专利名称：蜂王浆中乙酰胆碱的检测方法
技术领域：
本发明是检测蜂王浆中乙酰胆碱的新技术，属于酰胆碱含量检测的技术领域。
背景技术：
人的脑组织有大量乙酰胆碱，但乙酰胆碱的含量会随着年龄的增加而下降，引起各种与记忆力有关的精神类疾病如老年痴呆症等。保持和提高大脑中乙酰胆碱的含量，是解决记忆力下降的根本途径。乙酰胆碱在自然界中多以胆碱的形式
存在，胆碱必须与人体中的乙酰辅酶A起生化反应后，才能合成具有生理活性的乙酰胆碱，蜂王浆中直接以乙酰胆碱形式存在，可直接被人体吸收利用，所以蜂王浆对预防老年性痴呆症、记忆力下降有一定效果。因此，蜂王浆中乙酰胆碱的检测有重要意义。
乙酰胆碱不具备电化学活性，且没有可供光谱检测的官能团，很难用电化学或光谱法直接检测。国内外的研究主要是以乙酰胆碱酯酶为基础建立的检测方法，其缺点是所用酶的价格贵且应用程序复杂。最近用液相色谱和质谱联用建立的乙酰胆碱方法研究的比较多，质谱检测仪灵敏度高、选择性强，但所用仪器昂贵，分析成本高。
电致化学发光检测是一种简便的、检测灵敏度高、选择性好的检测技术，而毛细管电泳是新兴的分离能力强的一项分析技术，它们已经引起分析工作者越来越多的重视。但据我们所知，这两种分析技术都还没被应用到胆碱或乙酰胆碱的检测。
发明内容
技术问题本发明的目的是利用毛细管电泳分离-电致化学发光检测技术结合而建立的蜂王浆中乙酰胆碱的检测方法，该方法简单、经济、准确性好。技术方案本发明的蜂王浆中乙酰胆碱的检测方法具体如下a.蜂王桨的前处理将新鲜蜂王浆置于80 100。C的烘箱中烘烤，使其水分完全挥发，然后研磨，称取l 2g的粉末装在密闭的容器中，再置于130 170。C的烘箱中烘烤3 5分钟；向密闭的容器中注射2 4mL水，得到的溶液经离心、过滤即可被使用；
b. 毛细管电泳分离将经过前处理的蜂王浆用高压进样5 10s,用pH5.0 11.0的缓冲液做分离介质，在8 15KV高压下进行分离；
c. 电致化学发光检测经毛细管电泳分离出来的目标组分流入电致化学发光检测池被检测；选用的检测体系是经典的三联吡啶钌检测体系，体系中含2 8mM的钌溶液，pH约7.0-9.0，采用三电极系统，铂丝为对电极，银-氯化银电极做参比电极，500卞m的铂圆盘电极做工作电极；目标组分与干扰组分出峰时间相差200~250s，用标准曲线法即可对蜂王浆样品中的乙酰胆碱定量检测。
有益效果本方法可用于蜂王浆等样品中乙酰胆碱的检测。加标回收实验，回收率在92%至107%;日内和日间标准偏差分别小于4.9%和6.8%。证明本检测技术是准确的，可靠的。
图1是蜂王浆中乙酰胆碱的毛细管电泳分离-电致化学发光检测图谱。
具体实施例方式
1试剂和仪器
乙酰胆碱标准品；蜂王浆；烘箱；毛细管电泳仪；电致化学发光仪。2方法
1) 蜂王浆的前处理
乙酰胆碱是季胺碱，本身不能增强或减弱钌联吡啶的电致化学发光信号。本技术将蜂王浆置于100°C的烘箱中烘烤10个小时，使其水分完全挥发，然后研磨，称取粉末约lg左右装在密闭的容器中(本容器先被减压)，再置于150°(:的烘箱中烘烤3分钟。在此过程，乙酰胆碱会发生分解反应生成易溶于水的三甲胺。立即用注射器向密闭的容器中注射3mL水吸收三甲胺，得到的溶液经离心、过滤即
可被应用。
2) 毛细管电泳分离技术
蜂王浆经过前处理得到的溶液中有许多干扰物，必须经过分离才能被准确检领J。在10KV的高压下电动进样10s,用35mMpH8.0的磷酸盐缓冲液做分离介质，在15KV的高压下进行分离，目标组分约在4分钟时出峰，而干扰组分在6.5分钟左右出峰，两者被完全分开。3)电致化学发光检测条件
选用的检测体系是经典的三联吡啶钌检测体系，体系中含5mM的钌溶液，pH=8.0，采用三电极系统，铂丝为对电极，银-氯化银电极(3.0MNaCl)做参比电极，500卞m的钼圆盘电极做工作电极。光电倍增管高压为600V.检测电位是1.15V.来康牌蜂王浆中乙酰胆碱的检测一，蜂王浆的前处理
