专利名称：：一种蛋白质芯片玻璃载体的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种蛋白质芯片玻璃载体的制备方法，属于生物检测
技术领域：
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背景技术：
：蛋白质芯片，又称蛋白质微阵列，是继基因芯片之后发展起来的以蛋白质为研究对象的生物检测技术，它为研究生命活动开辟了更为广阔的前景，提供了新型有效的研究手段。相比DNA，蛋白质的化学成分、结构和功能更为复杂多变，固定在微阵列载体表面的蛋白质容易变性失活，因此寻找合适的载体和表面修饰方法以使单位面积上固定足够量的蛋白质并保持其天然构象是制备高质量蛋白质芯片的关键问题。目前制作蛋白芯片的载体有很多种，如玻璃片、硅片、金片、聚丙烯酰胺膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等(《.r,/加权Kt/柳'，朋c///JW/2W-260A其中玻璃片由于具有廉价、表面光滑、荧光背景低、性能稳定等诸多优点，成为制备蛋白质芯片的首选。但玻璃片的表面修饰使之具有高的蛋白固定量并保持原有功能的结构状态一直是人们要解决的首要问题。玻璃片的修饰方法有很多，如戊二醛修饰法、聚赖氨酸修饰法、巯基修饰法、多糖修饰法等，按其在玻片表面形成的结构可分为两大类第一类是醛基、氨基、环氧基、羧基等形成的二维修饰表面，这类大多是通过共价键或特殊分子间的高亲合力把蛋白固定在其表面，蛋白质结合牢固。此法制作简单，成本较低，点样均一，目前应用比较广泛，但其蛋白质的固定量不理想，敏感度较低，最低检测限较高。第二类是聚丙烯酰胺、琼脂糖、硝化纤维等在玻片表面包被一层凝胶或树突状多聚物，然后再在这些基质上引入活性基团，从而在玻片表面形成三维立体结构。此类载体由于具有三维多孔结构，载体表面和蛋白质探针的接触面积大大增加，因此蛋白的固定量比二维平面载体大得多，但这类载体主要依靠物理吸附固定蛋白，由于与蛋白间缺少强的键合导致蛋白质在反复冲洗过程中易流失。因此引入新的思路与方法对蛋白质芯片表面进行处理，使之具有蛋白固定量大、活性高、工艺简单、成本低、易推广等特点仍是蛋白质芯片领域亟待解决的重要问题。发明目的和内容本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种蛋白质芯片玻璃载体的制备方法。本发明采用LB法或简单的提拉法在玻片表面镀上聚苯乙烯微球膜以增大玻片的比表面积，再用有机硅垸对其进行进一步的修饰，利用氨基、巯基与蛋白质间的共价键作用实现与蛋白质的牢固结合，具有蛋白质固定量大、活性高、成本低等特点。本发明制备方法的技术方案如下本发明蛋白质芯片玻璃载体的制备方法，具体工艺为玻璃载体经预处理后，首先采用LB法(Langmuir-Blodgett法)或简单的提拉法在其表面铺上聚苯乙烯微球单层膜；然后，用有机硅烷对其进行进一步的修饰；最后，干燥即可。上述玻璃载体预处理工艺将玻璃载体在重铬酸钾洗液中浸泡424h，用超纯水冲洗干净后干燥备用。所述聚苯乙烯微球的粒径为200-400nm，采用以下工艺制备-将SDS(十二烷基硫酸钠)与KPS(过硫酸钾)以摩尔比0.20.9:1溶解于140mL醇水混合溶液中(醇水体积比为0-l:1)，在N2保护下搅拌30min;然后将该体系置入7(TC水浴中，加热搅拌10min后，加入610mL苯乙烯(St)单体，反应10h后，收取产物乳液，过滤，干燥，即可获得聚苯乙烯微球。