专利名称：一种香菇507菌种aflp快速检测方法
技术领域：
本发明属于检测方法领域，具体涉及一种香菇507菌种AFLP快速检测方法背景技术我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2005年的242万吨，占全球香菇总产量的70％以上，改写了世界食用菌产量的排行榜，并不断缩小与排行第一的双孢蘑菇产量差距，有专家预测，由于中国香菇产业的迅猛发展，在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度，优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目，中国香菇已风靡世界。
优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言，香菇栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国香菇的快速发展；而且，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对香菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。
近年来，DNA指纹技术的迅速发展为在DNA分子水平上鉴定香菇菌种提供了崭新的手段。其中AFLP(Amplified FragmentLength Polymorphism)技术为新发展起来的被认为是最有效的分子标记方法。AFLP分析的基本原理是选择性扩增基因组DNA酶切片段。由于不同基因组DNA的酶切位点存在差异，因而产生了扩增片段长度的多态性。用AFLP方法得到的指纹图谱具有稳定可靠且多态性丰富等优点，非常适合于菌种鉴定等方面的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能简便、快速、准确地对香菇507菌种进行鉴定的AFLP快速检测方法。
一种香菇507菌种AFLP快速检测方法包括下列步骤(1)菌丝培养和基因组DNA的提取采用PDY液体培养基摇瓶培养香菇菌丝，滤膜过滤收集菌丝。采用CTAB法提取DNA。
(2)DNA双酶切对样品DNA进行MseI和EcoRI的双酶切。
(3)DNA片断接头的连接接头使用MseI adapter与EcoRI adapter。
(4)DNA酶切产物的预扩增预扩增的专用引物，是根据MseI和EcoRI酶切位点而设计的，序列分别为E00GAC TGC GTA CCA ATT CM00GAT GAG TCC TGA GTA A(5)AFLP的选择性扩增预扩增产物稀释20倍，作为选择性扩增的模板。PCR扩增体系(总体积10μl)ddH2O4.7μl10×PCR Buffer1.0μl25mmol/L MgCl20.8μl10mmol/L dNTP 0.2μl50ng/μL MseI 17引物 0.3μl50ng/μL EcoRI 11引物 0.3μl5U/μL Taq DNA酶 0.2μl预扩增产物稀释液 2.5μlMse1 17和EcoRI 11引物是在引物M00和E00基础上设计的，序列如下EcoRI 11GAT GAG TCC TGA GTAACGMse1 17GAC TGC GTA CCAATT CACPCR反应条件94℃ 2min，95℃ 20s，66℃ 30s(每个循环降低1℃)30s，72℃ 2min，10cycles，；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，25cycles；72℃ 10min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，用VDS摄影系统观察结果，用于毛细管电泳检测。
(6)遗传分析仪检测选择性扩增的AFLP产物在CEQTM8000遗传分析仪器进行毛细管电泳检测，每个反应孔加入0.5μl扩增产物，30μl上样缓冲液和0.3μl标准分子量，上机检测。
对114(为生产用种)个收集自全国各地的香菇生产用菌种及少数野生种共164个菌株实验，只有香菇507菌株能扩增检测出分子量为171bp的特殊DNA条带(图1)该检测方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点。该检测所需时间只需要4-5天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间；该方法采用毛细管电泳技术进行扩增条带的分离结合荧光信号检测该方法与传统检测技术相比，具有准确性、重复性好的特点。
图1采用专用507 AFLP检测引物对香菇菌株进行AFLP检测所得图谱箭头标注的为171bp的特殊条带。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例菌丝培养和基因组DNA的提取采用PDY液体培养基(马铃薯20％，葡萄糖2％，酵母提取物0.1％)，150rpm，25℃15天摇瓶培养香菇507菌株菌丝。滤膜过滤收集菌丝，并用无菌水冲洗两次，滤纸吸干后贴上标签放入-20℃冰箱保存备用。DNA提取采用CTAB法，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，用紫外分光光度仪BECKMAN DU 640测量DNA的浓度和相对纯度，并调整所有样品DNA浓度到100ng/ul。
DNA双酶切对样品DNA进行MseI和EcoRI的双酶切。DNA样品酶切体系包括(总体积20μl)ddH2O14.8μl10×Buffer 2.0μl10U/μl MseI 0.25μl10U/μl EcoRI0.25μl100×BSA 0.2μl100ng/μl模板DNA 2.5μl37℃酶切3小时，65℃处理10min。
DNA片段接头的连接酶切完成的每个DNA样品，加入5μL如下的反应液，16℃连接过夜。
ddH2O 0.85μlBuffer2.5μl25uM MseI adapter 1.0μl5uM EcoRI adapter 0.5μl3U/μl T4-DNA连接酶 0.15μlDNA酶切产物的预扩增PCR扩增体系(总体积20μl)ddH，O14μl10×PCR Buffer 2.0μl25mmol/L MgCl2 1.2μl10mmol/L dNTP 0.4μl50ng/μ L M00 0.6μl50ng/μL E00 0.6μl5U/L Taq DNA酶0.2μl酶连产物 1μlM00和E00为专用引物，是根据MseI和EcoR I酶切位点而设计的，序列分别为E00GAC TGC GTA CCA ATT CM00GAT GAG TCC TGA GTA APCR反应条件72℃ 5min；94℃ 1min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，20cycles；72℃ 5min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，用VDS摄影系统观察并记录结果。4℃保存备用。
