专利名称：筛选含有外源融合基因HIV/env/IFNα-2b的重组痘苗病毒的方法
技术领域：
本发明属于基因工程疫苗生物技术领域，涉及筛选含有外源融合基因HIV/env/ IFNa -2b的重组痘苗病毒的方法。
背景技术：
艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome，AIDS)是本世纪以来对人类威胁 最严重的传染病。艾滋病病毒对人体免疫功能的破坏所产生难以治愈的感染和肿瘤已经威 胁了人类社会的生存和发展。特别是艾滋病在传播蔓延过程中一个最引人关注的现象是， 全球艾滋病病毒新感染者中，青少年占一半以上。目前，尚未有能从根本上彻底治疗和预防 艾滋病的有效药物。现行的各种治疗措施都是尝试性的。由于艾滋病主要是和免疫系统有 关的疾病，因而获得可靠的免疫预防保护是从根本上解决艾滋病流行传播的关键。人获得 性免疫缺陷病毒(HIV)作为反转录RNA慢病毒，是传播AIDS的主要病原体。外膜蛋白(env) 是HIV的主要结构蛋白之一，含有5个高变区(V1-V5)和5个恒定区。V4-V5为抗原表位与 靶细胞结合区，V3区介导病毒进入靶细胞，C3-C4区参与CD4受体结合并影响病毒的嗜性。 许多体外突变体实验均表明该区的氨基酸替换或缺失可导致env蛋白对CD4+细胞的结合 能力降低，这表明位于该区域的氨基酸残基为CD4+受体结合所必需，在HIV感染的过程中 起着关键性的作用。有关HIV疫苗的研制多数是围绕着外膜蛋白(env)展开的，而本项发 明利用HIV外膜蛋白(env)基因片段，构建在真核细胞表达的融合基因。表达的蛋白产物 即可作为抗原进行免疫预防和治疗，又可作为诊断试剂筛查感染人群。
发明内容
本发明的目的是提供一种分子生物学领域的操作技术，通过构建一个基因重组表 达质粒，筛选出一株含有外源融合基因HIV/env/IFNa _2b的重组痘苗病毒。本发明是通过如下技术方案实现的将编码人干扰素a -2b的基因序列与编码人HIVenv基因融合，构建读框吻合的外 源融合基因片断，并克隆到痘苗病毒表达载体PJ16中，构建了含有HIVenv和IFN a -2b外 源融合基因的重组表达质粒pJ16enV/IFNa _2b，并在真核细胞中忠实地翻译了原有的基 因序列，连续稳定地表达了 env/IFNa -2b融合蛋白，pJ16enV/IFNa -2b基因表达产物在体 外能与HIVenv阳性血清发生特异性反应，具备免疫原性和免疫反应性，无返祖现象。为研 究艾滋病病毒结构蛋白的抗原性，提供了一个获得艾滋病病毒外膜蛋白的途径。为研究艾 滋病感染者的检测诊断试剂与免疫预防治疗提供重要的理论依据。本发明的技术解决方案包括以下步骤1. pJ16env/IFN a -2b 基因重组与鉴定在无菌条件下制备大肠杆菌感受态细胞，置-70°C超低温冰箱冻存，用于转化质 粒。采用CaCl2转化的方法，将含有目的基因的载体质粒转入E. coliHB101、JM109、DH-5a、JMlOl中，在含50 μ g/ml Amp的LB液体培养基中37°C振摇培养24h，分别以质粒小量提取、质粒大量提取方法制备含有目的基因的载体和表达载体，以5V/cm的电压在琼脂糖凝 胶上电泳以及用限制性内切酶的酶切反应鉴定目的基因和载体，当溴酚蓝电泳至适当位 置后，用长波紫外灯观察并记录结果或拍照保存，采用分光光度计测定法检测260nm和 280nm的光密度OD值，计算提取质粒的浓度，置_20°C冰箱中保存，备用于连接反应。DNA 目的基因片断与载体的回收根据实验目的和DNA分子量大小分别采用冻融法、DEAE-81纤 维素膜电泳回收法、低熔点琼脂糖凝胶回收法与透析袋法。酶切DNA片段的3’凹端补平 与线性质粒DNA的5'端去磷分别采用dNTP、Klenow大片段与牛小肠碱性磷酸酶(CIP) 分别置室温、37°C、55°C、75°C反应，将3’凹端补平与5'端去磷的线性质粒DNA用适量 T4 DNA连接酶(0. 