专利名称：扶正化瘀植物药中五味子原料指纹图谱质量控制方法
技术领域：
本发明属五味子原料质量控制方法领域，特别是涉及一种扶正化瘀植物药中五味子原料指纹图谱质量控制方法。
背景技术：
五味子(Fructus Schisandrae chinensis)为木兰科(Magnoliaceae)五味子属植物五味子[Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.]的干燥成熟果实。五味子又名乌梅子、山花椒、软枣子，因其具有甘、酸、辛、苦、咸五味而得名，最早载于《神农本草经》，并被列为上品，《图经本草》中也有记载。
《中国植物志》描述五味子为落叶木质藤本，除幼叶背面被柔毛及芽鳞具缘毛外余无毛。花多为单性，花单生或丛生叶腋，雄花花梗长5-25毫米，花被粉白色或粉红色，6～9片；雄蕊长约2毫米，花药长约1.5毫米，无花丝或外3枚雄蕊具极短花丝，药隔凹入或稍凸出钝尖头，雄蕊5(6)枚，互相靠贴，直立排列于长约0.5毫米的柱状花托的顶端，形成近倒卵圆形雄蕊群；雌花花梗长17-38毫米，花被片和雄花相似，雌蕊群椭圆形，长2-4毫米，离生心皮17～40。聚合果长1.5-8.5厘米，聚合果柄长1.5-6.5厘米；小浆果近球形或倒卵圆形，成熟时红色。种子1～2，肾形，淡褐色有光泽。花期5～7月，果期7～10月。
五味子自然生长于海拔1700m以下的沟谷、山坡、林缘及溪旁灌木中。分布于东北、华北、内蒙古、宁夏及河南等地。在温带、暖温带或亚热带山地皆有分布。喜阴凉湿润气候，喜光照，耐寒，不耐水浸，需适度隐蔽，幼苗期尤忌烈日照射。以选疏松、肥沃、富含腐殖质的微酸性或中性壤土栽培为宜。适宜生长的气候条件一般为年均气温0～14℃，年降雨量500～1000毫米，最冷月均温-3℃～-22℃，最热月均温20℃～28℃。
五味子当前野生与人工栽培并存，主产于东北、河北、山西、陕西、宁夏、山东及内蒙古等省区。
五味子主要以果实入药，《中国药典》记载五味子药材呈不规则的球形或扁球形，直径5～8mm。表面红色、紫红色或暗红色，皱缩，显油润，果肉柔软，有的表面呈黑红色或出现“白霜”。种子1～2，肾形，表面棕黄色，有光泽，种皮薄而脆。果肉气微，味酸；种子破碎后，有香气，味辛，微苦。
五味子以果实和种子入药，有效成分为木脂素类化合物，还含有萜类、有机酸等化学成分。主要成分分述如下
a.木脂素类化合物目前，已从五味子属植物中分离出40余种木脂素化合物单体，其中五味子中含有32种。在这40余种化合物中，已发现有明确药理作用的有10种，五味子中有其中的7种，分别为五味子甲素(Schizandrin A)、五味子乙素(Schizandrin B)、五味子丙素(Schizandrin C)、五味子醇甲(Schizandrol A)、五味子醇乙(Schizandrol B)、五味子酯甲(Schisantherin A)和五味子酯乙(Schisantherin B)，均属于木脂素成分中的联苯环辛烯类。以及五味子酚、表-加巴辛、安五脂素、6-O-苯甲酰戈米辛O、戈米辛N、白芷酰基戈米辛H。
木脂素类中生理活性研究较多的是对肝脏有作用的成分。对五味子7种有效成分药理研究和临床证明，均有降低肝炎患者血清谷丙转氨酶水平的作用，其中以五味子酯乙作用最强，其次为醇乙、丙素、乙素、甲素、酯甲和醇甲。五味子降酶机理主要是对肝细胞的保护作用，能促进损伤肝细胞的修复或抑制肝细胞病变，使细胞膜发生某种机能性改变，通透性降低，从而使漏到血浆中的转氨酶减少，对转氨酶的合成并无抑制作用。此外，还发现五味子木脂素成分具有抗氧化作用，以五味子乙素的抗氧化活性最强。
