专利名称：卷烟烟气致突变性的毒理学测定评价方法
技术领域：
本发明属于巻烟烟气毒理学研究领域，特别是一种巻烟烟气致突变性的毒 理学测定评价方法。
背景技术：
近年来，国际上对烟草制品及烟用添加剂的危害性评价开展了大量研究工作。1999年FDA (美国食品药品管理局)要求I0M (美国科学院医学研究所) 制定一套科学的方法，用于评估长期使用药物产品或者烟草替代产品(用于降 低而不是消除烟草危害)的安全性和效果。根据目前的研究结果，感受烟草产 品的生物标记已得到—验证并应用。但是，生物标记的早期指标在用于预测后期 的疾病发展上几乎没有得到验证，目前已有的知识尚不足以支持进行正式的"低 危害"巻烟产品评估。体外毒性测试并非危害的直接测定，但可以确保烟草产品不会增加潜在的危害，毒理学数据可以在一定程度上支持"低危害"巻烟产 品的评价。C0RESTA (国际烟草科学研究合作中心)也成立了相关的工作组(烟草烟气 体外毒性测试工作组)，其主要任务是根据国际认可的体外毒性测试准则并加以 修改，以适应烟草烟气的性质和独特特性，确定主要的方法。根据研究结果， 对于细菌诱变分析，工作组推荐艾姆沙门氏菌诱变分析(Ames Test, Ames试 验)。从国际国内进行的烟气毒理学研究工作来看，Ames试验已经成为国际烟草 界普遍认可的巻烟烟气致突变性的毒理学评价方法。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的突变型(即组氨酸缺陷型) 菌抹在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。但如在无组氨酸的培养基中有致突变物存在时，则沙门氏菌突变型可回复突变 为野生型(表现型)，因而在无组氨酸培养上也能生长，故可根据菌落形成数量， 检查受试物是否为致突变物。不同的组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌可检测不同的突变类型。 一般AMES实验采用TA97、 TA98、 TA100及TA102四种菌林(其中 TA97和TA98可检测各种移码型诱变剂，TA100可检测引起^tt对置换的诱变剂， TA102能检出其他测试菌抹不能检出或极少检出的某些诱变剂)，至少需要两 种菌林(TA97、 TA98中的一种和TAIOO)。某些致突变物需要代谢活化后才能 使沙门氏菌突变型产生回复突变，代谢活化系统可以用多氯联苯(PCB )诱导的 大鼠肝匀浆制备的S-9混合液。基于上述Ames试验的基本原理，本发明提供一种用于评价巻烟烟气致突变 性的毒理学新方法——微量波动实验法(Microtitre fluctuation test)。传统的Ames试验方法如平板掺入法、点试法等，实验繁瑣，采用半固体培 养液，所需试剂多，制皿复杂，而且需要人工计数平皿菌落数，工作量极大。发明内容本发明的目的正是基于上述现有技术的状况而提供的一种巻烟烟气致突变 性的毒理学测定评价方法，该方法将Ames试验应用于评价巻烟烟气致突变性， 可以使评价巻烟烟气致突变性的Ames试验操作起来更方便，实验敏感性更高、 结果更可靠。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的本发明的巻烟烟气致突变性 的毒理学测定评价方法包括以下步骤(1) 选棒实验菌林，采用两株符合Ames试验标准的鼠伤寒沙门氏菌突变型菌 抹TA98和TAI00;(2) 准备实验所用材料，包括用于细胞培养的基本培养基、磷酸盐緩沖液、 活化系统S - 9混合液、Voge 1-Bonner緩沖液贝i备液；G)制备巻烟烟气凝集物CSC，将烟气分别经过有机相(乙酸乙酯)和无机 相(基础培养液)收集，将有机溶剂挥发后，与无机培养液混合，并用细胞培 养液将浓度调整为1支烟/ml;4(4) 接种、培育细胞，TA98及TA100接种于营养肉汤培养基中，于3TC振荡 (100次/min)培养10h， 96孔板中每孔加入50|li 1含500个细菌的受试菌混合 物，并加入各浓度受试物，各受试物分别采用0.0025， 0.005， 0. 