专利名称：一种玻载电泳法分析粘多糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种分析粘多糖的方法，尤其涉及一种玻载电泳分析粘多糖的方法。
背景技术：
粘多糖类(Mucopolysaccharides)是一类胞外生物高分子，是动物体内蛋白多糖 (Proteoglycan)分子中的糖链部分。粘多糖类是重要的生物高分子化合物，已证实此类成 分具有多种药理活性，包括抗凝血、降血脂、抗病毒、抗肿瘤及抗放射等作用。粘多糖中具有 代表性的有肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素等几种，为硫酸化、乙酰化的糖胺 和糖醛酸二糖重复单位相连而成的长链。这些粘多糖结构类似，且都是离散分布的糖链的组合，增加了分析方面的难度。目 前主要分析方法有电泳法、HPLC法、毛细管电泳法、核磁共振法、质谱法等。其中Volpi N等 建立的琼脂糖凝胶电泳法因为方法简单、结果稳定、设备要求低等原因而广为使用。但目前的电泳方法存在一定缺陷，首先，多糖在电泳后染色和脱色时容易从胶板 内逸出，严重影响分析结果；其次，电泳结果不易保存，胶板保存在水中1-2天后，粘多糖斑 点就会因为多糖扩散出去而造成斑点退色；最后，琼脂糖凝胶电泳上样量有限，难以满足药 厂大规模分析的需要。
发明内容
为了克服目前电泳分析粘多糖方法所存在的缺陷，本发明提供了一种玻载电泳分 析粘多糖的方法，最终得到一个紧密附着在玻璃板上的干燥的凝胶电泳结果。本发明包括下述顺序的步骤(1)制胶准备一块洁净干燥的玻璃板，其宽度与所使用电泳槽宽度相吻合，其长度略短于 所用电泳槽。用硬质胶带围绕玻璃板周长紧密缠绕一周使形成一个可容纳5mm深液体的方 形容器，取格式梳架于相应上样位置，然后放置在水平的桌面。将琼脂糖在沸水中溶于PH 值5. 8、浓度为0. 04mol/L乙酸钡-乙酸缓冲溶液，使琼脂浓度为0. 5-1 %，待冷却至约50°C 时倒在准备好的玻璃板上，厚度为l_5mm。凝固后移去格式梳，撕掉胶带即为电泳用胶板。(2)电泳将1-5 y L的浓度为lmg/mL的粘多糖溶液上样于点样孔，先在pH值为5. 8、浓度 0. 04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液中以5-7mA/cm胶宽稳流电泳1小时，然后在pH值9. 0、 浓度为0. 05mol/L的1、2_ 二氨基丙烷-乙酸缓冲溶液中以5-7mA/cm胶宽稳流电泳1小时。(3)染色和脱色电泳结束后将凝胶连带玻璃板取出，放入干燥箱中60-80°C烘干，再放入装有 0. 2%甲苯胺蓝溶液的容器中于脱色摇床上染色30分钟。最后将凝胶板放入装有水的容器 中浸泡脱色，更换1-2次水，胶上背景透明后重新放入干燥箱中60-80°C烘干。得到的最终 结果为一个紧密附着在玻璃板上的膜状电泳结果，上面有各种粘多糖的斑点，可以以飞点扫描仪扫描定量。在上述电泳方法中，步骤(1)中所述电泳用凝胶板是在普通的、无色玻璃板上制 成的，所述凝胶优选为高强度琼脂、琼脂糖IV，所述凝胶浓度优选为0. 6%，所述凝胶厚度 优选为2mm。步骤(2)所述粘多糖上样量优选为3 y L (lmg/ml)，所述电泳时电流强度优选 为6. 4mA/cm胶宽。步骤(3)所述凝胶烘干温度优选为80°C，所述染色和脱色都是在凝胶烘 干状态下完成的。本发明所述的玻载电泳法，最终的电泳结果为附着在玻璃上的干燥的膜，利于标 记、观察、分析，并能长久保存。采用适当的电泳仪，该方法将单次上样量从一般平板电泳的 12-24个可提高到72个，便于大规模分析。本发明所述的玻载电泳法还具有操作简单、对生 产环境和设备要求不高等特点，极利于药厂或科研机构建立实施。本发明所述的玻载电泳 法能将肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸类肝素等粘多糖物质进行有效分离，有助于对 粘多糖进行准确地定性定量。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明所述内容作进一步阐述。实施例一准备若干块洁净干燥的玻璃板(7. 8cmX6. 0cm, 1. 5mm厚)，用硬质胶带围绕玻璃 板周长紧密缠绕一周，放置在水平的桌面，取格式梳横向架于距下端5mm位置。将琼脂糖在 沸水中溶于PH5. 8、浓度0. 04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液，使琼脂浓度为0. 5%，冷却至 约50°C时倒在玻璃板上，厚度为2mm。