分别适用于疏水性组分和亲水性组分分离的液相色谱分析柱和一根组分转移柱构成；第一维高压梯度溶剂输送泵(1)和自动进样器(2)、第一维分析柱(3)依次连接，第一维分析柱(3)后接十通阀(4)的⑥位；十通阀(4)的⑦位与②位、④位与⑩位分别连通，③位接混合器(5)的一个入口，混合器(5)的另一个入口接一个溶剂输送泵(6)，混合器(5)的出口接六通阀(7)的⑥位，六通阀(7)的①位和④位接组分转移柱(8)，②位和③位分别接第二维分析柱(9)和第二维高压梯度溶剂输送泵(10)，六通阀(7)的⑤位为废液出口，第二维分析柱(9)后接十通阀(4)的①位，十通阀(4)的⑤位接检测器(11)，⑧位为废液出口，⑨位堵死。
2. 按照权利1所述的二维高效液相色谱装置，其特征在于当检测器 (11)为有流量限制的检测器时，在第二维分析柱(9)与十通阀(4)的①位之间的连接管路上设有分流装置(12)，其分流支路与外管路相通。
3. 按照权利要求1所述二维高效液相色谱装置，其特征在于第一维 分析柱采用内径为2.1mm的亲水反应色谱柱，用于亲水性组分的分离；第 二维采用内径为4.6mm的反相色谱分析柱，用于疏水性组分的分离；组分 转移柱采用与第二维分析柱内径和填料相同的色谱柱，用于疏水性样品在 两维间的转移。
4. 按照权利要求1所述二维高效液相色谱装置，其特征在于第一维 中的色谱分析柱可以是性能类似的所有亲水反应色谱柱；第二维中的色谱 分析柱可以是性能类似的所有反相色谱柱。
5. —种权利要求l所述二维高效液相色谱装置的应用，其特征在于: 所述二维高效液相色谱系统用于依次分离检测复杂体系样品中不同疏水性 的小分子组分，即依次分析其中亲水性组分和疏水性组分。
6. 按照权利要求5所述二维高效液相色谱装置的应用，其特征在于所述复杂体系样品为生物样品、环境样品、天然产物提取液或体液。
7. 按照权利要求5所述二维高效液相色谱装置的应用，其特征在于 所述小分子组分是指复杂体系样品中分子量小于1000的非挥发性小分子物 质。
全文摘要
本发明涉及高效液相色谱，具体地说是一种二维高效液相色谱装置及其通过同一检测器依次检测复杂体系样品中不同疏水性小分子组分的二维高效液相色谱方法，由五个高压液相色谱溶剂输送泵、一个溶剂混合器、一个十通阀、一个六通阀、两根分别适用于疏水性组分和亲水性组分分离的液相色谱分析柱和一根组分转移柱构成；本发明系统适用于复杂体系样品中多种不同疏水性小分子组分的分离检测，应用时操作简便，普适性强，灵活性好，可以采用质谱、蒸发光散射等特殊检测器，进一步提高分析的分辨率，增加峰容量和选择性；非常有利于代谢组学、系统生物学等目前热点研究领域所关注的具有重要意义的非挥发性小分子物质的分离分析，提供更全面的样品信息。
文档编号G01N30/02GK101169392SQ200610134028
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月25日 优先权日2006年10月25日
发明者媛 王, 许国旺 申请人:中国科学院大连化学物理研究所