b.萜类化合物萜类化合物主要存在于五味子的挥发油中，五味子茎叶、果实和种子均含有丰富的挥发油。秦波等人从五味子的挥发油中鉴定出32个组分，主要是单萜类、含氧单萜类、倍半萜类和含氧倍半萜类，其中以倍半萜类物质最多。柯铭清报道五味子挥发油具镇咳功效，其效力是可待因的75％c.其他成分五味子果实含有柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸等多种有机酸，有明显的祛痰作用。此外，在五味子果实中还发现了甾醇，维生素C、E，树脂，鞣质及铁、锰、硅、磷等矿物质。北五味子干燥成熟果实中还含有葡萄糖等7种单糖、17种氨基酸及16种微量元素，具有抗衰老作用。
五味子的有效成分木脂素类化合物主要来源于五味子的果实和种子，传统的提取方法有醇提取、氯仿提取和水提取等溶剂提取法。近几年法多索溶剂系统提取，超临界CO2提取技术以及微波辅助提取方法。刘本等[2]进行了以法多索溶剂提取五味子中五味子甲素的研究，并与10％甲醇调节的超临界CO2的提取率进行比较。与10％甲醇调节的超临界CO2的提取率相比较，法多索溶剂可得到约94％的提取回收率。周庆华[3]，杨苏蓓[4]，向智敏等[5]皆考察了超临界CO2提取方法对提取效率，并对提取条件进行了优化。黄惠华等[6]研究了五味子果实中五味子醇甲的微波辅助提取方法，考察了各种提取条件，得到了最佳的微波辅助提取工艺。其他提取方法如渗漉法，超声法也有相关报道。
五味子木脂素类化学成分的分离检测方法主要有分光光度法[7]~[11]，高效液相色谱法[12]~[22]，薄层色谱法[23]~[24]，其中应用最多的分析方法是高效液相色谱法。另外有文献[25]报道了应用GC-MS法以及CEC法对五味子木脂素类化学成分的分离检测。在中国药典(2005)规定了五味子醇甲的HPLC的测定方法。
关于五味子指纹图谱研究，陈洪轩等人[26]，施佳平[27]，冯雪松等人[28]，殷放宙等人[29]皆对五味子醇溶性成分的指纹图谱进行了研究，并以木脂素类成分五味子醇甲，五味子甲素，五味子乙素为对照品。而李延利等人[30]，冯伟等人[31]对五味子水溶性成分的指纹图谱进行了研究。范卓文等人[32]则考察了五味子药材不同提取方法的指纹图谱，五味子药材分别经氯仿，甲醇，乙醇，50％乙醇，水提取以及CO2超临界萃取。
目前关于五味子的质量控制主要是单个或某几个成分为主，不能反应药材的整体特征，指纹图谱提供了这样一个方法，将常规的单一指标成分或活性成分为质量控制的指标提升到一个新的阶段，用色谱的指纹特征，和通过指纹图谱得到的量化参数，更有效地鉴别真伪，控制质量。
关于五味子药材的指纹图谱也有一些研究报道，但都不是很完善，没有应用于生产中药材的质量控制。同时根据五味子现有的化学成分和药理临床研究资料，以及扶正化瘀药理研究以有效成分的研究成果，确定需要表征的活性部位和主要活性成分为木脂素类，因此要求能全面地体现五味子药材中木脂素类成分的整体特征。采用液质联用技术对指纹图谱中的主要色谱峰进行了归属，保证了五味子中有效成分在指纹图谱中被充分体现。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种扶正化瘀植物药制剂中五味子原料指纹图谱质量控制方法，该方法能全面控制原料药材的质量，确保产品的质量稳定。
本发明的技术方案如下一种扶正化瘀植物药中五味子原料指纹图谱质量控制方法，包括下列步骤(1)提取五味子供试品称取0.5g五味子药材粉末，加入20ml 80％甲醇，称定重量，超声提取20-50min，补足所失重量，经0.23-0.45μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液；(2)梯度洗脱流动相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，水和乙腈为流动相进行洗脱流动相，色谱柱为Eclipse；流动相A相为水，B相为乙腈；梯度洗脱0-40min，40-80％B；流速0.8-1.2ml/min；检测波长210-280nm；柱温20-40℃；进样量10-20ul。
