专利名称：固定scFv文库的蛋白质均衡器及制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质样品的预处理，具体地说是在大孔径聚丙烯酰胺冷凝胶整体材 料基质上固定M13噬菌体展示scFv文库，制备一种新型的蛋白质均衡器，用其处理复杂的 蛋白质样品，通过降低样品中高低丰度蛋白质的浓度差异，更好地对其进行蛋白质组学研究。
背景技术：
蛋白质均衡器技术是一种有效地样品预处理手段，通过降低样品中高低丰度蛋白 质浓度差异，富集低丰度蛋白质，提高蛋白质检测数目，从而在蛋白质组学研究中得到了广 泛地应用。与膜去除法相比，蛋白质均衡器技术特异性更好；与染料配体去除和特异抗体去 除法相比，蛋白质均衡器技术应用范围更广；与液相、等电聚焦分级预处理方法相比，蛋白 质均衡器技术操作更简便、快捷。传统的蛋白质均衡器技术是将合成的六肽库键合于硅球表面，用于处理复杂的蛋 白质样品，发现未知蛋白质。由于随机合成的六肽库中含有大量不同的六肽片段，致使样 品中很多蛋白质都能找到与之特异亲和的六肽配体。样品经肽库硅球均衡器处理后，很多 与六肽配体特异结合的蛋白质被保留在硅球表面，通过洗脱剂将其洗脱下来用于质谱或二 维电泳的分析检测。通过肽库硅球均衡器技术可以有效地减少蛋白质组动态浓度范围，富 集低丰度蛋白质，使更多低丰度蛋白质得以检测。Castagna等人曾用肽库硅球均衡器技术 和质谱检测对人尿蛋白质组进行了研究，处理前后的人尿样品分别检测到134和383个蛋 白质，证明肽库硅球均衡器技术对提高蛋白质检出率有很大帮助(CaStagna，A. ；Cecconi, D. ；Sennels, L. ；Rappsilber, J. ；Guerrier, L. ；Fortis, F. ；Boschetti, E. ；Lomas, L.； Righetti, P. G. J. ProteomeRes. 2005,4(6)，1917-1930)。最近，Sennels 等人也用肽库硅 球均衡器技术和LC-SELDI-TOF MS/MS检测方法对人血清蛋白质组学进行了研究，处理 后的人血清样品共检测出1559个蛋白质，比之前有显著提高(Sermels，L. ；Salek, M.； Lomas, L. ；Boschetti, E. ；Righetti, P. G. ；Rappsilber, J. J. ProteomeRes. 2007,6(10), 4055-4062)。此外，Carina等人也证明了肽库硅球均衡器技术可以有效地用于低丰度蛋白 质的检测(Carina Sihlbom ；Ida Kanmert ；HeIena von Bahr ；Pia Davidsson. J. Proteome Res. 2008,7(9) ,4191-4198)。尽管蛋白质均衡器技术已经被越来越多地用于样品蛋白质组学的研究，但是它仍 然存在某些不足之处，比如非特异结合和由于缺少适当的六肽配体导致的蛋白质损失等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固定M13噬菌体展示scFv文库的蛋白质均衡器及制 备和应用，以减少复杂样品中高低丰度蛋白质的浓度差异，在低丰度蛋白质富集的同时实 现对高丰度蛋白质的去除。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
—种固定scFv文库的蛋白质均衡器，于聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料表面化学键合有M13噬菌体展示scFv文库。所述聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料为30-100 μ m的大孔径聚丙烯酰胺冷凝胶整体 材料；每mL冷凝胶整体材料表面键合1 X IO10-I X IO13个M13噬菌体。所述蛋白质均衡器的制备方法30_100 μ m的大孔径聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料 载体经活化后，将Ml3噬菌体展示scFv文库键合于其表面，每mL冷凝胶整体材料表面键合 1 X IO10-I X IO13个M13噬菌体，制备成固定M13噬菌体展示scFv文库的蛋白质均衡器。