5weiSS单位)置16°C水浴过夜或25°C lh。进行连接反应。重组子的 筛选和鉴定采用酶切法。挑选酶切结果与理论预计值相同者进一步用两种以上内切酶消 化，所有酶切结果均与预计完全相同者，即为目的重组质粒。结果构建了内含目的基因片 段 env (nt6220-nt8887)与 IFN α -2b (nt290_nt813)，分子量约为 9. 893kb 的重组表达质粒 pJ16env/IFNa -2b。2. pJ16env/IFN a -2b在真核细胞中表达与鉴定真核细胞表达是以野生型痘苗病毒为介导转基因，采用脂质体转染细胞法，使 pJ16env/IFNa-2b在细胞内与野生型痘苗病毒发生同源重组具体操作是分别在35mm平 皿中培养的RK、BHK21以及Cos-7细胞中感染野生型痘苗病毒，感染MOI (Multiplicity of infection)为0. 1的野生型病毒，于37°C、5% CO2反应Ih后与包裹脂质体的质粒进行共 转染，同时设未感染病毒的正常细胞和未加转染试剂的痘苗病毒感染细胞为对照。培养48h 后，以血凝素基因(HA)为报告基因，筛选纯化含目的基因pJ16enV/IFNa-2b的重组痘苗病 毒。本实验经加入预先处理好的鸡红细胞后镜下观察，由于野生型病毒具有完整的HA基 因，所以非重组病毒感染的细胞有HA基因蛋白表达的血凝素而能吸附鸡红细胞。肉眼观察 可见病毒蚀斑呈红色片状，光镜下可见大量鸡红细胞被吸附在病变细胞的表面。重组病毒 由于外源基因片段的插入使HA失活，其感染的细胞不能表达血凝素，故丧失了吸附鸡红细 胞的能力。肉眼观察与非重组病毒蚀斑有明显差异，镜下观察无鸡红细胞吸附，蚀斑内的细 胞多数崩解、脱落，仅剩下少量细胞融合、拥挤成堆、斑内形成空洞。结果利用HA特性，筛选 纯化出VJ16enV/IFNa -2b重组痘苗病毒株，经过3 4代的纯化直至稳定表达HA-斑为 止，48h后收毒。以细胞培养法扩增重组痘苗病毒，以间接免疫荧光分析(IFA)、Dot-ELISA、 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与蛋白印迹(Westernblotting)方法鉴定pJ16env/ IFNa-2b目的基因在真核细胞中的表达产物，确定其分子量。结果VJ16enV/IFNa-2b重组 痘苗病毒株表达的env蛋白能被HIV血清所识别，分别能与1 300倍稀释后的HIV阳性 血清发生较强的特异性呈色反应，其分子量为IOOkDa,与预计理论上的计算值相符合。3. pJ16env/IFNa-2b表达产物的免疫原性和免疫反应性研究将筛选纯化的vJieenv/IFNa _2b重组痘苗病毒接种于体外培养的单层细胞，培 养约30h左右，收取感染细胞，测定病毒PFU值，调整病毒的滴度使其达到IO8PFU,用弗氏 佐剂制备样品，采用足垫和腹腔两种免疫途径免疫小鼠，加强免疫3次，饲养60天后，眼球 取血，无菌制备脾淋巴细胞，采用HIV间接ELISA试剂盒检测免疫小鼠血清HIV抗体，在 DG5030型酶联免疫检测仪上依次读取490nm下的光密度值(OD49tl)。流式细胞仪FACS检测3000个细胞，所得数据进行统计学分析。结果表明含有pJieenv/IFNa _2b基因的重组痘苗 病毒株能表达目的蛋白。重组痘苗病毒表达产物免疫小鼠后，体液免疫检测结果表明，重组 痘苗病毒表达产物免疫小鼠后可以激发小鼠体内产生高滴度的抗体水平，含IFN α -2b结 构基因组与不含IFNa _2b结构基因组之间比较，前者提高了重组颗粒化抗原的免疫原性。 流式细胞仪检测3000个T淋巴细胞中标记的阳性细胞表明小鼠体内产生了细胞免疫。统计 学分析，多组间比较作方差分析，组间比较用t检验。t = χ - μ /S χ。重组病毒基因表达产 物的生物活性研究采用淋巴细胞转化实验与CTL杀伤活性实验，结果表明，env/IFNa _2b 融合基因在痘苗病毒中共表达产物能提高实验小鼠的体液免疫与细胞免疫，具备免疫原性 与免疫反应性。