梯度洗脱条件为
(3)标准指纹图谱的建立选取10批不同批号的样品，进行高效液相色谱指纹图谱分析。对合适样品的HPLC指纹图谱中所有峰进行比较，确定了10个共有峰，并按出峰时间先后次序进行编号(图1)。
在共有峰里选取了7个特征峰，分别为1号峰五味子醇甲、3号峰五味子醇乙、4号峰戈米辛N/异构体、6号峰五味子甲素、7号峰、和8号峰戈米辛N/异构体、9号峰五味子乙素。其中五味子乙素是一个重要活性成分。
根据LC-MS-MS的鉴定结果，五味子的高效液相色谱指纹图谱表达了木脂素的分布特性。选取含量较高的五味子醇甲作为指标成分峰。
经过对辽宁、黑龙江、吉林多个产地十批样品的五味子药材指纹图谱的研究，按照以下原则选取一批五味子药材的指纹图谱作为对照指纹图谱(图1)结合药效实验情况，优先考虑确定疗效的药材的指纹图谱。将指纹图谱和定量测定结果进行对照比较，剔除特别不合理的样品，优先考虑含量在平均值附近的样品的指纹图谱。结合指纹图谱和定量结果，选取特征峰分离较好，峰的保留时间和峰高适宜、峰型(峰的形状和峰高比例)较典型的指纹图谱。优先选取基线平稳、信噪比好的指纹图谱；(4)指纹图谱的质量控制A.样品真伪的鉴别根据公式计算十批药材指纹图谱中各特征峰的相对保留时间RRT(RRT＝特征峰的保留时间/指标峰的保留时间)，结合两个实验室的验证结果，确定了各特征峰的相对保留时间和范围(表1)。
6个指纹图谱鉴别峰相对保留时间五味子醇甲1.00、五味子醇乙1.25、五味子素N/异构体1.63、五味子甲素1.88、五味子素N/异构体3.18、五味子乙素3.27。
表1 五味子药材HPLC指纹图谱鉴别峰相对保留时间及范围
根据实验条件对待测样品进行测定，得出样品的HPLC色谱图，计算各特征峰的相对保留时间，并与所列对照指纹图谱和相对保留时间表进行比较。如各特征峰均存在，而且相对保留时间(RRT)吻合，则可确定为该原料。
B.样品质量评价采用中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件(国家药典委员会)，将样品的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱(或对照品共有模式指纹图谱)进行比较。以10个共有峰计算得到的相似度应不得小于0.9。
表2 特征峰的相对保留时间与相对峰面积
*RRT(相对保留时间)＝特征峰的保留时间/指标峰的保留时间*RPA(相对峰面积)＝特征峰的峰面积/指标峰的峰面积
所述步骤2色谱柱为Eclipse(150×4.6mm，5μm)；流速1.0ml/min；检测波长254nm；柱温35℃；进样量20ul。
所述步骤4在指纹图谱测定条件确定后，通过对至少三批样品进行测定，计算相关参数，并在此基础上提出高效液相色谱系统的适用参数条件。即五味子醇甲对照品溶液(100μg/ml)的色谱峰面积重现性(RSD)不高于3％，保留时间重现性(RSD)不高于2％；五味子醇甲和相邻峰的分离度不小于1.0；色谱柱柱效以五味子醇甲计不少于30,000块理论塔板数。
本发明的另一技术方案如下一种扶正化瘀植物药中五味子原料的种植采收方法，包括下列步骤(1)五味子药材的规范化种植东北五味子翌年春季(4月上旬)，取出放在室温15-20℃左右的室中催芽，几天后种子裂口，胚芽刚刚露出，即可播种。起苗时要从苗床的一端开始，用尖锹沿要系层下面将苗起出。一般在4月下旬至5月上旬移栽；春节为防春旱，一般一周喷灌一次(视土壤熵情而定)。追肥原则是以腐熟的农家肥为主，辅以化肥。五味子枝条春、夏、秋三季均可修剪。五味子是藤本植物，不能独立生长，移植后第二年即应搭架。