所述载体表面活化的过程为，先以过量的0. 5M己二胺通入聚丙烯酰胺冷凝胶整 体材料、活化聚丙烯酰胺基质；再通入过量的质量分数5%的戊二醛反应，反应时间3-20小 时；所述将M13噬菌体展示scFv文库键合于载体表面的过程为，于聚丙烯酰胺冷凝胶 整体材料中通入含有M13噬菌体展示scFv文库的磷酸盐缓冲液，PH范围7. 4 7. 6，磷酸 盐的盐浓度为25 30mM，键合反应温度为20_30°C，反应时间12-24小时，每mL磷酸盐缓 冲液中含有1 X IO10-I X IO13个M13噬菌体。所述均衡器可用于蛋白质样品预处理，降低高丰度蛋白质的浓度并对低丰度蛋白 质进行富集，降低样品复杂程度，提高蛋白质检测数目。可将蛋白质平衡器装入5mL体积的层析柱中或涂覆在玻璃板上进行应用。利用固定M13噬菌体展示scFv文库的蛋白质均衡器处理蛋白质样品时，所采用的 洗脱过程为，以 1-2M NaCL、25-100mM pH2_3 的 Gly-HCL 缓冲液和 0. 01-0. 05unit/ μ L 的凝 血酶溶液进行三步洗脱，即利用高盐、低PH和生物活性酶三种不同类型洗脱试剂的结合， 实现柱上结合蛋白质的完全洗脱。本发明选用Μ13噬菌体展示scFv文库作为处理生物样品的配基，文库中包含 IO6-IO8个展示不同scFv片段的噬菌体，噬菌体固定后每一不同的scFv片段约有IO4-IO6个 相同拷贝；作为配基的噬菌体展示文库选用M13丝状噬菌体作为展示外源片段的载体，其 单链抗体可变区片段(scFv)具有与抗体相似的特异性和结合能力，能够与相应受体特异 识别并结合。本发明的优点为1. M13噬菌体展示scFv文库库容较大，约含IO6个展示不同scFv片段的M13噬菌 体。并且scFv特异性高、结合能力强，能够更广泛有效地富集低丰度蛋白质，减少复杂样品 中高低丰度蛋白质的浓度差异。2.配基来源方便，M13噬菌体展示scFv文库能够进行扩增，从而满足大量键合的需要。3.上样体积小，一般只需200μ g样品即可，适用于珍稀蛋白质样品的预处理。4.无论流出液还是洗脱液均被收集用于后续分析，没有人为的样品损失，能够更 全面地进行蛋白质分析。5.固定M13噬菌体展示scFv文库的蛋白质均衡器不仅能够减少蛋白质浓度差异， 富集低丰度蛋白质，还能有效去除样品中的高丰度蛋白质，从而得到更好的预处理效果。
图1噬菌体配基在聚丙烯酰胺冷凝胶表面键合反应示意图。图2聚丙烯酰胺冷凝胶的扫描电镜结果。图3经蛋白质均衡器处理收集的人血清PBS流出液SDS-PAGE结果。1 分子量Marker (97、66、43、31、20和14kDa) ；2 未键合噬菌体文库的空白聚丙烯酰胺冷凝胶处理过的人血清PBS流出液；3 蛋白质均衡器处理过的人血清PBS流出液； 4:未处理的人血清样品。图4经蛋白质均衡器处理收集的肾病患者尿蛋白PBS流出液SDS-PAGE结果。1 分子量Marker (97、66、43、31、20和14kDa) ；2 未键合噬菌体文库的空白聚丙 烯酰胺冷凝胶处理过的肾病患者尿蛋白PBS流出液；3 蛋白质均衡器处理过的肾病患者尿 蛋白PBS流出液；4 未处理的肾病患者尿蛋白样品。
具体实施例方式本发明以聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料为基质，经戊二醛活化后固定上M13噬菌体 展示的scFv文库(市购)，制备得到固定M13噬菌体展示scFv文库的蛋白质均衡器，并用 其对蛋白质样品进行预处理。具体为1)M13噬菌体展示scFv文库的扩增(按常规方法进行)5 μ L Μ13噬菌体展示 scFv文库(1 lOXlOnpfu/mL)禾Π IyL牛凝血酶(1 5unit/yL)在94 μ L无菌水中 混合，37°C温育1小时后在M13K07辅助噬菌体的帮助下，转染大肠杆菌JM109，然后在含有 lOOyg/mL氨苄青霉素和50 μ g/mL卡那青霉素的2 X TY培养基中过夜培养。得到的噬菌体 溶液再用0. 2体积的聚乙二醇(PEG)/氯化钠(NaCL)溶液(20%w/v PEG 8000,2. 