一种用于提高成骨细胞粘附和成骨性能的可降解医用高分子三维材料的制备方法与流程

文档序号：11185907阅读：769来源：国知局

本发明涉及一种可降解医用高分子材料纳米复合材料和仿生改性等技术领域，尤其涉及一种用于提高成骨细胞粘附和成骨性能的可降解医用高分子三维材料的制备方法。

背景技术：

在口腔种植和牙周治疗中，为获得最佳的软组织和硬组织的再生效果，引导骨再生（guidedboneregeneration,gbr）和引导组织再生现在已经成为一个标准的方法。引导骨组织再生技术是应用广泛的口腔骨增量术。性能优越的gbr材料是保证gbr手术成功的基础。因此，对gbr材料的研究成为口腔组织工程的重要组成部分。gbr技术主要是将屏障膜放置在骨缺损区，利用膜阻止生长较快的非成骨性细胞如上皮细胞等向缺损内长入，同时在膜下方维持一个空间，允许成骨性细胞优先迁移、生长，使骨再生、修复，最终在缺损区诱导形成新骨。在较大的骨缺损处需要同时充填骨替代材料，起到塑形和防止膜塌陷的作用。研究人员从各方面考虑薄膜的性能，通过几种材料的复合或是对已经制备好的薄膜进行表面改性以及共混其他有利材料来满足屏障膜引导骨再生的要求。它可通过一种主要的高分子材料与其它材料或者几种高分子材料的纳米复合，性能上扬长避短；或在膜基质中添加生物活性材料如生物活性陶瓷，生长因子，活性分子/蛋白，承载抗菌药物，提高骨再生能力和抗感染能力；或改进制作工艺，优化调控薄膜孔隙结构，模拟天然细胞外基质，增强膜表面与细胞的相互作用。

在组织工程中，制备具有三维多孔结构的方法主要包括制备的三维结构材料具有多孔且孔结构互通等特点，利于成骨细胞的粘附和三维生长。静电纺丝制造的组织再生膜具有模拟细胞外基质的纳米纤维支架3d结构，在增强细胞-表面交互作用，诱导新骨形成上更具优势。通过聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）和可溶性蛋壳膜蛋白（solubleeggshellmembraneprotein,sep）按照不同比例混合制备出结构类似于ecm和天然蛋壳的电纺膜，plga大大改善了sep的机械性能，体外培养发现sep/plga纳米纤维薄膜可明显提高l-929成纤维细胞粘附和该细胞与纤维基质的交互作用。geistlichbio-gide®可吸收生物膜是由高纯度的天然ⅰ型和ⅲ型胶原蛋白构成的生物胶原膜。它具有独特的双层结构设计，其致密层可行使有效的屏障功能，对软组织生长能起到导轨作用，胶原成份有促进伤口愈合的作用;疏松多孔层是三维胶原蛋白构成的框架结构，能够促进细胞的长入同时还可起到稳定凝血块的作用。

基于贻贝激发的仿生改性技术（mussel-inspiredtechnology）海洋贻贝通过足丝分泌粘附蛋白，蛋白中含有丰富的l-3，4-二羟基苯丙氨酸（dopa）具有超强粘附能力，利用与dopa结构相似的多巴胺模拟贻贝的粘附特性成为仿生学研究的热点。多巴胺特有的粘附特性，能在基质表面沉积聚多巴胺涂层，直接将多种活性分子如蛋白、寡核苷酸、多糖、金属离子、纳米羟基磷灰石等固定到生物大分子上，方法简单、反应条件温和、绿色环保。研究证明gbr膜材料的表面多巴改性不影响细胞凋亡，还明显提高了骨髓间充质干细胞的粘附和成骨分化。