AFLP的选择性扩增预扩增产物稀释20倍，作为选择性扩增的模板。PCR扩增体系(总体积10μl)ddH2O 4.7μl10×PCR Buffer 1.0μl25mmol/L MgCl2 0.8μl10mmol/L dNTP 0.2μl50ng/μL MseI 17引物0.3μl50ng/L EcoRI 11引物 0.3μl
5U/μL Taq DNA酶 0.2μl预扩增产物稀释液 2.5μlMse1 17和EcoRI 11引物是在引物M00和E00基础上设计的，序列如下EcoRI 11GAT GAG TCC TGA GTA ACGMse1 17GAC TGC GTA CCA ATT CACPCR反应条件94℃ 2min，95℃ 20s，66℃ 30s(每个循环降低1℃)30s，72℃ 2min，10cycles，；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，25 cycles；72℃ 10min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，用VDS摄影系统观察结果，用于毛细管电泳检测。
遗传分析仪检测选择性扩增的AFLP产物在CEQTM 8000遗传分析仪器进行毛细管电泳检测，每个反应孔加入0.5μl扩增产物，30μl上样缓冲液和0.3μl标准分子量，上机检测。可扩增检测出分子量为171bp的特殊DNA条带。
权利要求
1.一种香菇507菌种AFLP快速检测方法，包括如下步骤(1)菌丝培养和基因组DNA的提取(2)DNA双酶切对样品DNA进行MseI和EcoRI的双酶切；(3)DNA片断接头的连接接头使用MseI adapter与EcoRI adapter；(4)DNA酶切产物的预扩增预扩增的专用引物，是根据MseI和EcoRI酶切位点而设计的，序列分别为E00GAC TGC GTA CCA ATT CM00GAT GAG TCC TGA GTA A(5)AFLP的选择性扩增预扩增产物稀释20倍，作为选择性扩增的模板。选择性扩增的引物Mse1 17和EcoRI11是在引物M00和E00基础上设计的序列如下EcoRI 11GAT GAG TCC TGA GTAACGMse1 17GAC TGC GTA CCAATT CAC(6)遗传分析仪检测选择性扩增的AFLP产物在CEQTM8000遗传分析仪器进行毛细管电泳检测，每个反应孔加入0.5μl扩增产物，30μl上样缓冲液和0.3μl标准分子量，上机检测。
2.如权利要求1所述的一种香菇507菌种AFLP快速检测方法，其特征在于步骤(1)所述的菌丝培养和基因组DNA的提取包括下列步骤采用PDY液体培养基(马铃薯20％，葡萄糖2％，酵母提取物0.1％)，150rpm，25℃15天摇瓶培养菌丝；滤膜过滤收集菌丝，并用无菌水冲洗两次，滤纸吸干后贴上标签放入-20℃冰箱保存备用。DNA提取采用CTAB法，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，用紫外分光光度仪BECKMAN DU 640测量DNA的浓度和相对纯度，并调整所有样品DNA浓度到100ng/ul。
3.如权利要求1所述的一种香菇507菌种AFLP快速检测方法，其特征在于步骤(2)所述的DNA双酶切条件为DNA样品酶切体系包括(总体积20μl)ddH2O 14.8μl10×Buffer2.0μl10U/μl MseI 0.25μl10U/μl EcoRI 0.25μl100×BSA 0.2μl100ng/μl 模板DNA2.5μl37℃酶切3小时，65℃处理10min。
4.如权利要求1所述的一种香菇507菌种AFLP快速检测方法，其特征在于步骤(3)所述的DNA片断接头的连接为酶切完成的每个DNA样品，加入5μL如下的反应液，16℃连接过夜ddH2O 0.85μlBuffer 2.5μl25uM MseI adapter1.0μl5uM EcoRI adapter0.5μl3U/μl T4-DNA连接酶 0.15μl
5.如权利要求1所述的一种香菇507菌种AFLP快速检测方法，其特征在于步骤(4)所述的DNA酶切产物的预扩增的扩增体系为(总体积20μl)ddH，O 14μl10×PCR Buffer 2.0μl25mmol/L MgCl21.2μl10mmol/L dNTP0.4μl50ng/μL M000.6μl50ng/μL E000.6μl5U/μL Taq DNA酶 0.2μl酶连产物 1μlPCR反应条件72℃5min；94℃1min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，20cycles；72℃5min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，用VDS摄影系统观察并记录结果。4℃保存备用。
6.如权利要求1所述的一种香菇507菌种AFLP快速检测方法，其特征在于步骤(5)所述的AFLP的选择性扩增PCR扩增体系(总体积10μl)ddH2O 4.7μl10×PCR Buffer 1.0μl25mmol/L MgCl20.8μl10mmol/L dNTP0.2μl50ng/μL MseI 17引物 0.3μl50ng/μL EcoRI 11引物0.3μl5U/μL Taq DNA酶0.2μl预扩增产物稀释液2.5μlPCR反应条件94℃2min，95℃20s，66℃30s(每个循环降低1℃)30s，72℃2min，10cycles，；94℃30s，56℃30s，72℃2min，25cycles；72℃10min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，用VDS摄影系统观察结果，用于毛细管电泳检测。
7.如权利要求1所述的一种香菇507菌种AFLP快速检测方法，其特征在于香菇507菌种能扩增检测出分子量为17lbp的特殊DNA条带。
全文摘要
本发明公开了一种能简便、快速、准确地对香菇507菌种进行鉴定的AFLP快速检测方法。包括步骤菌丝培养和基因组DNA的提取；DNA的MseI和EcoRI双酶切；DNA片断使用MseI adapter与EcoRI adapter进行连接；DNA酶切产物的预扩增；AFLP的选择性扩增；遗传分析仪检测。
文档编号G01N27/447GK101041859SQ20071004032
公开日2007年9月26日 申请日期2007年4月29日 优先权日2007年4月29日
发明者陈明杰, 谭琦, 尚晓冬, 宋春艳, 卓英, 潘迎捷 申请人:上海市农业科学院食用菌研究所