(2)五味子药材的规范化采收五味子秋季收获，在秋季(一般在每年9月初至霜降前后)果实变软而富有弹性，外观呈红色或紫红色时，适时采收。采收在晴天或阴天，用枝剪沿果穗根部剪下，放入干净的筐中。晒干或阴干。若收获量大或遇雨天可用微火烘，采收回的果穗放在果栈上，清除枝叶、果梗及其他杂质。将果栈放入烘中的架子上，加温至50℃左右，烘至半干左右时降温至30℃左右，当达到八成干时(水分含量25％左右)，将五味子挪到室外晒至全干。
本发明的有益效果如下1、五味子药材的指纹图谱能全面地体现五味子药材中木脂素类成分的整体特征。采用液质联用技术对指纹图谱中的主要色谱峰进行了归属，保证了五味子中有效成分在指纹图谱中被充分体现。
2、考察了供试品溶液的稳定性，结果表明，在室温下，24小时之内，五味子供试品溶液保持稳定。同时考察公司贮藏的样品在1年内的稳定性，发现相似度大于0.9。精密度和重复性试验，都表明相似度在0.99以上。
3、将指纹图谱与药材GAP基地的建设结合起来，在药材生产中就开始控制药材的质量，这样保证了指纹图谱的实施，指导GAP基地的建设，并真正运用于药材质量控制。
4、经过对东北五味子药材基地十批五味子药材的指纹图谱相似度进行计算，发现药材相似度大于0.9-1.0之间。说明建立的五味子指纹图谱质控方法，灵敏度高，重复性好，专属性强，操作简便，方法可靠，可以五味子质量进行科学，有效的评价证实能够运用于实际生产中质量控制，满足药材鉴别和质量控制的需求。
5.药材质量的稳定，同时也保证的扶正化瘀制剂质量的稳定可控。
图1典型的五味子高效液相色谱指纹图谱图2五味子样品的指纹图谱
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1五味子药材中国东北(10批)仪器
称取0.5g五味子药材粉末，加入20ml 80％甲醇，称定重量，超声提取50min，补足所失重量，经0.45μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。色谱条件柱温35℃，检测波长254nm，进样量20μl，色谱柱Eclipse(150×4.6mm，5μm)，洗脱条件(见表1)表1 洗脱条件
在指纹图谱测定条件确定后，通过对至少三批样品进行测定，计算相关参数，并在此基础上提出高效液相色谱系统的适用参数条件。即五味子醇甲对照品溶液(100μg/ml)的色谱峰面积重现性(RSD)不高于3％，保留时间重现性(RSD)不高于2％；五味子醇甲和相邻峰的分离度不小于1.0；色谱柱柱效以五味子醇甲计不少于15,000块理论塔板数。
通过对十批五味子药材的相似度进行计算，发现药材相似度大于0.9-1.0之间。说明建立的五味子指纹图谱质控方法，操作简便，方法可靠，证实能够运用于实际生产中质量控制，满足药材鉴别和质量控制的需求。
一批五味子药材样品指纹图谱图见图2，特征峰的相对保留时间与相对峰面积见表2。
权利要求
1.一种扶正化瘀植物药中五味子原料指纹图谱质量控制方法，包括下列步骤(1)提取五味子称取0.5g五味子药材粉末，加入20ml 