促进成骨性能的材料一直是研究的热点。专利cn201610865987.2公开了生物陶瓷支架表面形成的聚多巴胺/ca-p纳米层具有微纳米结构，能够促进骨间充质干细胞在支架表面的粘附、增殖及分化；上海交通大学医学院附属第九人民医院的专利cn201610665925.7采用静电纺丝技术制备具有促进牙周膜细胞粘附和骨膜细胞粘附的材料并结合兼具抗菌活性的药物，具有良好的生物相容性、骨修复和抗菌功能；专利cn201510300717.2公开了一种具有二级三维结构的复合骨修复材料及其制备方法，其复合材料综合了纳米羟基磷灰石、丝素和胶原三者的优点；专利cn201610963191.0披露了一种3d打印的聚己内酯/牡蛎壳粉复合材料及制备方法与应用和基于其的骨组织工程支架；北京科技大学的专利cn201610346507.1涉及一种牙科种植体利用聚多巴胺沉积羟基磷灰石，获得一种具有优良生物活性的牙科种植体复合表面。综上所述，到目前为止，仍然未见一种材料结合混合改性和表面改性，能够获得成骨活性物质在表面短时间的高表达，在体相的长时间的低表达的相关材料或者技术出现。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种解决上述技术问题的用于提高成骨细胞粘附和成骨性能的可降解医用高分子三维材料的制备方法。

为实现上述发明目的，本发明的一种用于提高成骨细胞粘附和成骨性能的可降解医用高分子三维材料的制备方法，该方法包括如下步骤：

s1、将可降解医用高分子材料与促进成骨细胞粘附和增殖的活性物复合，制备具有三维结构的薄膜；

s2、对三维结构的薄膜进行表面功能化处理；

s3、采用具有骨细胞粘附和增殖活性的活性物对表面功能化处理的三维结构的薄膜进行表面改性；

s4、将s3中表面改性后的三维结构的薄膜进行洗涤、干燥后得到用于提高成骨细胞粘附和成骨性能的可降解医用高分子三维材料。

作为本发明的进一步改进，所述可降解医用高分子材料包括医用级的脂肪族聚酯，聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖、纤维素、聚乙烯醇的一种或者几种的组合，所述促进成骨细胞粘附和增殖的活性物包括胶原、明胶，多肽、蛋白、生长因子、壳聚糖、纳米羟基磷灰石和磷酸三钙一种或者几种的组合。

作为本发明的进一步改进，所述三维结构的薄膜中，所述促进成骨细胞粘附和增殖的活性物的含量为0.05wt%～20wt%。

作为本发明的进一步改进，在步骤s1中，采用静电纺丝法将可降解医用高分子材料与促进成骨细胞粘附和增殖的活性物复合，制备具有三维结构的薄膜。

作为本发明的进一步改进，所述步骤s2中“对三维结构的薄膜进行表面功能化处理”具体为：

将三维结构的薄膜放入ph值为7.5～9.0，浓度为0.1wt%～2wt%的多巴胺tris-hcl溶液中，反应1-48h。

作为本发明的进一步改进，所述步骤s3中“采用具有骨细胞粘附和增殖活性的活性物对表面功能化处理的三维结构的薄膜进行表面改性”的反应条件为：具有骨细胞粘附和增殖活性的活性物的浓度不高于10wt%，反应的温度为0～60℃，反应时间少于48h。

作为本发明的进一步改进，所述步骤s2还包括：对三维结构的薄膜进行表面功能化处理之前，对步骤s1中制备的清洗三维结构的薄膜进行清洗、除溶剂、干燥处理。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明提供的具有三维结构和强成骨活性的薄膜材料，其制备的关键点是成骨活性物质通过表面改性和混合改性的方法，在表面有高表达和体相长久低表达。成骨细胞的粘附是决定其后续增值和成骨性能的第一步，所以表面的胶原、生长因子等的高表达，能够使得成骨细胞在材料表面短时间内吸附和生长。通过混合改性的方法材料具有表制备含有成骨活性物的薄膜，随着聚合物的降解，活性物逐步释放，实现良好的成骨性能；同时该方法极大的减少活性物质混合对材料力学的影响。

2、采用聚多巴胺的改性方法，适用性强，对反应的材料要求低；过程简单可控，稳定性好等特点。此外其单体多巴胺无毒性，反应过程没有有机溶剂。这些特点均为规模化制备奠定了基础。此外电纺等制备三维结构的技术，均属于成熟技术。因此，制备方法和技术便于推广和在工业大生产中实现；

