专利名称：：应用永久磁铁的用于成像生物样本中靶标组分的方法和设备的制作方法
技术领域：
：本发明大体上涉及成像液#(生物)样本中的耙标组分。更具体的，描述了提供用以阳性选择血液样本中的靶细胞的方法和设备。将小的永久磁,接加入至恰有CD4免疫磁性标记的荧光染色的吖啶銜AO)全血的血液样本中。
背景技术：
：免疫磁性分离技术的应用提供了在确定血液中的靶实体中的更高的敏感性和特异性，所述耙实体包括但不限于完整的循环癌细胞和内皮细胞。可以将这些如(US6,365,362、US6,551,843、US6,623,982、US6，620,627、US6,645,731、WO02/077604、WO03/065042和WO03/019141)描述的那样的简单而敏感的诊断工具用于本发明以基于阈水平关联个体患者的统计生存能力。现有的诊断工具包括用针对上皮细胞表面抗原如EpCAM包被的磁珠孵育的来自肿瘤患者的血液样^(W003/018757)。在用抗EpCAM包被的磁珠纳^tf立子标记后，用磁性分离器分离磁性标记的细胞。进一步处理免疫磁性富集的级分用于下游免疫细胞化学分析或图像细胞计数，例如，在CellSpotter或CellTrackes⑧系统(ImmuniconCorp.,USA)中。磁性级分也可用于下游免疫细胞化学分析、RT-PCR、PCR、FISH、流式细胞术或其它鄉的图像细胞计数。CellSpotter或CellTracke^系统禾,免疫磁性选择和分离以高度富集和浓缩在全血样本中存在的任何上皮细胞。用白细胞特异性的标记以及用一种或多种肿瘤细胞特异性的荧光单克隆抗体可检测地标记俘获的细胞，以允许俘获的CTC的鉴别和计数，以及从污染的^PE细胞中仪器或可视的区分。每7.5ml血液中1或2个上皮细胞的敏感度使得这一测试法允许甚至在低肿瘤量的早期阶段检测肿瘤细胞。EasyCount②系统(PCT/US03/04468)是设计以区分淋巴细胞、粒细胞和单核细胞的荧光成像系统。该系统包括用于检测和计数磁性标记的靶细胞或粒子的紧密的电子光学仪器、分析方法、图象采集和转化算法。应用全血作为样本，应用一种或多种耙特异性的荧光染料，诸如DNA染色染料荧光标记血细胞。通过与缀合至强磁性颗粒的单克隆抗体孵育标记血液样本中的感兴趣的细胞或靶细胞。然后将该样本放置在合适的光学检测室或仓中，随后将光学检测室或仓置于选择性地使磁性标记的细胞移向室的平面观察表面的磁场梯度中。靶细胞被基本上一致地收集并固定在室的光学透明表面。然后fflil—个或多个LED(光划寸二极管)的方式照亮这一表面的一部分以及在其上的被标记的靶细胞。随后，MilCCD(电荷耦合器件)捕获由单个靶细胞发出的光。应用本文公开的图像采集方法、处理方法和算法计算捕获的发射光的细胞数，并将数据输出与每微升室内分析样本中的靶细胞相关联，并最终与最初的样本相关联。当前可用的方法没有提供快速、低成本且一致可靠的通过流式或图像细胞术评估细胞耙群体的方法。因此，显然需要决速和精确检测血液中的靶成分，诸如月中瘤或内皮细胞。发明推，本发明是用于阳性选择和成像靶实体的方法和工具。其包括用于在本发明的系统中磁操作的包被的永久磁性装置。该系统免疫磁性地浓缩靶实体、荧光标记，通过阳性计数鉴定和量化靶细胞。随后的统计分析使临床医生能够获得可能的诊断信息。更具体地，本发明提供了用于在免疫磁性成像后诊断疾病病症的装置、方法和试剂盒。在从患者获得全血样本后，将小的7乂久磁铁加入到全血样本中。与之前描述的CellSpotterMagnest构型不同，将小的NdFeB磁瓶接加入到样本容器中，例如CellTrackes⑧筒US6,861,259和US7,011,794具有100|nlCD4免疫磁性标记的和荧光染色的AO全血。IO併中后，应用铁棒或另一磁糊每小的永久磁^A人样本中吸出。将磁铁置于容器内以允许图像分析。本发明的另一实施方案具有固定至反应室内的漂浮装置(浮子(floater))的磁铁。