01及0.02 支烟/ml浓度进行测试，每种浓度每种菌接种48个孔，37。C孵育16h后加入选 择培养基150nL，继续培养72h后观察，孔内培养物由紫色变为黄色为阳性；(5) 观察结果与判断，计数每种菌每种CSC每个浓度阳性孔数，以浓度为横坐 标，阳性孔数的对数为纵坐标作图，釆用直线回归分别拟合方程，计算50%突 变剂量，作为衡量CSC致突变能力的指标。在本发明中，所述受试菌混合物包括lxVogel-Bonner盐緩冲液，16g/L 葡萄糖，0.002g/L组氨酸，0.0003 g/L生物素,0. 024mol/L磷酸盐緩冲液， 0. 0066mol/L氯化钾，0. 0016mol/L氯化镁，0. 001mol/L葡萄糖-6 -磷酸, 0. 0008mol/L辅酶II ， 2%肝S - 9液。所述选择培养基包括1 x Voge 1-Bonner盐 緩冲液，8g/L葡萄糖，0. 0067g/L溴曱酚紫。本发明所用的各种实验材料的制备如下(1)基本培养基牛肉膏5. 0g，胰胨(或混合蛋白胨)10. 0g,氯化钠 5. 0g，加入蒸馏水1000ml，加热溶解，调pH至7. 4,分装后高压灭菌，-20。C 保存备用(保存期不超过半年)(2 ) 0. 2mo1磷酸盐緩冲液(PBS， pH7. 4):称取63. 03g Na2HP04 . 12H20， 3. 74gNaH2P04 2H20，溶于1000ml去离子水，调pH至7. 4，高压灭菌或过滤除 菌。(3 ) 10% S-9混合液(活化系统)每10 ml含无菌的0. 2 mol/L磷酸 盐緩冲液(PH6.4) 6.0ml、 1.65 mol/L氯化钾溶液0. 2ml、 0. 4 mol/L氯化4美 溶液O. 2ml、 0. 05 mol/L葡萄糖-6-磷酸盐溶液1. Oml 、 0. 025 mol/L辅酶-II溶 液1.6ml和大鼠肝匀浆液(S-9)1. 0ml，混匀(监用时配制，置冰浴中待用)。 其中S-9的制备方法如下健康雄性成年(5一6周龄)SD或Wistar大鼠，体重 150g左右。将多氯联苯(Aroclor 1254或国产PCB-五氯)溶于玉米油中，浓 度200 g/L,按500 mg/kgBW腹腔注射(无菌操作)1次，5d后断头处死动物， 取肝脏，称重后用新鲜水冷的0. I5 mol/L氯化钾溶液沖洗肝脏数次(除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白)。每克肝(湿重)加0. 1 mol/L氯化钾溶液3ml， 冰浴中用消毒剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器(低于4000 r/min， l一2min)或组 织匀浆器(20 000 r/min， 1 min)中制成肝匀浆。低温(0一4。C )高速离心(9000 gl0min),取上清液(S-9组分)分装于无菌冷冻管或瓿中，每瓶2ml左右， 用液氮或干水速冻后置-80。C低温保存(保存期不超过l年)。(4) 营养肉汤琼脂培养基琼脂粉l. 5g加入100ml营养肉汤培养基中， 加热融化，调pH(6. 4)后灭菌。用作基因型鉴定的结晶紫敏感试验、抗氨节 青霉素和四环素试验、紫外线敏感性试验和细菌活力鉴定。(5) 底层培养基无菌条件下，趁热(80。C),每100ml灭菌的1.5% 琼脂粉溶液(蒸馏水)中依次加入无菌的Vogel-Bonner贮备液2 ml和40 %葡 萄糖溶液5ml，充分混匀，立即倒入平皿，每皿(直径90 mm) 25 ml， 37。C培 养过夜以除去水分及检查有无污染。(6) Vogel-Bonner緩冲液贮备液(50倍)磷酸氢钠铵(NaNH4HP04 .4H20) 16. 5g,柠檬酸((^807 .H20)10. 0g，磷酸氬二钾(K2HP(U50. 0g,硫酸镁(MgS。4 .7 H20)1. 