专利名称：一种同时提取堆肥样品中plfa和dna的方法
技术领域：
本发明涉及堆肥样品中微生物的PLFA和DNA的混合提取方法。
技术背景微生物是堆肥化处理的重要因素，要使其更有效的降解有机物以控制堆肥过程，提 高堆肥效率，研究堆肥过程中各种微生物的数量、组成及其相互作用进行了解是有必要 的。由于大部分环境微生物都处于存活不可培养状态，使得了解微生物实际群落结构比 较困难。近年来核酸分析和脂质分析都力图克服这一难点，这些方法都具有能从环境样 品中直接提取活的细胞组分以用于分析的优点。PLFA(Phospholipid fatty acid)谱图分析法是生物化学方法的代表。磷脂是构成活体细 胞膜的重要组成部分，不同的微生物具有不同的PLFA种类和数量。PLFA分子中的首官 能团和侧链通常因微生物的类型异而异，因此每种样品具有独特的PLFA谱图，不同菌 种的PLFA谱图不同，在高度专一性基础上具有多样性，可以作为微生物群中不同群体 的标记物。PLFA谱图发生变化更多的是源于样品中的微生物的组成和生物量发生变化， 生物体内细胞中的磷脂含量通常可认为是相对显著恒定的。由于PLFA谱图分析法能较 完整提供活微生物的生物量信息及PLFA分子隐含微生物类型信息，PLFA谱图分析法通 常用于估算微生物生物量和确定微生物的群落组成。DNA的提取是分子生态学研究的基 础工作。不同的微生物种群有不同的DNA序列或长度，分子量相同的DNA片段其序列 可能不同。从DNA指纹图的变化中可以寻找重要功能菌群的基因组序列信息，结合分子 克隆和探针杂交等手段还可以实现功能菌群的分离，用于研究复杂微生物生态系统的结 构和动态变化，为优化种群结构、调节系统功能和发现新的重要微生物功能类群提供了 可行的途径。在研究堆肥样品这样的复杂微生物群落结构和群落动态时，采用一种方法是不够的。 若将不同方法的组合应用可以取长补短，避免了由于方法原理本身所带来的不可避免的 偏差，因此，将各种方法组合应用已成为分析堆肥微生物群落结构变化的一种趋势，但 是，PLFA法和核酸分析法，都要求从堆肥样品中提取代表生物信息的物质，且提取步骤 都比较繁琐，提取方法的结合为方法的组合应用提供了可能。发明内容本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种能同时提取堆肥样品中PLFA 和DNA的方法，本方法准确、高效，并且所需样品量较少。 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案a. PLFA的提取a-l.称取堆肥样品于试管中，分别加入二氯甲垸、甲醇、磷酸盐缓冲溶液，依次加 入的体积比为l :2:1;a-2.超声匀化后低温避光静置过夜；a-3.将上述试管离心分层，液相转移到新的玻璃管中，加入二氯甲烷和纯水，使得二氯甲垸甲醇磷酸缓冲液的体积比为0.9，用于继续提取PLFA，固相于-20'c下保存以提取DNA;a-4.将上述液相静置24h后，转移水相于新的离心管a中用于沉淀DNA，将有机相 过滤，去除可能残留的颗粒悬浮物，滤液用N2干燥后加正己垸溶解；a-5.将上一步正己烷溶解的脂质过硅胶柱，依次用正己烷、氯仿、丙酮、甲醇洗涤 柱子，收集甲醇洗涤液，N2干燥；a-6.用甲醇和甲苯混合溶液溶解干燥后的脂类物质，所述混合溶液中甲醇甲苯的 体积比为1 : 1，加入KOH溶液水浴加热使其甲酯化，冷却至室温，加入醋酸中和过量 的KOH，摇匀后加氯仿萃取，去水相，再加去离子水洗涤，使得有机相部分的无机物尽可能的溶解在水相，底部有机相为溶解在氯仿中的甲酯化PLFA;b. DNA提取b-l.取步骤a-3中所保存的固相物质，添加磷酸盐缓冲液洗涤去除样品中的腐殖酸； b-2.样品洗涤后添加DNA提取液和蛋白酶(Proteinase)K进行消化，其中，样品量DNA提取液蛋白酶K为lg : lml : 0.005ml;b-3.