所述在玻璃载体上铺设聚苯乙烯微球单层膜的LB方法，其具体工艺为将上述制备的聚苯乙烯微球分散至体积比为1:1的水-乙醇溶液中，然后量取一定量的溶液将其均匀分散在水T超纯水)—面上，待乙醇溶剂蒸发后，控制表面压值达到10~35mN/m时，将玻璃载体固定在垂直升降的提拉结构上开始拉膜，提拉速度1-10mm/min;膜层成型后干燥即可获得聚苯乙烯微球单层膜。所述在玻璃载体上铺设聚苯乙烯微球单层膜的普通提拉法，其具体工艺为将上述制备的聚苯乙烯微球分散至体积比为1:1的水-乙醇溶液中，将玻璃载体浸入该溶液中，以l-10mm/min的速度向上提拉；膜层成型后干燥即可获得聚苯乙烯微球单层膜。玻璃载体用聚苯乙烯微球单层膜修饰后，再用有机硅垸对其进行进一步的修饰。具体工艺为将已覆盖聚苯乙烯微球单层膜的玻璃载体放入有机硅垸溶液中，浸泡310分钟后干燥即可。上述有机硅烷溶液是体积浓度为0.5~10%的氨基硅烷醇类溶液、体积浓度为0.5~10%的巯基硅烷醇类溶液的混合溶液或其中之一。按本发明方法制备的蛋白质芯片玻璃载体与现有制备技术相比，具有以下优点(1)蛋白质固定率高，在优化条件下，蛋白质的固定率可达96%。(2)所得的蛋白质芯片的信噪比高，最高可达2.98。(3)所得的芯片能与蛋白质实现较强的结合。^图1-一本发明所得的聚苯乙烯微球的扫描电镜照片图2—LB法制备的聚苯乙烯微球单层膜的模压曲线图3—LB法制备的聚苯乙烯微球单层膜的原子力显微镜照片图4--无聚苯乙烯微球单层膜修饰的玻片固定巯基硅烷的原子力显微镜照片图5--用聚苯乙烯微球单层膜修饰的玻片固定巯基硅烷的原子力显微镜照片图6--氨基硅烷修饰聚苯乙烯微球膜的玻片洗涤前荧光图像图7--氨基硅垸修饰聚苯乙烯微球膜的玻片洗涤后荧光图像图8--氨基硅垸修饰聚苯乙烯微球膜的玻片的荧光强度具体实施例方式实施例1:(1)载玻片的预处理将载玻片浸入重铬酸钾洗液中浸泡24h,用超纯水冲洗干净后，烘干备用。(2)聚苯乙烯球的制备将0.075gSDS，0.2gKPS，溶解于140mL醇水混合溶液(醇水体积比为2:5)中，在N2保护下搅拌30min，然后将该体系置入70'C水浴中，搅拌10min后加入7mL苯乙烯(St)单体，反应10h，收取产物乳液，抽滤，干燥后备用。所得产物见附图1。从附图1中可以看出本发明制备的聚苯乙烯微球分散性好，粒径均匀，大约在200nm左右，球体完整无明显的破损，无团聚。(3)聚苯乙烯微球单层膜的制备(LB法)0.5g干燥的聚苯乙烯微球分散至lOmL体积比为1:1的水-乙醇溶液中，然后用微量注射器量取一定量的溶液将其均匀分散在水面(超纯水)上，待溶剂蒸发后，启动LB拉膜仪的滑障使其缓慢移向中间位置，并测定表面压(见附图2)。由附图2可以看出，PS微球可以在水面上铺展形成单层膜，而且成膜效果较好。当表面压为15mN/m时滑障达到安全阀位置，膜压停止上升。将预处理后的载玻片固定在垂直升降的提拉结构上开始拉膜，提拉速度2mm/min。膜层成型后干燥即可获得聚苯乙烯微球单层膜(见附图3)。从附图3中可清晰看到玻片表面有一层PS球，它们呈六方密堆积排列，球的尺寸约200nm，与图1扫描电镜的结果相符。(4)聚苯乙烯微球单层膜的进一步修饰将按上述工艺修饰后的玻片置入1%的氨基硅烷乙醇溶液中，浸泡10分钟。烘干后得到本发明所述的蛋白质芯片载体。通过附图4-5的AFM(原子力显微镜)照片可以发现铺有PS膜的玻片经巯基硅烷修饰后，玻片表面更加凹凸不平，玻片比表面积显著增大，单位面积内固定的巯基硅烷明显增多，巯基硅烷多分布在PS球的周围。