0g，加蒸榴水至100ml，溶解后灭茵。(注待其他试剂完全溶解后再 将硫酸镁緩慢放入其中继续溶解，否则易析出沉淀。)(7 )顶层培养基每100 ml融化的0. 6 %琼脂粉溶液(0. 5 %氯化钠溶 液)中加入10 ml 0.5 mol/L组氨酸(分子量155)-生物素(分子量244 )溶 液。混匀，分装(100 ml三角瓶)后灭菌。用时融化分装小试管，每管2 ml, 在45。C水浴中保温。(8) 组氨酸生物素平板(组氨酸需要试验用)每1000 ml中含灭菌的 底层培养基914 ml、磷酸盐贮备液20 ml、 40%葡萄糖溶液50 ml、 0. 4°/。的组 氨酸水溶液10 ml和0. 5 mmol/LD-生物素溶液6 ml。(9) 细菌稀释液增菌培养物计数后，用受试细菌培养液稀释至lx106 个/ml。(10 )受试细菌培养液Vogel-Bonner緩沖液(1倍)中含葡萄糖16mg/ml, 组氨酸2ng/ml生物素0. 3 ji g/ml, S-9混合物50|uL。(11)选择培养基Vogel-Bonner緩冲液(1倍)中含葡萄糖16mg/ml，溴曱酚紫(BCP) 6. 67ng/ml本发明提供的方法相对于传统AMES实验方法，具有操作更方便、敏感性更 高、结果更可靠的优点。
附图为本发明的流程图。
具体实施方式
本发明以下结合不同类型巻烟(实例)作进一步描述 实例一对国内某一烤烟型巻烟进行评价。巻烟烟气分别经过有机相(乙酸乙酯)和无才M目(基本培养液)收集。将 有机溶剂挥发后，与培养液混合，并用细胞培养液将浓度调整为1支烟/ml。 -80 'C保存。TA98及TA100经鉴定后接种于5mL营养肉汤培养基中，于37。C振荡(100 次/min)培养10h, -4。C储存备用。培养细菌采用分光光度计在600nm波长下测定OD值并计算浓度。96孔板 中每孔加入50|ii 1含500个细菌的受试菌混合物(1 x Vogel-Bonner盐緩冲液， 16g/L葡萄糖,0. 002g/L组氨酸，0. 0003 g/L生物素，0. 024mol/L磷酸盐緩沖 液，0. 0066mol/L氯化钾,0. 0016mol/L氯化镁，0. 001mol/L葡萄糖-6 -磷酸， 0. 0008mol/L辅酶I1， 2%肝S - 9液及相应浓度受试物)。各受试物分别采用 0. 0025， 0.005, 0. 01及0. 02支烟/ml浓度进行测试，每种浓度每种菌接种48 个孑L，3rC孵育16h后加入选择培养基150ML(1 xVogel-Bonner盐緩冲液，8g/L 葡萄糖，0. 006 g/L溴曱酚紫)，继续培养72h后观察，孔内培养物由紫色变为 黄色为阳性。计数每种菌每种CSC每个浓度阳性孔数，以浓度为横坐标，阳性孔数的对 数为纵坐标作图，采用直线回归分别拟合方程，计算50%突变剂量。细菌半数致突变剂量计算结果为0. 036cigs/ml。 实例二对国内某一混合型巻烟进行评价。巻烟烟气分别经过有机相(乙酸乙酯)和无才;i4目(基本培养液)收集。将有机溶剂挥发后，与培养液混合，并用细胞培养液将浓度调整为1支烟/ml。 -80'c保存。TA98及TA10Q经鉴定后接种于5mL营养肉汤培养基中，于37。C振荡(100 次/min)培养10h， -4。C储存备用。培养细菌采用分光光度计在600nm波长下测定OD值并计算浓度。96孔板 中每孔加入50|ii 1含500个细菌的受试菌混合物(1 x Vogel-Bonner盐緩冲液， 16g/L葡萄糖，0. 002g/L组氨酸,0. 0003 g/L生物素，0. 024mol/L磷酸盐緩冲 液，0. 0066mol/L氯化钾，0. 0016mol/L氯化镁，0. 001mol/L葡萄糖-6 -磷酸, 0. 0008mol/L辅酶II, 2%肝S - 9液及相应浓度受试物)。各受试物分别采用 0.0025, 0.005, 0. 01及0. 02支烟/ml浓度进行测试，每种浓度每种菌接种48 个孑L， 37。