将上一步所得物质转移至离心管b中，并加入SDS，另外在步骤a-4中的离心管a中也加入SDS，两根离心管同时水浴消化细胞中的蛋白质，然后将含固相的离心管b离心分层；b-4.收集离心管b中的上清，转移到离心管a中，轻微混合；b-5.加入等体积的氯仿和异戊醇混合溶液至离心管a中，所述混合溶液中氯仿异 戊醇的体积比为24:1，轻微颠倒混合后离心，吸取水相转移至新的离心管中； b-6.上一步水相中加入0.6倍体积异丙醇沉淀1 h ，然后离心；b_7.沉淀以冰预冷的乙醇重复洗涤后风干；b-8.加入TE缓冲液溶解DNA并置于-20'C下保存；所述步骤a-4中滤液用N2干燥后加正己烷溶解时可以加一滴二氯甲垸。本发明的优点本发明为同时提取堆肥样品中的PLFA和DNA提供了一种思路，对堆肥微生物群落 分析方法的组合应用产生推动作用。同时从不同的角度对环境微生物群落结构和群落动 态进行分析研究，可以提供更为全面客观的微生物群落组成及变化的信息。核酸与脂质 分析能提供互补信息且每种方法都能证实另一方法的结果。两种方法都依赖于堆肥样品 的直接提取，为了得到更多关于堆肥样品中微生物生态方面的信息，结合这两种方法具 有很大的优势。本发明中提到的混合提取方法使研究者能够从同一空间点堆肥样品中得到的信息量 最大化，简化了堆肥样品脂质和DNA提取的程序，縮短了样品信息提取的时间，保证 了样品信息来源的同一性，较好地减小堆肥取样对检测方法造成的误差。尤其是当样品 量比较少或者取样比较困难的情况下，显得尤为有用。
图1为堆肥样品中PLFA和DNA提取流程图。
具体实施方式
l.PLFA的提取(如图l所示) (l-l)称取5.00g堆肥样品于带聚四氟乙烯盖子的玻璃管中，分别加入5mL二氯甲 烷、lOmL甲醇、5mL磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4， 0.05mol/L); (1-2)超声匀化10min后，在4'C下避光静置过夜；(1-3)离心20min,转速8000rmp。液相转移到新的玻璃管中，再加入5mL二氯甲 烷和4mL纯水，用于继续提取PLFA;固相于-2(TC下保存以提取DNA;(1-4)静置24h后，转移水相于新的离心管a中用于沉淀DNA;有机相用4#纤维 滤膜过滤；滤液用氮吹仪(DC-12型，上海安谱科学仪器有限公司)吹干后加2mL正己 垸溶解(溶解效果不好可以加一滴二氯甲垸)；(1-5)正己垸溶解的脂质过硅胶柱(500mg， 100-200目，沃特世科技(上海)有限 公司)，依次用5mL正己垸、5mL氯仿、5mL丙酮、5mL甲醇洗涤柱子；收集甲醇洗涤 液，用氮吹仪(DC-12型，上海安谱科学仪器有限公司)吹干；(1-6)用0.5mL甲醇-甲苯混合溶液(所述甲醇甲苯的体积比为1 : 1,含内标物 C19:0)溶解吹干的脂类物质，加入0.5mL2.0MKOH， 37°C水浴加热15min;冷却至 室温，加入5mL 0.2M醋酸，摇匀后加2mL氯仿，去水相，加去离子水洗涤后，底部 有机相为溶解在氯仿中的甲酯化PLFA。 2.DNA提取(如图1所示)(2-1)取步骤l-3中所保存的固相物质，添加10mL 120mmol/L的磷酸盐缓冲液 (pH8.0)， 150r/min匀速震荡15min ，然后以4 700 r/min离心10 min，去上清液；(2) 上述洗涤过的沉淀固相物质与4ml的DNA提取液(0.1mol/L Tris-HCl， 0.1 mol/L EDTA， 0.1mol/L磷酸盐(Na3P04) ， 1.5 mol/LNaCl， 1%CTAB (质量百分比)，pH为 8.0)混合，力卩20pl蛋白酶K(10mg/ml，天根生化科技(北京)有限公司)；225rpm37°C 摇床摇动30 min;(3) 将上一步所得物质转移至离心管b中，并加入100nl20。/。