本发明的实用意义艾滋病是由于HIV感染破坏机体免疫系统的CD+4T淋巴细胞， 致使机体免疫力下降，导致各种机会性感染和肿瘤，但HIV究竟以什么方式破坏人体的免 疫系统仍是一个没有解决的问题。因此，艾滋病的治疗应该考虑到抗HIV的病原治疗，提高 机体的免疫力抵抗力。那么寻找使用艾滋病病毒中那种结构蛋白才能作为有效保护性抗原 是保护CD+4细胞不受侵犯，抑制HIV在体内扩散，是从根本上达到有效治疗艾滋病的目的。 另一方面，艾滋病病毒的最大特点是持续存在着潜伏复制转换和抗原性漂移，也给HIV的 药物治疗和免疫预防带来巨大的障碍。我们的研究正是围绕上述两方面的问题展开的，利 用分子克隆技术将淋巴因子编码基因IFNa-2b与env基因的抗原决定簇融合，以提高抗原 性，降低毒性，保护CDT淋巴细胞不受侵犯，从而抑制HIV在体内的扩散，最终达到有效防治 艾滋病的目的。为研究艾滋病基因疫苗免疫预防治疗提供了一个获得艾滋病病毒外膜蛋白 的途径和重要的理论实验依据。
图1为重组表达质粒pJ16env/IFNa -2b的构建 图2为重组质粒酶切鉴定
具体实施例方式实施例1 重组表达质粒pJ16env/IFNa -2b的构建图(见附图1)实施例2 重组质粒酶切鉴定图(见附图2)。
权利要求
筛选含有外源融合基因HIV/env/IFNα-2b的重组痘苗病毒的方法，其特征在于包括以下步骤①pJ16env/IFNα-2b基因重组与鉴定在无菌条件下制备大肠杆菌感受态细胞，置-70℃超低温冰箱冻存，用于转化质粒，采用CaCl2转化的方法，将含有目的基因的载体质粒转入E.coliHB101、JM109、DH-5α、JM101中，在含50μg/ml Amp的LB液体培养基中37℃振摇培养24h，分别以质粒小量提取、质粒大量提取方法制备含有目的基因的载体和表达载体，以5V/cm的电压在琼脂糖凝胶上电泳以及用限制性内切酶的酶切反应鉴定目的基因和载体，当溴酚蓝电泳至适当位置后，用长波紫外灯观察并记录结果或拍照保存，采用分光光度计测定法检测260nm和280nm的光密度OD值，计算提取质粒的浓度，置-20℃冰箱中保存，备用于连接反应，DNA目的基因片断与载体的回收；分别采用冻融法、DEAE-81纤维素膜电泳回收法、低熔点琼脂糖凝胶回收法与透析袋法；酶切DNA片段的3’凹端补平与线性质粒DNA的5′端去磷分别采用dNTP、Klenow大片段与牛小肠碱性磷酸酶分别置室温、37℃、55℃、75℃反应，将3’凹端补平与5′端去磷的线性质粒DNA用0.5weiss单位的T4DNA连接酶置16℃水浴过夜或25℃1h；进行连接反应；重组子的筛选和鉴定采用酶切法；挑选酶切结果与理论预计值相同者进一步用两种以上内切酶消化，所有酶切结果均与预计完全相同者，即为目的重组表达质粒pJ16env/IFNα-2b；②pJ16env/IFNα-2b在真核细胞中表达与鉴定真核细胞表达是以野生型痘苗病毒为介导转基因，采用脂质体转染细胞法，使pJ16env/IFNα-2b在细胞内与野生型痘苗病毒发生同源重组具体操作是分别在35mm平皿中培养的RK、BHK21以及Cos-7细胞中感染野生型痘苗病毒，感染MOI为0.1的野生型病毒，于37℃、5％CO2反应1h后与包裹脂质体的质粒进行共转染，同时设未感染病毒的正常细胞和未加转染试剂的痘苗病毒感染细胞为对照；培养48h后，以血凝素基因为报告基因，筛选纯化含目的基因pJ16env/IFNα-2b的重组痘苗病毒；利用HA特性，筛选纯化出vJ16env/IFNα-2b重组痘苗病毒株，经过3～4代的纯化直至稳定表达HA-斑为止，48h后收毒；以细胞培养法扩增重组痘苗病毒，以间接免疫荧光分析、Dot-ELISA、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白印迹方法鉴定pJ16env/IFNα-2b目的基因在真核细胞中的表达产物，确定其分子量。