C孵育16h后加入选择培养基150 p L (1 x Voge卜Bonner盐緩沖液，8g/L 葡萄糖，0. 0067g/L溴甲酚紫)，继续培养72h后观察，孔内培养物由紫色变为 黄色为阳性。计数每种菌每种CSC每个浓度阳性孔数，以浓度为横坐标，阳性孔数的对 数为纵坐标作图，采用直线回归分别拟合方程，计算50%突变剂量。 细菌半数致突变剂量计算结果为0. 034cigs/ml。 实例三对国外某一巻烟进行评价。巻烟烟气分别经过有机相(乙酸乙酯)和无才A4目(基本培养液)收集。将 有机溶剂挥发后，与培养液混合，并用细胞培养液将浓度调整为1支烟/ml。 -80 'C保存。TA98及TAIOO经鉴定后接种于5mL营养肉汤培养基中，于37。C振荡(100 次/min)培养10h， -4。C储存备用。培养细菌采用分光光度计在600nm波长下测定OD值并计算浓度。96孔板中每孔加入50p 1含500个细菌的受试菌混合物(1 x Vogel-Bonner盐緩沖液， 16g/L葡萄糖,0. 002g/L组氨酸，0. 0003 g/L生物素，0. 024mol/L磷酸盐緩沖 液，0. 0066mol/L氯化钾，0. 0016mol/L氯化镁,0. O01mol/L葡萄糖-6 -磷酸， 0. 0008mol/L辅酶I1， 2%肝S - 9液及相应浓度受试物)。各受试物分别采用 0.0025, 0.005, 0. 01及0. 02支烟/ml浓度进行测试，每种浓度每种菌接种48 个孑L,37。C孵育16h后加入选择培养基150juL(1 x Vogel-Bonner盐緩沖液，8g/L 葡萄糖，0. 0067g/L溴曱酚紫)，继续培养72h后观察，孔内培养物由紫色变为 黄色为阳性。计数每种菌每种CSC每个浓度阳性孔数，以浓度为横坐标，阳性孔数的对 数为纵坐标作图，釆用直线回归分别拟合方程，计算50%突变剂量。 细菌半数致突变剂量计算结果为0. 042cigs/ml。
权利要求
1. 一种卷烟烟气致突变性的毒理学测定评价方法，其特征在于它包括以下步骤(1)选择实验菌株，采用两株符合Ames试验标准的鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA98和TAI00；(2)准备实验所用材料，包括用于细胞培养的基本培养基、磷酸盐缓冲液、活化系统S-9混合液、Vogel-Bonner缓冲液贮备液；(3)制备卷烟烟气凝集物CSC，将烟气分别经过有机相(乙酸乙酯)和无机相(基础培养液)收集，将有机溶剂挥发后，与无机培养液混合，并用细胞培养液将浓度调整为1支烟/ml；(4)接种、培育细胞，TA98及TA100接种于营养肉汤培养基中，于37℃振荡(100次/min)培养10h，96孔板中每孔加入50μl含500个细菌的受试菌混合物，并加入各浓度受试物，各受试物分别采用0.0025，0.005，0.01及0.02支烟/ml浓度进行测试，每种浓度每种菌接种48个孔，37℃孵育16h后加入选择培养基150μL，继续培养72h后观察，孔内培养物由紫色变为黄色为阳性；(5)观察结果与判断，计数每种菌每种CSC每个浓度阳性孔数，以浓度为横坐标，阳性孔数的对数为纵坐标作图，采用直线回归分别拟合方程，计算50％突变剂量，作为衡量CSC致突变能力的指标。
全文摘要
一种卷烟烟气致突变性的毒理学测定评价方法，其特征在于它包括以下步骤(1)选择实验菌株；(2)准备实验所用材料；(3)制备卷烟烟气凝集物CSC；(4)接种、培育细胞；(5)观察结果与判断。本发明提供的方法相对于传统AMES实验方法，具有操作更方便、敏感性更高、结果更可靠的优点。
文档编号G01N21/25GK101255456SQ20081004945
公开日2008年9月3日 申请日期2008年4月1日 优先权日2008年4月1日
发明者刘惠民, 斌 彭, 朱茂祥, 杨陟华, 聪 聂, 谢剑平, 谢复炜, 乐 赵 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院