SDS(质量百分比)，另 外在离心管a中加入400nl20MSDS (质量百分比)，两根离心管同时在65'C下水浴2h，每 隔10-15min轻轻颠倒，然后含固相的离心管b在4700 r/min下离心10min;(4) 收集离心管b中的上清，转移到离心管a中，轻微混合；(5) 加入等体积的氯仿和异戊醇混合溶液(所述氯仿异戊醇的体积比为24: 1) 至离心管a中，轻微颠倒混合，室温4 700r/min离心5min，吸取水相转移至新的离心管中；(6) 水相加入0.6倍体积异丙醇沉淀1 h ，然后15 000r/min离心15min ;(7) 沉淀以70% (质量百分比)冰预冷的乙醇重复洗涤后风干；(8) 加入600 uLTE缓冲液溶解DNA并置于-20'C下贮存。
权利要求
1. 一种同时提取堆肥样品中的PLFA和DNA的方法，其特征在于包括以下步骤a.PLFA的提取a-1.称取堆肥样品于试管中，分别加入二氯甲烷、甲醇、磷酸盐缓冲溶液，依次加入的体积比为1∶2∶1；a-2.超声匀化后低温避光静置过夜；a-3.将上述试管离心分层，液相转移到新的玻璃管中，加入二氯甲烷和纯水，使得二氯甲烷∶甲醇∶磷酸缓冲液的体积比为1∶1∶0.9，用于继续提取PLFA，固相于-20℃下保存以提取DNA；a-4.将上一步液相静置24h后，转移水相于新的离心管a中用于沉淀DNA，将有机相过滤，去除可能残留的颗粒悬浮物，滤液用N2干燥后加正己烷溶解；a-5.将上一步正己烷溶解的脂质过硅胶柱，依次用正己烷、氯仿、丙酮、甲醇洗涤柱子，收集甲醇洗涤液，N2干燥；a-6.用甲醇和甲苯混合溶液溶解干燥后的脂类物质，所述混合溶液中甲醇∶甲苯的体积比为1∶1，加入KOH溶液水浴加热使其甲酯化，冷却至室温，加入醋酸中和过量的KOH，摇匀后加氯仿萃取，去水相，再加去离子水洗涤，使得有机相部分的无机物尽可能的溶解在水相，底部有机相为溶解在氯仿中的甲酯化PLFA；b.DNA提取b-1.取步骤a-3中所保存的固相物质，添加磷酸盐缓冲液洗涤去除样品中的腐殖酸；b-2.样品洗涤后添加DNA提取液和蛋白酶(Proteinase)K进行消化，其中，样品量∶DNA提取液∶蛋白酶K为1g∶1ml∶0.005ml；b-3.将上一步所得物质转移至离心管b中，并加入SDS，另外在步骤a-4中的离心管a中也加入SDS，两根离心管同时水浴消化细胞中的蛋白质，然后将含固相的离心管b离心分层；b-4.收集离心管b中的上清，转移到离心管a中，轻微混合；b-5.加入等体积的氯仿和异戊醇混合溶液至离心管a中，所述混合溶液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1，轻微颠倒混合后离心，吸取水相转移至新的离心管中；b-6.上一步水相中加入0.6倍体积异丙醇沉淀1h，然后离心；b-7.沉淀以冰预冷的乙醇重复洗涤后风干；b-8.加入TE缓冲液溶解DNA并置于-20℃下保存。
2.根据权利要求1所述的一种同时提取堆肥样品中的PLFA和DNA的方法，其特征在 于所述步骤a-4中滤液用N2干燥后加正己垸溶解时同时加一滴二氯甲烷。
全文摘要
本发明提供了一种从同一堆肥样品中同时提取和纯化磷脂脂肪酸PLFA和脱氧核糖核酸DNA的方法，该提取方法是以脂质提取方法为基础，在相分离后，脂质进入有机相，DNA留在水相及固相，最终实现PLFA和DNA的同时提取；本发明的优点是简化了堆肥样品脂质和DNA提取的程序，保证了样品信息来源的同一性，能较好地减小堆肥取样对检测方法造成的误差，同时，在样品量很少的情况下显得更有意义。
文档编号G01N1/34GK101261204SQ20081003116
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月29日 优先权日2008年4月29日
发明者曼 喻, 宋琳玲, 张嘉超, 曾光明, 陈耀宁, 黄红丽 申请人:湖南大学