5M NaCL) 进行纯化。2)固定M13噬菌体展示scFv文库的蛋白质均衡器的制备5_10mL体积的聚丙烯 酰胺冷凝胶整体材料经0. 5M己二胺和质量百分比5%的戊二醛活化后与噬菌体分子上的 氨基进行键合反应，制备得到固定M13噬菌体展示scFv文库的蛋白质均衡器，M13噬菌体 的键合量为1 2X IO12个/mL聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料。该蛋白质均衡器不使用时，用 含质量浓度0. 01% NaN3的1 XPBS保护液保护起来，于1 10°C储存待用。3)蛋白质均衡器用于样品的预处理0. 1 0. 2mg/mL样品2mL上样后室温放置30 分钟，再依次用10倍体积的1XPBS、2M NaCl、50mM pH2. 5的Gly-HCL缓冲液和0. Olunit/ μ L的凝血酶溶液进行洗脱，馏分收集后进行质谱检测。实施例1制备固定Μ13噬菌体展示scFv文库的蛋白质均衡器用于人血清蛋白质组学的研究。1)M13噬菌体展示的scFv文库在聚丙烯酰胺冷凝胶表面的键合反应如图1所示， 具体步骤如下纯化的M13噬菌体展示scFv文库溶解于IXPBS (pH7. 4)中用于键合反应， 如图2所示的5mL大孔径聚丙烯酰胺冷凝胶以10倍体积0. IMNa2CO3冲洗，配制0. 5M己二 胺通入凝胶中，室温反应4小时后水洗至中性。以10倍体积1 XPBS冲洗后与质量浓度5% 戊二醛室温反应5小时。再次用IXPBS冲洗，循环通入纯化的IOmL浓度为7. 8X 101 Ipfu/ mL的噬菌体，室温过夜反应，即制备得到固定M13噬菌体展示scFv文库的蛋白质均衡器，最终噬菌体的键合总量为5. 2 X IO12个。2)蛋白质均衡器用于人血清样品的蛋白质组学研究0. 2mg/mL人血清2mL上样 后室温放置30分钟，然后依次用50mL的1XPBS、2M NaCl和50mM pH2. 5的Gly-HCl缓冲 液进行冲洗，最后将5mL 0. Olimit/μ L的凝血酶溶液通入均衡器中37。C反应1小时，再用 IXPBS进行冲洗。对收集的PBS流出液进行SDS-PAGE分析，如图3所示蛋白质均衡器处理后的血 清样品中高低丰度蛋白质浓度差异显著减少，而未处理的和空白聚丙烯酰胺冷凝胶对照柱 处理的血清样品高低丰度蛋白质浓度差异显著。对上述各个馏分收集后进行μ RPLC-MS/MS 分析，检测结果如表1所示未经蛋白质均衡器处理的人血清样品鉴定出151个蛋白质。而 处理过的人血清样品蛋白质鉴定数目为430个，比处理前提高了约2倍。以上结果表明，固 定噬菌体展示scFv文库的蛋白质均衡器能够有效减少人血清样品中蛋白质的浓度差异， 富集低丰度蛋白质，从而显著提高蛋白质的鉴定数目。表1蛋白质均衡器处理前后的人血清样品μ RPLC-MS/MS检测结果。 实施例2制备固定M13噬菌体展示scFv文库的蛋白质均衡器用于肾病患者尿蛋白的研究。固定噬菌体展示scFv文库的蛋白质均衡器的制备及样品预处理方法同实施例1， 与实施例1不同之处在于，蛋白质均衡器用于肾病患者尿蛋白组学研究尿蛋白上样。对收 集的肾病患者尿蛋白PBS流出液进行SDS-PAGE分析，如图4所示蛋白质均衡器处理后的 肾病患者尿蛋白样品中高低丰度蛋白质浓度差异显著减少，而未处理的和空白聚丙烯酰胺 冷凝胶对照柱处理的尿蛋白样品高低丰度蛋白质浓度差异显著。对肾病患者尿蛋白的PBS 流出液、NaCL洗脱液、Gly-HCL洗脱液和凝血酶酶解液四种馏分进行μ RPLC-MS/MS分析， 检测结果如表2所示未经蛋白质均衡器处理的肾病患者尿蛋白样品鉴定出142个蛋白质。 而处理过的样品中蛋白质鉴定数目为396个，比处理前提高了约2倍。以上结果同样表明， 固定噬菌体展示scFv文库的蛋白质均衡器能够有效减少高低丰度蛋白质的浓度差异，提 高蛋白质检测数量，从而更好地进行蛋白质组学的研究。表2蛋白质均衡器处理前后的肾病患者尿蛋白μ RPLC-MS/MS检测结果。 未处理药蛋白质均衡器处理后的肾病患者尿蛋白
肾病患者 PBS流出 NaCL洗 Gly-HCL 凝血酶酶总蛋白质
