专利名称：类金刚石碳膜作为基质在激光解吸离子化质谱中应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及解吸离子化质谱，具体地说是类金刚石碳膜作为基质在激光解吸离子 化质谱中的应用。
背景技术：
1988年，Tanaka和Hillenkamp各自独立地提出了利用基体物质吸收激光能量 辅助待分析物进入气相解吸离子化的技术，称为基质辅助激光解吸离子化技术(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation，MALDI)。这一技术与飞行时间质谱联用 (MALDI-TOF MS)，成为生物技术中强有力的工具，已成功应用于非挥发性和热不稳定的蛋 白质、DNA/RNA、多糖等生物分子的质谱检测，并获得了 2002年的诺贝尔化学奖。基质物质 的存在对于能量传递以及保持分子的完整性具有极其重要的作用。目前，常用商品化的基 质多为有机物分子，如2，5_ 二羟基苯甲酸(DHB)，α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)及它们 的衍生物等。有机物基质的引入会在低分子量范围产生大量的基质分子离子峰，对低分子 量待测物的检测形成严重的背景干扰。此外，有机基质种类的选择，浓度的大小，待分析物 和基质混合比例的选择等因素使样品制备比较复杂，要求操作者花费冗长的时间去摸索实 验条件。这些问题使得采用有机物基质的激光解吸离子化质谱技术难以应用于低分子量的 小分子化合物的快速、准确分析。采用无机物基质参与的解吸离子化质谱日益受到人们的重视和深入研究。一些 研究者采用石墨、活性碳材料作为解吸离子化的基质来检测低分子量化合物，但灵敏度较 低(非专利文献 1. Sunner, J. ；Dratz, Ε. ；Chen，Y-C.，” Graphite surface-assisted laser desorption/ionizationtime-of flight mass spectrometry of peptides and protein from liquidsolution"，《Anal. Chem.》，V6^P4335-4342 (I995 年)；非专利文献 2. Date Μ. J. ；Knochenmuss R. ；Zenobi R.，“ Graphite-liquid mixedmatrices for laser desorption/ionization mass spectrometry “，《Anal. Chem.》，V68，P3321-3329 (1996 年)；非专利文献 3. Han，Μ. ；Sunner, J.，“ An activated carbon substrate surface for laser desorption massspectrometry “，《J. Am. Soc. Mass Spectrom.》，VII， P644-649(2000年))。2003年，邹汉法等人首次提出使用多壁碳纳米管作为MALDI的 基质，有效消除有机基质带来的背景干扰，并成功应用于小肽和糖类等小分子化合物 的分析(非专利文献 4. Xu，S. ；Li, Y. ； Zou, H. ；Qiu, J. ； Guo, Z. ； Guo, B.，“ Carbon nanotubes as assisted matrix for laserdesorption/ionization time—of—flight mass spectrometry “，((Anal. Chem.》，V75, P6191-6195 (2003 年))。