(5)芯片的固定率及反应性将Cy3标记的山羊抗兔IgG(lmg/mL)按2000倍的比例稀释，点样于玻片形成阵列，然后置于37'C孵育lh，用Ecoscan荧光扫描仪获取荧光图像，测定并取其平均灰度值(A!)。再将玻片取出后，用含0.2%PBST振荡洗涤，除去未结合抗体，晾干，再用Ecoscan荧光扫描仪获取荧光图像，测定其显色强度并取其均值(A2)。固定率二A2/AiX1000/0。用氨基硅垸修饰200nm聚苯乙烯微球膜的玻片洗涤前后荧光图如附图6-7所示。由附图可见，该玻片点样点圆润、清晰，无明显拖尾现象，荧光背底也不是很强，即使洗涤以后，点样点形状依旧保持得很好。这表明修饰后的玻片对蛋白有着很强的固定性。经计算氨基硅烷修饰的200nm聚苯乙烯球膜的玻片固定率能够达到96.8%。将空白兔血清按10000倍的比例稀释后，点样于玻片表面，37'C孵育lh，ffl0.2%PBST振荡洗涤，晾干。玻片上加1%小牛血清蛋白，以封闭未反应的醛基，孵育1h后用含0.2%PBST振荡洗涤玻片。加入1:1000倍稀释的Cy3标记的羊抗兔IgG(lmg/mL)，37'C孵育1h，洗涤玻片，方法同上。扫描并测定其显色强度。氨基硅烷修饰200nm聚苯乙烯微球膜的玻片的荧光强度见附图8。由附图可知，该玻片在测试中荧光背底比较低，点样点荧光强度高，可以推断该反应蛋白活性较高并且反应具有良好的信噪比。经计算，氨基硅烷修饰的200nm聚苯乙烯球膜的玻片的荧光强度为68.7，信噪比高达2.08。实施例2:(1)载玻片的预处理将载玻片浸入重铬酸钾洗液中浸泡10h，用超纯水冲洗干净后，烘干备用。(2)聚苯乙烯球的制备将0.15gSDS，0.25gKPS，溶解于140mL醇水混合溶液(醇水体积比为2:5)溶液中，在N2保护下搅拌30min,然后将该体系置入7(TC水浴中，搅拌10min后加入5mL苯乙烯(St)单体，反应10h，收取产物乳液，抽滤，干燥后备用。(3)聚苯乙烯微球单层膜的制备(普通提拉法)0.5g干燥的聚苯乙烯微球分散至10mL体积比为1:1的水-乙醇溶液中，将预处理后的载玻片浸入该溶液中，以3mm/min的速度向上提拉。膜层成型后干燥即可获得聚苯乙烯微球单层膜。(4)聚苯乙烯微球单层膜的进一步修饰将按上述工艺修饰后的玻片置入1°/。的氨基硅烷乙醇溶液中，浸泡10分钟。烘干后得到本发明所述的蛋白质芯片载体。—(5)芯片的固定率及反应性将Cy3标记的山羊抗兔IgG(lmg/mL)按2000倍的比例稀释，点样于玻片形成阵列，然后置于37'C孵育4h，测其固定率可达91.63%。将空白兔血清按10000倍的比例稀释后，点样于玻片表面，37'C孵育4h，用0.2%PBST振荡洗涤，晾干。玻片上加1。/。小牛血清蛋白，以封闭未反应的醛基，孵育4h后用含0.2%PBST振荡洗涤玻片。加入1:1000倍稀释的Cy3标记的羊抗兔IgG(lmg/mL)，37。C孵育4h，测其荧光强度为56.7，信噪比为2.98。其它实施例如下制备工艺同实施例1和2，其工艺技术参数如下表所示。制备工艺3456载玻片的预处理重铬酸钾洗液浸泡时间(h)481220聚苯乙烯球的制备SDS:KPS(mol)0.230.60.70.9醇水混合溶液醇水体积比0:10,2:10.6:10.8:1苯乙烯单体的体积(mL)68910法表面压值18202530提拉速度1345聚苯乙烯微球单层膜的进一步修饰有机硅烷溶液氨基硅烷醇类溶液体积浓度(％)23巯基硅烷醇类溶液-体积浓度(％)0.51.523浸泡时间(分钟)3568制备.r.