「00441 本发明涉及一种固定scFv文库的蛋白质均衡器及制备和应用，是以大孔径聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料为基质，对其用戊二醛进行活化后，固定上M13噬菌体展示的单链 抗体可变区(scFv)文库，制备得到相应的的蛋白质均衡器。本发明的优点为制备方法 简便，整体材料孔径大、亲水性好，易于进行复杂蛋白质样品的预处理，M13噬菌体展示的 scFv文库能够自我扩增，配基来源方便充足。与固定六肽库的硅球均衡器技术相比，样品上 样量小，蛋白质损失少，M13噬菌体展示的scFv片段特异性高，结合能力强，使样品中低丰 度蛋白质富集的同时，有效去除高丰度蛋白质。
权利要求
一种固定scFv文库的蛋白质均衡器，其特征在于于聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料表面化学键合有M13噬菌体展示scFv文库。
2.按照权利要求1所述的蛋白质均衡器，其特征在于所述聚丙烯酰胺冷凝胶整体 材料为30-100 μ m的大孔径聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料；每mL冷凝胶整体材料表面键合 1 X IO10-I X IO13 个 M13 噬菌体。
3.—种权利要求1所述蛋白质均衡器的制备方法，其特征在于30-100μπι的大孔径聚 丙烯酰胺冷凝胶整体材料载体经活化后，将Μ13噬菌体展示scFv文库键合于其表面，每mL 冷凝胶整体材料表面键合1 X IO10-I X IO13个Μ13噬菌体，制备成固定Μ13噬菌体展示scFv 文库的蛋白质均衡器。
4.按照权利要求3所述蛋白质均衡器的制备方法，其特征在于所述载体表面活化的 过程为，先以过量的0. 5M己二胺通入聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料、活化聚丙烯酰胺基质； 再通入过量的质量分数5%的戊二醛反应，反应时间3-20小时。
5.按照权利要求3所述蛋白质均衡器的制备方法，其特征在于所述将M13噬菌体展 示scFv文库键合于载体表面的过程为，于聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料中通入含有M13噬菌 体展示scFv文库的磷酸盐缓冲液，PH范围7. 4 7. 6，磷酸盐的盐浓度为25 30mM，键合 反应温度为20-30°C，反应时间12-24小时，每mL磷酸盐缓冲液中含有1 X IO10-I X IO13个 Ml3噬菌体。
6.一种权利要求1所述蛋白质均衡器的应用，其特征在于所述均衡器可用于蛋白质 样品预处理，降低高丰度蛋白质的浓度并对低丰度蛋白质进行富集，降低样品复杂程度，提 高蛋白质检测数目。
7.按照权利要求6所述蛋白质均衡器的应用，其特征在于可将蛋白质均衡器装入5mL 体积的层析柱中或涂覆在玻璃板上进行应用。
8.按照权利要求6所述蛋白质均衡器的应用，其特征在于利用固定M13噬菌体展 示scFv文库的蛋白质均衡器处理蛋白质样品时，所采用的洗脱过程为，以1-2M NaCL, 25-100mM pH2_3的Gly-HCL缓冲液和0. 01-0. 05unit/ μ L的凝血酶溶液进行三步洗脱，即 利用高盐、低PH和生物活性酶三种不同类型洗脱试剂的结合，实现柱上结合蛋白质的完全 洗脱。
全文摘要
本发明涉及一种固定scFv文库的蛋白质均衡器及制备和应用，是以大孔径聚丙烯酰胺冷凝胶整体材料为基质，对其用戊二醛进行活化后，固定上M13噬菌体展示的单链抗体可变区(scFv)文库，制备得到相应的蛋白质均衡器。本发明的优点为制备方法简便，整体材料孔径大、亲水性好，易于进行复杂蛋白质样品的预处理，M13噬菌体展示的scFv文库能够自我扩增，配基来源方便充足。与固定六肽库的硅球均衡器技术相比，样品上样量小，蛋白质损失少，M13噬菌体展示的scFv片段特异性高，结合能力强，使样品中低丰度蛋白质富集的同时，有效去除高丰度蛋白质。
文档编号G01N1/34GK101846687SQ20091001087
公开日2010年9月29日 申请日期2009年3月25日 优先权日2009年3月25日
发明者张丽华, 张玉奎, 张维冰, 梁振, 赵鹏 申请人:中国科学院大连化学物理研究所