由于这些无机碳材料多为 固体粉末，几乎不溶于水和一般有机溶剂，作为MALDI基质应用尚存在一些问题(1)难以 准确控制基质的加入量，操作的重复性较差；(2)难以形成均勻的基质层，检测信号的重复 性差，难以进行定量分析(3)基质层疏松，且与载体靶表面作用弱，容易在离子源的真空 电场中飞离靶表面，污染离子源。类金刚石碳(Diamond-1 ike carbon,简称DLC)膜是具有类似金刚石结构的非晶碳膜，具有独特的物理和化学性能，如高硬度、低摩擦系数、高耐磨性、化学稳定性、 耐蚀性、导热性、电绝缘性、光学透过性和生物相容性等。非专利文献5. Robertson， J. , “ Diamond-like amorphous carbon. " , ((Materials Science and Engineering :R Reports)) V37, P129-281 (2002年)中记载了类金刚石碳膜材料的制备方法，包括离子束辅 助沉积法、磁控溅射法、真空阴极电弧沉积法、电子回旋化学气相沉积等方法。文献还记载 了类金刚石碳膜在耐磨涂层、光学增透膜、微电子机械系统以及生物体保护膜等方 面的应 用。而将类金刚石碳膜材料作为激光解吸离子化质谱的辅助基质，并用于样品分析，在现有 文献中未作任何记载，也未作任何启示。
发明内容
本发明的目的在于采用类金刚石碳膜作为激光解吸离子化质谱的基质，可对其表 面上的低分子量化合物进行质谱检测。在没有加入有机物基质的情况下，类金刚石碳膜能 够吸收激光能量，并传递给吸附在其表面上的待测样品，使样品分子解吸附并气相离子化， 而进入质谱仪检测器。在此过程中，类金刚石碳膜未发生离子化，待测样品的质谱图上没有 基质分子的背景干扰，从而实现了激光解吸离子化质谱对低分子量化合物的快速、准确地 定性检测。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为类金刚石碳膜作为基质在激光解吸离子化质谱中应用，制备一种供吸附小分子化 合物的类金刚石碳膜。将载体表面经预先处理及成形后，以高纯度石墨为靶材，经化学气相 蒸镀法或物理气相蒸镀法在载体表面生成类金刚石碳膜。在该类金刚石碳膜表面加载待测 样品，以化学吸附方式结合样品分子，并对样品分子进行激光解吸离子化质谱分析。具体步骤如下，(1)在载体上制备类金刚石碳膜；所述的类金刚石碳膜是以高纯度石墨为靶材，经化学气相蒸镀法或物理气相蒸镀 法，在载体表面生成均勻的镀层，厚度为100-2000纳米；类金刚石碳膜均勻地沉积到载体 的表面，类金刚石碳膜的表面形貌具有丰富的孔隙结构，可以有效地吸附待测样品分子；类 金刚石碳膜含有较多的碳原子键Sp3组分，具有较高的机械强度和化学稳定性。(2)有机溶剂清洗载体上的类金刚石碳膜，经高纯氮气吹干备用；(3)将载体固定在MALDI靶上；(4)将样品滴加到类金刚石碳膜表面，待干燥后进行激光解吸离子化质谱分析；(5)使用后的类金刚石碳膜经有机溶剂清洗、再生后，可待重复使用。所述的载体可以是商品化MALDI靶、硅片、玻璃、金属或高分子塑料等材料。使用 过程中载体可以经预先成形，以配合类金刚石碳膜的实际使用规格。使用过程中以类金刚石碳膜表面作为样品激光解吸离子化的辅助基质；类金刚石 碳膜作为基质用于分子量在50-2000Da.(道尔顿)有机小分子化合物的激光解吸离子化质 谱检测；所述有机小分子化合物最好为50-1000Da.的小肽、核甘酸单体、氨基酸、脂或糖。使用过程中待测样品加到质谱样品靶表面的类金刚石碳膜上，自然干燥后进行质 谱分析，待测样品加到类金刚石碳膜表面上未形成明显的结晶体；使用过程中低分子量化 合物样品直接加到类金刚石碳膜上，不需添加有机基体。待测样品经上述过程进行激光解吸离子化质谱分析，所得的质谱图背景干净，没有基质本身的分子离子峰干扰。