3、本发明可以有效控制成本。引导骨再生膜是高附加值产品，但是具有成骨细胞活性的物质其成本也非常高，例如骨生长因子。因此，通过表面改性的方法，可以减少活性物的使用，降低成本。

附图说明

图1为用于提高成骨细胞粘附和成骨性能的可降解医用高分子三维材料的制备方法的步骤流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但这些实施例并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据实施例所作出等效变换或等效替代均包含在本发明的保护范围内。

参图1所示，本发明一实施例中用于提高成骨细胞粘附和成骨性能的可降解医用高分子三维材料的制备方法，包括以下步骤：

s1、将可降解医用高分子材料与促进成骨细胞粘附和增殖的活性物复合，制备具有三维结构的薄膜。具体地，是采用静电纺丝法将可降解医用高分子材料与促进成骨细胞粘附和增殖的活性物复合，制备具有三维结构的薄膜。在三维结构的薄膜中，所述促进成骨细胞粘附和增殖的活性物的含量为0.05wt%～20wt%，并且，添加的促进成骨细胞粘附和增殖的活性物均匀分布，不破坏高分子薄膜的结构和力学性能。由此制备的具有三维结构的薄膜材料具有多孔且孔结构互通等特点，利于成骨细胞的粘附和三维生长。当然，在本发明的其他实施例中，也可以利用3d打印和制孔法同样能够获得相同特征的三维结构的薄膜。

优选地，可降解医用高分子材料包括医用级的脂肪族聚酯，聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖、纤维素、聚乙烯醇的一种或者几种的组合，所述促进成骨细胞粘附和增殖的活性物包括胶原、明胶，多肽、蛋白、生长因子、壳聚糖、纳米羟基磷灰石和磷酸三钙一种或者几种的组合。

s2、对三维结构的薄膜进行表面功能化处理。先对步骤s1中制备的清洗三维结构的薄膜进行清洗、除溶剂、干燥处理，再对三维结构的薄膜进行表面功能化处理。具体地，将三维结构的薄膜放入ph值为7.5～9.0，浓度为0.1wt%～2wt%的多巴胺tris-hcl溶液中，反应1-48h，使得多巴胺在三维结构的薄膜表面发生自聚，实现对三维结构的薄膜进行表面功能化。

s3、采用具有骨细胞粘附和增殖活性的活性物对表面功能化处理的三维结构的薄膜进行表面改性，反应条件为：具有骨细胞粘附和增殖活性的活性物的浓度不高于10wt%，反应的温度为0～60℃，反应时间少于48h。优选地，具有骨细胞粘附和增殖活性的活性物包括胶原、生长因子、多肽、壳聚糖和明胶等。需要说明的是，对于不富含氨基的活性物（如i型胶原）来讲，可以先通过低浓度戊二醛或乙二醛等预处理，提高其表面改性的效果。

s4、将s3中表面改性后的三维结构的薄膜进行洗涤、干燥后得到用于提高成骨细胞粘附和成骨性能的可降解医用高分子三维材料，通过上述方法制备的用于提高成骨细胞粘附和成骨性能的可降解医用高分子三维材料能够保持力学性能和结构，通过混合改性和表面修饰方法能够实现表面短时高浓度和整体长久低表达成骨活性物的结合，明显提高成骨细胞的粘附和三维生长，同时对材料的力学性能影响较小。

以下结合具体实施例来对本发明做进一步说明。

实施例一

称取1gplga、10%壳聚糖，放入三氟乙醇溶液中，磁力搅拌，溶解均匀。在参数为正压18.5kv，负压2.8kv，湿度35%，温度19℃下通过静电纺丝方法制备具有三维结构的薄膜，将所得薄膜置于真空干燥箱中干燥48h，去除溶剂；将获得的具有三维结构的薄膜材料进行多巴胺表面功能化处理，在ph值为8.5，浓度为0.3wt%多巴胺tris-hcl溶液中，反应24h后用去离子水洗涤3次。在2%的戊二醛中预处理1h后用去离子水洗涤3次。在5wt%的胶原溶液中，反应24h，控制温度为37℃，最后用去离子水洗涤3次、放入真空干燥箱中干燥48h得到产品。