③pJ16env/IFNα-2b表达产物的免疫原性和免疫反应性将筛选纯化的vJ16env/IFNα-2b重组痘苗病毒接种于体外培养的单层细胞，培养约30h左右，收取感染细胞，测定病毒PFU值，调整病毒的滴度使其达到108pFU，用弗氏佐剂制备样品，采用足垫和腹腔两种免疫途径免疫小鼠，加强免疫3次，饲养60天后，眼球取血，无菌制备脾淋巴细胞，采用HIV间接ELISA试剂盒检测免疫小鼠血清HIV抗体，在DG5030型酶联免疫检测仪上依次读取490nm下的光密度值(OD490)，流式细胞仪FACS检测3000个细胞，所得数据进行统计学分析。
2.根据权利要求1所述的筛选含有外源融合基因HIV/env/IFNa_2b的重组痘苗病毒 的方法，其特征在于重组痘苗病毒vJ16env/IFNa -2b表达产物为将vJ16env/IFNa -2b表 达的蛋白产物以适当比例加入弗氏佐剂，制成具有刺激机体产生免疫反应的蛋白抗原。
3.根据权利要求1所述的筛选含有外源融合基因HIV/env/IFNa_2b的重组痘苗病毒的方法，其特征在于所述的DNA目的基因片断与载体的回收根据实验目的和DNA分子量大 小分别采用冻融法、DEAE-81纤维素膜电泳回收法、低熔点琼脂糖凝胶回收法与透析袋法。
4.根据权利要求1所述的筛选含有外源融合基因HIV/env/IFNa_2b的重组痘苗病 毒的方法，其特征在于所述的重组表达质粒pJ16enV/IFN α _2b内含目的基因片段env/ IFN α -2b (nt6220_nt8887)与 IFN α -2b (nt290_nt813)，分子量约为 9. 893kb。
5.根据权利要求1所述的筛选含有外源融合基因HIV/env/IFNa_2b的重组痘苗病毒 的方法，其特征在于VJ16enV/IFNa _2b重组痘苗病毒株表达的env蛋白能被HIV血清所 识别，分别能与1 300倍稀释后的HIV阳性血清发生较强的特异性呈色反应，其分子量为 IOOkDa0
6.根据权利要求1所述的筛选含有外源融合基因HIV/env/IFNa_2b的重组痘苗病毒 的方法，其特征在于含目的基因pJieenv/IFNa _2b的重组痘苗病毒经加入预先处理好的 鸡红细胞后镜下观察，由于野生型病毒具有完整的HA基因，所以非重组病毒感染的细胞有 HA基因蛋白表达的血凝素而能吸附鸡红细胞。肉眼观察可见病毒蚀斑呈红色片状，光镜下 可见大量鸡红细胞被吸附在病变细胞的表面。重组病毒由于外源基因片段的插入使HA失 活，其感染的细胞不能表达血凝素，故丧失了吸附鸡红细胞的能力。肉眼观察与非重组病毒 蚀斑有明显差异，镜下观察无鸡红细胞吸附，蚀斑内的细胞多数崩解、脱落，仅剩下少量细 胞融合、拥挤成堆、斑内形成空洞。
全文摘要
本发明属于基因工程疫苗生物技术领域，提供了筛选含有外源融合基因HIV/env/IFNα-2b的重组痘苗病毒的方法。本方法根据HIV外膜蛋白的抗原表位存在中和抗体决定簇，与靶细胞结合后影响病毒攻击CD4+嗜性的作用原理，构建了重组表达质粒pJ16env/IFNα-2b，采用脂质体转染法，以野生型痘苗病毒为介导转基因，使pJ16env/IFNα-2b与野生型痘苗病毒发生同源重组，利用HA特性，筛选纯化出vJ16env/IFNα-2b重组痘苗病毒株，使env/IFNα-2b融合基因与痘苗病毒在真核细胞中共表达.小鼠实验表明env/IFNα-2b融合基因与痘苗病毒共表达产物能提高实验小鼠的体液免疫与细胞免疫，表达的蛋白产物可以作为抗原进行免疫预防。本项发明为研究艾滋病病毒结构蛋白的抗原性，提供了一个获得艾滋病病毒外膜蛋白的重要途径。
文档编号G01N33/569GK101846679SQ20091001086
公开日2010年9月29日 申请日期2009年3月25日 优先权日2009年3月25日
发明者于宁, 王洪军, 邢安辉 申请人:邢安辉;王洪军;于宁