清洗用的有机溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮 或乙腈。本发明具有以下优点1.无基质分子离子峰信号的干扰，对低分子量化合物分析效果好。本发明采用类 金刚石碳膜表面作为作为激光解吸离子化质谱的基质，能有效消除常规有机基质产生的背 景干扰，实现了对小分子化合物的准确地定性分析。2.点样操作方便，通用性强。本发明采用的类金刚石碳膜表面作为激光解吸离子 化质谱的基质，点样操作方便，无须象使用有机基质时需要优化基质与待测样品的加入比 例，简化了操作步骤，可对小分子化合物进行快速检测。3.可重复性强。类金刚石碳膜均勻而致密，具有较高的机械强度，解决了活性碳、 石墨、碳纳米管等粉末状碳类材料作为基质的不足，能有效减少离子源的污染。由于样品在 碳膜表面分布均勻，没有形成结晶，有效地提高了分析的重复性，便于定量分析。4.灵敏度高。使用类金刚石碳膜作为基质，有效地提高了分析物的解吸离子化效 率，能够实现对有机类(BTEE)，小肽类，氨基酸类等小分子化合物高灵敏度检测。5.成本低，通用性强。在本发明中，既可采用商品化的MALDI金属靶为载体，在其 表面喷镀类金刚石碳膜后，对样品进行直接分析；也可以采用硅片、玻璃、金属或高分子塑 料等薄片状材料为载体，在其表面喷镀类金刚石碳膜，然后将镀有类金刚石碳膜的载体固 定在商品化MALDI靶上，进行后续的样品分析。无论采用哪种方式，在一次使用后，采用有 机溶剂对类金刚石碳膜表面进行清洗、再生，类金刚石碳膜都可以重复使用。还可以在其它 的MALDI质谱仪中改装使用。
图1是发明技术方案的示意图。(1)为商品化的MALDI靶；(2)为载体；(3)类金 刚石碳膜；(4)类金刚石碳膜表面上负载的样品。图2类金刚石碳膜表面的扫描电镜影像(放大2000倍)。图3低分子量化合物BTEE (a) ,Gly-Val (b)和Phe-Ala (c)在类金刚石碳膜表面上 的激光解吸离子化质谱图。图4待测样品加载到常规有机基质上HCCA(a)、DHB(b)和类金刚石碳膜表面(c) 形成的样品基质层的比较图。图5分别采用常规有机基质上HCCA(a)、DHB(b)和类金刚石碳膜表面(c)分析 BTEE的激光解吸离子化质谱图。图6在类金刚石碳膜表面上分析2. 9 μ g (a)，29ng (b)，和2. 9ng (c) BTEE的激光解 吸离子化质谱图。
具体实施例方式本发明通过采用类金刚石碳膜作为激光解吸离子化质谱的基质，吸收激光能量并 传递给吸附在其表面上的待测样品，使样品分子解吸附并气相离子化进入质谱仪检测器， 同时，类金刚石碳膜未发生离子化，待测样品的质谱图上没有基质分子的背景干扰，从而实 现了激光解吸离子化质谱对低分子量化合物的快速、准确地分析。在实施方式上，可以分成两部分第一部分是类金刚石碳膜材料的制备，第二部分是类金刚石碳膜用于样品的激光 解吸离子化质谱分析。以下介绍两者的具体实施方式
。类金刚石碳膜材料的制备通过真空阴极电弧沉积(vacuum cathodic arcdeposition)方法获得。该方法是以石墨为碳源，在惰性气体中以电弧放电烧蚀石墨 靶产生碳原子和碳离子，在载体表面形成致密的、具有较多SP3组分的DLC膜。采用这 种方法制备的类金刚石碳膜材料具有均勻的孔隙，如图2扫描电镜图所示，孔隙尺寸在 200nm-50ym 之间。类金刚石碳膜材料的制备石墨靶为99. 99%的高纯石墨，溅射气体是99. 99 %的高纯氩气，采用单 晶硅片 (20mm X 20mm)、不锈钢片(100mm X 100mm)或商品化 MALDI 靶(100mm X 150mm)作为载体。