艺78910载玻片的预处理重铬酸钾洗液浸泡时间(h)481220聚苯乙烯球的制备SDS:KPS(mol)0.230.60.70.9醇水混合溶液醇水体积比0:10.2:10.6:10.8:1苯乙烯单体的体积(mL)68910普通提拉法聚苯乙烯微球的浓度(g/mL)51310提拉速度(mm/min)4568<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1、一种蛋白质芯片玻璃载体的制备方法，其特征在于玻璃载体经预处理后，以LB法(Langmuir-Blodgett法)或简单的提拉法在其表面铺上聚苯乙烯微球单层膜；然后，用有机硅烷对其进行进一步的修饰；最后，干燥即可。2、如权利要求1所述的一种蛋白质芯片玻璃载体的制备方法，其特征在于所述玻璃载体预处理工艺将玻璃载体在重铬酸钾洗液中浸泡424h，用超纯水冲洗干净后干燥即可。3、如权利要求l所述的一种蛋白质芯片玻璃载体的制备方法，其特征在于所述的聚苯乙烯微球粒径为200~400nm，采用以下工艺制备-将SDS(十二烷基硫酸钠)与KPS(过硫酸钾)以摩尔比0.20.9:1溶解于140mL醇水混合溶液中(醇水体积比为01:1)，在N2保护下搅拌30min;然后将该体系置入70'C水浴中，加热搅拌10min后，加入610mL苯乙烯(St)单体，反应10h后，收取产物乳液，过滤，干燥，即可获得聚苯乙烯微球。4、如权利要求l所述的一种蛋白质芯片玻璃载体的制备方法，其特征在于所述在玻璃载体上铺设聚苯乙烯微球单层膜的LB方法，其具体工艺为将聚苯乙烯微球分散至体积比为1:1的水-乙醇溶液中，然后量取一定量的溶液将其均匀分散在水(超纯水)面上，待乙醇溶剂蒸发后，控制表面压值达到10~35mN/m时，将玻璃载体周定在垂直升降的提拉结构上开始拉膜，提拉速度1-10mm/min;膜层成型后干燥即可获得聚苯乙烯微球单层膜。5、如权利要求l所述的一种蛋白质芯片玻璃载体的制备方法，其特征在于所述在玻璃载体上铺设聚苯乙烯微球单层膜的普通提拉法，其具体工艺为将聚苯乙烯微球分散至体积比为1:1的水-乙醇溶液中，将玻璃载体浸入该溶液中，以l-10mm/min的速度向上提拉；膜层成型后干燥即可获得聚苯乙烯微球单层膜。6、如权利要求l所述的一种蛋白质芯片玻璃载体的制备方法，其特征在于所述玻璃载体用聚苯乙烯微球单层膜修饰后，再用有机硅垸对其进行进一步的修饰，即将已覆盖聚苯乙烯微球单层膜的玻璃载体放入有机硅烷溶液中，浸泡3一0分钟后干燥即可。7、如权利要求6所述的一种蛋白质芯片玻璃载体的制备方法，其特征在于所述有机硅烷溶液是体积浓度为0.5~10°/。的氨基硅烷醇类溶液、体积浓度为0.5~10%的巯基硅垸醇类溶液的混合溶液或其中之一。全文摘要本发明涉及一种蛋白质芯片玻璃载体的制备方法，属于生物检测
技术领域：
。本发明制备方法首先以LB法或简单提拉法在预处理后的玻片表面铺上聚苯乙烯微球单层膜，再用有机硅烷对其进行进一步的修饰，干燥后即可获得蛋白质芯片玻璃载体。本发明利用氨基、巯基与蛋白质间的共价键作用实现与蛋白质的牢固结合。本发明制备的蛋白质芯片玻璃载体蛋白质固定率高，可达96％；信噪比高，可达2.98；芯片与蛋白质结合牢固。文档编号G01N33/551GK101672847SQ200910019530公开日2010年3月17日申请日期2009年9月30日优先权日2009年9月30日发明者娜于,妍单,陈克正申请人:青岛科技大学