取40.44 g新鲜来康牌蜂王桨(南京珍珠泉蜂制品厂)在100。C的烘箱中加热12小时，当蜂王桨完全干燥后称重为22.68g,将其在研钵中研磨成细粉。称0.343 g细粉置于玻璃瓶中(预先在135。C的烘箱中烘干5分钟)，用橡皮塞迅速密封。再置于160。C的烘箱中加热3分钟取出。用注射器迅速向此密封瓶中注入5mL水，摇匀，过滤，收集续滤液。二，处理后样品的分离和检测
将续滤液稀释10倍在10KV的高压下电动进样10s,用35mM pH8.0的磷酸盐缓冲液做分离介质，在15KV的高压下进行分离。检测体系中是5mM的钌溶液，pH=8.0，采用三电极系统，铂丝为对电极，银-氯化银电极(3.0MNaCl)做参比电极，500卞m的铂圆盘电极做工作电极。光电倍增管高压设为600V.检测电位是1.15V.图谱显示三甲胺和蜂王浆中的其它成分分开完全。重复三次，记录有效成份三甲胺的平均蜂高为135。三，标准曲线的绘制。
取0.1075g标准的乙酰胆碱置于在135 °(3的烘箱中烘干过的玻璃瓶中，用橡皮塞迅速密封，置于160。C的烘箱中加热1分钟取出。用注射器迅速向此密封瓶中注入10mL水，摇匀。将此10mL溶液转移至100mL容量瓶中定容。配制浓度从7.5 x10—7到4.3 xlO—Sg/mL的一系列标准溶液，绘制标准曲线，求得回归方程为y = 6.2 +126.3x = 0.9996， w = 6)。四，计算。
将样品续滤液的平均峰高值带入标准曲线的回归方程，经换算得该来康牌蜂王浆中乙酰胆碱的含量为825±64 pg/g。做加标回收实验，回收率在87-111%之间。日间和日内精密度分别为5.2%和9.8%。
权利要求
1. 一种蜂王浆中乙酰胆碱的检测方法，其特征在于该方法为a. 蜂王浆的前处理将新鲜蜂王浆置于80～100℃的烘箱中烘烤，使其水分完全挥发，然后研磨，称取1～2g的粉末装在密闭的容器中，再置于130～170℃的烘箱中烘烤3～5分钟；向密闭的容器中注射3～5mL水，得到的溶液经离心、过滤即可被使用；b. 毛细管电泳分离将经过前处理的蜂王浆用高压进样5～10s，用pH5.0～11.0的缓冲液做分离介质，在8～15KV高压下进行分离；c. 电致化学发光检测经毛细管电泳分离出来的目标组分流入电致化学发光检测池被检测；选用的检测体系是经典的三联吡啶钌检测体系，体系中含2～8mM的钌溶液，pH约7.0～9.0，采用三电极系统，铂丝为对电极，银-氯化银电极做参比电极，500-μm的铂圆盘电极做工作电极；目标组分与干扰组分出峰时间相差200～250s，用标准曲线法即可对蜂王浆样品中的乙酰胆碱定量检测。
全文摘要
蜂王浆中乙酰胆碱的检测方法是利用毛细管电泳分离-电致化学发光检测技术结合而建立的蜂王浆中乙酰胆碱的检测方法，该方法为a.蜂王浆的前处理，b.毛细管电泳分离，c.电致化学发光检测，经毛细管电泳分离出来的目标组分流入电致化学发光检测池被检测；选用的检测体系是经典的三联吡啶钌检测体系，体系中含2～8mM的钌溶液，pH约7.0～9.0，采用三电极系统，铂丝为对电极，银-氯化银电极做参比电极，500-μm的铂圆盘电极做工作电极；目标组分与干扰组分出峰时间相差200～250s，用标准曲线法即可对蜂王浆样品中的乙酰胆碱定量检测。该方法简单、经济、准确性好。
文档编号G01N27/447GK101477078SQ20091002845
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月20日 优先权日2009年1月20日
发明者伟 卫, 康学军, 邓慧华, 陆祖宏 申请人:东南大学