先 分别用分析纯丙酮和乙醇将载体超声波清洗lOmin，取出吹干后放入真空室，靶与载体间距 100mm,本底真空为7 X 10_4Pa。通入氩气至8 X KT1Pa,给载体加-1000V偏压，先溅射清洗载 体表面，去除载体表面的杂质和吸附气体。沉积时真空度为3X KT1Pa,阴极弧工作电流为 30A，沉积温度为100°C。镀层厚度为100-2000纳米。类金刚石碳膜表面用于质谱分析的预处理用于激光解吸离子化质谱分析的类金刚石碳膜材料在使用之前需要进行清洗，去 除制备过程中引入的杂质以及使用后残留的分析物。(1)将所制备的类金刚石碳膜载体，加入20mL二次蒸馏水超声清洗1分钟，高纯氮
气吹干。(2)加入20mL色谱纯乙醇或甲醇超声清洗1分钟，高纯氮气吹干。经过清洗后，采用商品化MALDI靶为载体的类金刚石碳膜表面可以直接用于样品 分析。采用其它材料为载体的类金刚石碳膜，需要先将镀膜载体用双面胶固定在商品化 MALDI靶上，再用于样品分析。实施例1类金刚石碳膜表面激光解吸离子化质谱分析低分子量化合物1.样品溶液的制备3. 2mg的小肽Phe_Ala、3. Omg的小肽Gly-ValjP 2. 9mg的苯 甲酰-L-酪氨乙酯盐酸盐(BTEE)分别溶解在ImL 50%甲醇溶液中。置于4°C冰箱中保存 备用。2.类金刚石碳膜表面的激光解吸离子化质谱分析分别取IyL的Phe-Ala、 Gly-Val、和BTEE样品溶液，滴加到类金刚石碳膜表面的不同位置，自然干燥后，用激光解 吸离子化质谱分析。分析结果由图3可见，三种低分子量化合物BTEE、Gly-Val和Phe-Ala在没有常规有机基 体存在下，在类金刚石碳膜表面有很高的解吸效率，主要以[M+K] +和[Μ+Na]+的形式得到 检测，(a)BTEE(313. 4 ；336, [M+Na]+ ；352, [M+K]+)，(b)Gly-Val (174. 2 ； 197, [M+Na]+ ；213, [M+K]+)，(c) Phe-Ala (165. 2 ； 188，[M+Na]+ ；204, [M+K]+)，信噪比很高，且没有基体峰的背景 干扰。实施例2使用常规有机基体与类金刚石碳膜表面激光解吸离子化质谱分析的比 较1.样品溶液的制备2. 9mg的苯甲酰_L_酪氨乙酯盐酸盐(BTEE)溶解在ImL 50%甲醇溶液中，用50%甲醇溶液分别稀释浓度至29 μ g/mL和290ng/mL。置于4°C冰箱中保存 备用。2.类金刚石碳膜表面的激光解吸离子化质谱分析分别取1 μ L浓度为29 μ g/mL 和290ng/mL的BTEE样品溶液，滴加到类金刚石碳膜表面的不同位置，自然干燥后，用激光 解吸离子化质谱分析。3.常规有机基体的激光解吸离子化质谱分析分别取1 μ L基质溶液(0. 5mg/mL) 点于金属靶表面，自然干燥后形成基质薄层。取1 μ L浓度为29 μ g/mL的BTEE样品溶液点 于基质薄层上，自然干燥后送入MALDI-MS仪器在相同条件下进行质谱分析分析结果 样品在使用常规有机基质HCCA(a)和DHB(b)得到的MALDI靶表面形成不均一的 结晶体；样品在类金刚石碳膜(c)表面的均勻分布，未见结晶体(图4)，。由图5可见，分别使用常规有机基质HCCA (a)和DHB(b)分析BTEE得到的质 谱图，存在严重的背景干扰；使用类金刚石碳膜(c)表面分析的质谱图，没有背景干扰， BTEE (313. 4 ；336，[M+Na]+ ；352，[M+K]+)，主要以[M+K] +和[Μ+Na]+ 的形式得到很好的检测。实施例3类金刚石碳膜表面激光解吸离子化质谱分析BTEE的检测限1.样品溶液的制备2. 9mg的苯甲酰_L_酪氨乙酯盐酸盐(BTEE)溶解在ImL 50% 甲醇溶液中，用50%甲醇溶液分别稀释浓度至29 μ g/mL和2. 