凝固后移去格式梳，撕掉胶带即为电泳用胶板。将两块电泳板并排放入电泳槽中，取浓度lmg/ml的粘多糖溶液3 y L上样于点样 孔，先在PH值5. 8、浓度0. 04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液中以6. 4mA/cm胶宽稳流电泳 1小时，然后在pH值9. 0,0. 05mol/L的1、2_ 二氨基丙烷-乙酸缓冲溶液中以6. 4mA/cm胶 宽稳流电泳1小时。电泳结束后将凝胶连带玻璃板取出，放入干燥箱中80°C烘干，再放入装有0.2% 甲苯胺蓝溶液的容器中于脱色摇床上染色30分钟。将凝胶板放入装有水的培养皿中浸泡 脱色，更换1-2次水，胶上背景透明后重新放入干燥箱中80°C烘干。得到的最终结果为一个 紧密附着在玻璃板上的膜状电泳结果，上面有各种粘多糖的斑点，可以以飞点扫描仪扫描定量。实施例二准备若干块洁净干燥的玻璃板(7. 8cmX6. 0cm, 1. 5mm厚)，用硬质胶带围绕玻璃 板周长紧密缠绕一周，放置在水平的桌面，取格式梳横向架于距下端5mm位置。将琼脂糖在 沸水中溶于pH值5. 8,0. 04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液，使琼脂浓度为0. 5%，冷却至约 50°C时倒在玻璃板上，厚度为3mm。凝固后移去格式梳，撕掉胶带即为电泳用胶板。将两块电泳板并排放入电泳槽中，取浓度为lmg/ml的粘多糖溶液4 y L上样于点 样孔，先在PH值5. 8、浓度0. 04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液中以5mA/cm胶宽稳流电泳 1小时，然后在pH值9. 0、0. 05mol/L的1、2_ 二氨基丙烷-乙酸缓冲溶液中以5mA/cm胶宽 稳流电泳1小时。电泳结束后将凝胶连带玻璃板取出，放入干燥箱中60°C烘干，再放入装有0. 2%
4甲苯胺蓝溶液的容器中于脱色摇床上染色30分钟。将凝胶板放入装有水的培养皿中浸泡 脱色，更换1-2次水，胶上背景透明后重新放入干燥箱中60°C烘干。得到的最终结果为一个 紧密附着在玻璃板上的膜状电泳结果，上面有各种粘多糖的斑点，可以以飞点扫描仪扫描定量。实施例三准备若干块洁净干燥的玻璃板(7. 8cmX6. 0cm, 1. 5mm厚)，用硬质胶带围绕玻璃 板周长紧密缠绕一周，放置在水平的桌面，取格式梳横向架于距下端5mm位置。将琼脂糖在 沸水中溶于PH值5. 8、浓度0. 04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液，使琼脂浓度为0. 8%，冷 却至约50°C时倒在玻璃板上，厚度为1mm。凝固后移去格式梳，撕掉胶带即为电泳用胶板。将两块电泳板并排放入电泳槽中，取浓度为lmg/ml的粘多糖溶液5 y L上样于点 样孔，先在PH值5. 8、浓度0. 04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液中以6mA/cm胶宽稳流电泳 1小时，然后在PH值9. 0、浓度0. 05mol/L 1、2_ 二氨基丙烷-乙酸缓冲溶液中以6mA/cm胶 宽稳流电泳1小时。电泳结束后将凝胶连带玻璃板取出，放入干燥箱中65°C烘干，再放入装有0. 2% 甲苯胺蓝溶液的容器中于脱色摇床上染色30分钟。将凝胶板放入装有水的培养皿中浸泡 脱色，更换1-2次水，胶上背景透明后重新放入干燥箱中65°C烘干。得到的最终结果为一个 紧密附着在玻璃板上的膜状电泳结果，上面有各种粘多糖的斑点，可以以飞点扫描仪扫描定量。实施例四准备若干块洁净干燥的玻璃板(7. 8cmX6. 0cm, 1. 5mm厚)，用硬质胶带围绕玻璃 板周长紧密缠绕一周，放置在水平的桌面，取格式梳横向架于距下端5mm位置。将琼脂糖在 沸水中溶于PH值5. 8、浓度0. 04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液，使琼脂浓度为1 %，冷却 至约50°C时倒在玻璃板上，厚度为4mm。凝固后移去格式梳，撕掉胶带即为电泳用胶板。将两块电泳板并排放入电泳槽中，取浓度为lmg/ml的粘多糖溶液1 P L上样于点 样孔，先在PH值5. 8、浓度0. 04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液中以6. 5mA/cm胶宽稳流电泳 1小时，然后在PH值9. 0、浓度0. 05mol/L的1、2_ 二氨基丙烷-乙酸缓冲溶液中以6. 