80％甲醇，称定重量，超声提取20-50min，补足所失重量，经0.23-0.45μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液；(2)梯度洗脱流动相用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，水和乙腈为流动相进行梯度洗脱，色谱柱为Eclipse；流动相A相为水，B相为乙腈；梯度洗脱0-40min，60-20％A，40-80％B；流速0.8-1.2ml/min；检测波长210-280nm；柱温20-40℃；进样量10-20ul；(3)标准指纹图谱的建立确定了10个共有峰，选取了7个特征峰，为1号峰五味子醇甲、3号峰五味子醇乙、4号峰戈米辛N/异构体、6号峰五味子甲素、7号峰、和8号峰戈米辛N/异构体、9号峰五味子乙素，其中五味子乙素是一个重要活性成分；选取含量较高的五味子醇甲作为指标成分峰；优先考虑确定疗效的药材的指纹图谱。优先考虑含量在平均值附近的样品的指纹图谱。结合指纹图谱和定量结果，选取特征峰分离较好，峰的保留时间和峰高适宜、峰型较典型的指纹图谱。优先选取基线平稳、信噪比好的指纹图谱；(4)指纹图谱的质量控制a.样品真伪的鉴别
6个指纹图谱鉴别峰相对保留时间五味子醇甲1.00、五味子醇乙1.25、戈米辛N/异构体1.63、五味子甲素1.88、戈米辛N/异构体3.18、五味子乙素3.27；b.样品质量评价将样品的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱比较。以共有峰计算得到的相似度应不得小于0.9。
2.根据权利要求1所述的扶正化瘀植物药中五味子原料指纹图谱质量控制方法，其特征在于所述步骤2色谱柱为Eclipse(150×4.6mm，5μm)；流速1.0ml/min；检测波长254nm；柱温35℃；进样量10-20ul。
3.根据权利要求1所述的扶正化瘀植物药中五味子原料指纹图谱质量控制方法，其特征在于所述步骤4在指纹图谱测定条件确定后，通过对至少三批样品进行测定，五味子醇甲对照品溶液(100μg/ml)的色谱峰面积重现性(RSD)不高于3％，保留时间重现性(RSD)不高于2％；五味子醇甲和相邻峰的分离度不小于1.0；色谱柱柱效以五味子醇甲计不少于30,000块理论塔板数。
4.根据权利要求1所述的扶正化瘀植物药中五味子原料指纹图谱质量控制方法，其特征在于所述的五味子种植采收方法，包括下列步骤(1)五味子药材的规范化种植东北五味子翌年春季4月上旬，取出放在室温15-20℃左右的室中催芽，种子裂口，胚芽露出即可播种，起苗时要从苗床的一端开始，用尖锹沿要系层下面将苗起出，在4月下旬至5月上旬移栽；春季一周喷灌一次，农家肥为主辅以化肥。枝条春、夏、秋三季均修剪，移植后第二年应搭架；(2)五味子药材的规范化采收五味子秋季采收在晴天或阴天，用枝剪沿果穗根部剪下，晒干或阴干；采收回的果穗放在果栈上，放入烘中的架子上，加温至50℃烘至半干左右时降温至30℃，达水分含量25％时室外晒至全干。
全文摘要
本发明涉及扶正化瘀植物药中五味子原料指纹图谱质量控制方法，包括(1)取0.5g五味子，超声提取50min过滤；(2)梯度洗脱流动相色谱柱为Eclipse；0－40min，60－20％A，40－80％B；流速0.8－1.2ml/min；波长210－280nm，柱温20－40℃；进样量10－20ul；(3)标准指纹图谱的建立1号峰五味子醇甲、3号峰五味子醇乙、4号峰戈米辛N/异构体、6号峰五味子甲素、7号峰和8号峰戈米辛N/异构体、9号峰五味子乙素；(4)指纹图谱的质量控制指纹图谱鉴别峰相对保留时间五味子醇甲1.00、五味子醇乙1.25、戈米辛N/异构体1.63、五味子甲素1.88、戈米辛N/异构体3.18、五味子乙素3.27；(5)五味子种植采收方法；本发明能全面控制原料的质量，确保产品的质量稳定。
文档编号G01N30/00GK101040909SQ20071004033
公开日2007年9月26日 申请日期2007年4月29日 优先权日2007年4月29日
发明者胡坪, 潘一峰 申请人:上海现代中医药技术发展有限公司