9 μ g/mL。置于4°C冰箱中保 存备用。2.类金刚石碳膜表面的激光解吸离子化质谱分析分别取1 μ L浓度为2. 9mg/mL, 29 μ g/mL和2. 9 μ g/mL的BTEE样品溶液，滴加到类金刚石碳膜表面的不同位置，自然干燥 后，用激光解吸离子化质谱分析。分析结果由图 6 可见，1 μ L 浓度为 2. 9mg/mL (a)，29 μ g/mL (b)和 2· 9 μ g/mL (c)的 BTEE 样 品均可以检出，说明BTEE在类金刚石碳膜表面有很高的解吸效率，对BTEE的检测限可达到 纳克级，具有很高的灵敏度。本发明采用类金刚石碳膜表面作为激光解吸离子化飞行时间质谱的辅助基质，对 低分子量化合物具有较高的解吸离子化效率，同时不产生基质分子的背景干扰，从而实现 了低分子量化合物高效，快速的检测。采用类金刚石碳膜作为辅助基质的激光解吸离子化 飞行时间质谱，是不需要加入任何有机基体的一种新的解吸离子化方法，为天然产物和生 态代谢物等低分子量化合物提供了一个通用、高效，快速的检测方法，推动了激光解吸离子 化飞行时间质谱技术对小分子化合物分析的发展，也为类金刚石碳膜材料的应用找到了一 个新的领域。
权利要求
类金刚石碳膜作为基质在激光解吸离子化质谱中应用，其特征在于包括以下步骤，(1)在载体上制备类金刚石碳膜；(2)有机溶剂清洗载体上的类金刚石碳膜，经气体吹干备用；(3)将载体固定在MALDI靶上；(4)将样品滴加到类金刚石碳膜表面后，进行激光解吸离子化质谱分析；(5)使用后的类金刚石碳膜经有机溶剂清洗、再生后，可待重复使用。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于所述的类金刚石碳膜是以高纯度石墨为 靶材，经化学气相蒸镀法或物理气相蒸镀法，在载体表面生成均勻的镀层，厚度为100-2000 纳米。1
3.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于使用过程中载体可以是商品化MALDI 靶、硅片、玻璃、金属或高分子塑料。
4.按照权利要求1所述的应用，其特征在于使用过程中以类金刚石碳膜表面作为样 品激光解吸离子化的辅助基质；类金刚石碳膜作为基质用于分子量在50-2000Da.(道尔 顿)有机小分子化合物的激光解吸离子化质谱检测。
5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于所述有机小分子化合物为50-1000Da.小 肽、核甘酸单体、氨基酸、脂或糖。
6.按照权利要求1所述的应用，其特征在于所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮或乙腈。
全文摘要
本发明涉及激光解吸离子化质谱，具体地说是类金刚石碳膜作为基质在激光解吸离子化质谱分析中的应用。采用类金刚石碳膜表面作为激光解吸离子化飞行时间质谱的辅助基质，对低分子量化合物具有较高的解吸离子化效率，同时不产生基质分子的背景干扰，从而实现了低分子量化合物高效，快速的检测。采用类金刚石碳膜作为辅助基质的激光解吸离子化飞行时间质谱，是不需要加入任何有机基体的一种新的解吸离子化方法，为天然产物和生态代谢物等低分子量化合物提供了一个通用、高效，快速的检测方法，推动了激光解吸离子化飞行时间质谱技术对小分子化合物分析的发展，也为类金刚石碳膜材料的应用找到了一个新的领域。
文档编号G01N27/64GK101846650SQ20091001086
公开日2010年9月29日 申请日期2009年3月25日 优先权日2009年3月25日
发明者厉欣, 张宇, 邹汉法 申请人:中国科学院大连化学物理研究所