5mA/ cm胶宽稳流电泳1小时。电泳结束后将凝胶连带玻璃板取出，放入干燥箱中70°C烘干，再放入装有0.2% 甲苯胺蓝溶液的容器中于脱色摇床上染色30分钟。将凝胶板放入装有水的培养皿中浸泡 脱色，更换1-2次水，胶上背景透明后重新放入干燥箱中70°C烘干。得到的最终结果为一个 紧密附着在玻璃板上的膜状电泳结果，上面有各种粘多糖的斑点，可以以飞点扫描仪扫描定量。实施例五准备若干块洁净干燥的玻璃板(7. 8cmX6. 0cm, 1. 5mm厚)，用硬质胶带围绕玻璃 板周长紧密缠绕一周，放置在水平的桌面，取格式梳横向架于距下端5mm位置。将琼脂糖在 沸水中溶于PH值5. 8、浓度0. 04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液，使琼脂浓度为0. 6%，冷 却至约50°C时倒在玻璃板上，厚度为5mm。凝固后移去格式梳，撕掉胶带即为电泳用胶板。将两块电泳板并排放入电泳槽中，取浓度lmg/ml的粘多糖溶液2 y L上样于点样 孔，先在PH值5. 8、浓度0. 04mol/L的乙酸钡-乙酸缓冲溶液中以7mA/cm胶宽稳流电泳1小时，然后在pH值9. 0、浓度0. 05mol/L的1、2_ 二氨基丙烷-乙酸缓冲溶液中以7mA/cm胶 宽稳流电泳1小时。电泳结束后将凝胶连带玻璃板取出，放入干燥箱中75°C烘干，再放入装有0. 2% 甲苯胺蓝溶液的容器中于脱色摇床上染色30分钟。将凝胶板放入装有水的培养皿中浸泡 脱色，更换1-2次水，胶上背景透明后重新放入干燥箱中75°C烘干。得到的最终结果为一个 紧密附着在玻璃板上的膜状电泳结果，上面有各种粘多糖的斑点，可以以飞点扫描仪扫描定量。以上仅为本发明若干实施列之一，但并不局限于上述实施列的组合方式。
权利要求
一种玻载电泳法分析粘多糖的方法，其特征在于所述方法包括下述顺序步骤，a、准备一块洁净干燥的玻璃板，其宽度与所使用电泳槽宽度相吻合，其长度略短于所用电泳槽，用硬质胶带围绕玻璃板周长紧密缠绕一周使形成一个可容纳5mm深液体的方形容器，取格式梳架于相应上样位置，然后放置在水平的桌面，将琼脂糖在沸水中溶于pH值为5.8、浓度为0.04mol/L乙酸钡 乙酸缓冲溶液，使琼脂浓度为0.5 1％，待冷却至约50℃时倒在准备好的玻璃板上，厚度为1 5mm，凝固后移去格式梳，撕掉胶带即为电泳用胶板；b、将1 5μL的浓度为1mg/mL的粘多糖溶液上样于点样孔；c、于pH5.8、浓度为0.04mol/L的乙酸钡 乙酸缓冲溶液中，以5 7mA/cm胶宽稳流电泳1小时；d、再放入pH9.0、浓度为0.05mol/L的1、2 二氨基丙烷 乙酸缓冲溶液中，以5 7mA/cm胶宽稳流电泳1小时；e、将凝胶连带玻璃板取出，放入干燥箱中60 80℃烘干，再放入装有0.2％甲苯胺蓝溶液的容器中于脱色摇床上染色30分钟；f、将凝胶板放入装有水的容器中浸泡脱色，更换1 2次水，胶上背景透明后重新放入干燥箱中60 80℃烘干。
2.根据权利要求1所述的玻载电泳法分析粘多糖方法，其特征在于步骤a中所述的 琼脂为高强度琼脂或琼脂糖IV。
3.根据权利要求1所述的玻载电泳法分析粘多糖方法，其特征在于步骤a中所述的 琼脂浓度为0.6%。
4.根据权利要求1所述的玻载电泳法分析粘多糖方法，其特征在于步骤a中所述的 制备的胶板中琼脂厚度为2mm。
5.根据权利要求1所述的玻载电泳法分析粘多糖方法，其特征在于步骤b中所述的 粘多糖上样量为3 μ L。
6.根据权利要求1所述的玻载电泳法分析粘多糖方法，其特征在于步骤C、步骤d中 所述电泳的电流强度为6. 4mA/cm胶宽。
7.根据权利要求1所述的玻载电泳法分析粘多糖方法，其特征在于步骤e、步骤f中 所述的凝胶烘干温度为80°C。
全文摘要
本发明公开了一种玻载电泳法分析粘多糖的方法，操作步骤，将琼脂糖凝胶在玻璃板上铺成电泳用胶板，把这个玻载胶板放置在适当的电泳槽中，经点样、电泳后，取出玻载胶板，先在60-80℃烘干，然后用甲苯胺蓝染色，用自来水脱色，最后再在60-80℃烘干，得到最终电泳结果。该方法使得电泳胶板可长期保存；单次上样量从一般平板电泳的12-24个提高到72个，便于大规模分析；能有效的将肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸类肝素等粘多糖物质分离开，有助于对粘多糖准确地定性定量。
文档编号G01N27/447GK101936944SQ200910040788
公开日2011年1月5日 申请日期2009年7月2日 优先权日2009年7月2日
发明者史绍鹏, 徐归来, 李建科 申请人:深圳市天道医药有限公司