在加入试剂、血液和浮子后，使免疫磁性标记的靶细胞沿着单成像平面放置用于分析，所有均在反应室内。附图简述图1:使用CellSpotter筒作为成像容器的靶细胞免疫磁性成像步骤。图2:小磁铁的一个实施方案的概要图。板1显示耙实俠细卿。板2显示以PDMS硅橡胶包被的磁铁为方向的靶实体。图3:(A)显示了具有附着在一个面上的永久磁铁的浮子的设计。(B)显示了在具有用于成像的光学透明窗口的管室内的浮子。图4:(A)在浮子面上的荧光珠的图像。所述面具有0.17毫米的厚度。(B)在浮子面上的磁珠的图像。所述面具有0.7毫米的厚度。图5:(A)显示了在用吖啶徵以绿色显示)和CD45-APC(以红色显示)染色后CD14-FF选择的细胞的图像。(B)从左至右，浮子、具有室的管，所述室具有用以标记体积的线，以及室的盖子。图6:4顿三种不同的物镜获得的荧光图像。(A)使用5xNA0.12物镜获得的图像。(B)使用10x,NA0.25获得的图像，以及(C)使用40x,NA0.6物镜的图像。蓝色代表DAPI，绿色是CD8-PE且红色是CD4-APC。图7:从两种方法获得的图像。(A)显示了用方法l在40个旋转后得到的结果。(B)显示了用方法2在500个旋转后得到的结果。图8:用5x和40x物镜，以及加入20、40、60和80微升EpCam铁磁流体(ferrofluid)(20mg/ml)获得的图像。图9:代表作为时间与小磁铁(l/16Xy4")和大磁铁(l/16X'/2")的函数的所收集的细胞数目的图表。发明详述血液中的免疫磁性分离、富集和分析在最初的抽血后使免疫磁性富集技术及免疫荧光标记技术与适当的分析平台联合。联合的测试具有检测血液样本中稀有细胞的敏感性和特异性，可以用于研究它们在疾病诸如上皮起源的恶性肿瘤的临床过程中的作用。利用这一类技术，已显示循环肿瘤细胞(CTC)在血液中以可^^测量存在。CellSpotter和CellTracl^^系统分析免疫磁性富集的样本的图像细胞术分析利用了基于荧光的显微镜图像分析系统，与流式细胞术分析相比，所述分析系统提供了事件的形象化以及形态学特征的评估，以进一步鉴定目标(US6,365,362)。CellSpotter和CellTrackes系统是指用于自动计数从血液中分离的细胞的自动荧光显微检查系统。该系统含有控制荧光显微镜的集成电子计算机和支承一次性样本筒的具有磁轭配件的自动台。设计磁轭以使得样本室内的铁磁流体标记的候选肿瘤细胞磁性地定位于样本筒的上层视图面用于显微视图。软件将用针对细胞角蛋白的抗体标记的并具有上皮起源的耙细胞呈现给操作者，用于最终选择。可以通领域公知的方法完成耙细胞的分离。在磁性分离后，结合至免疫磁性连接的抗体的细胞被磁性地扣留在管壁上。然后吸出未结合的样本，然后加入等渗溶液以重悬浮样本。然后用核酸染料、针对细胞角蛋白(上皮细胞的标记)和CD45(广谱白细胞标记)的单克隆抗体与样本孵育。在磁性分离后，再次吸出未结合级分，并将结合且标记的细胞重悬于0.2ml等渗溶液中。将样本悬浮于细KI^室中，并置于磁體中，所述磁錢的磁场定向磁标记的细胞用于荧光显微镜检查。自动地鉴别细胞，并将候选靶实体递呈给操作者用于清单计数。计数清单由预先确定的构成完整细胞的形态学标准组成。本发明利用了直接加入到血液样本中免疫磁性标记的靶实体的小磁铁。进一步用成像核酸染料、细胞膜和/或细胞骨架免疫荧光标记来标记耙标。例如，图1描述了用于成像全血样本中表达CD4的耙细胞的方法。自CD4进行免疫磁性标记和荧光标记后，将小的钕(NdFeB)永久磁铁加入到全血样本中。10併中后，从流储本中分离小的永久磁铁，并在样本容器中待Mii视图面观察。在一个实驗案中，磁铁是具有1.6mm直径和0.8mm高的盘(参见图2)。更小的磁顿于本发明是更的。利用这一磁铁，靶实辨细卿只附着至该磁铁。细胞不在一个焦面上，难以获得优质的图像。使用用PDMS硅橡胶包被的磁行相同的方法。细胞沿着单焦面附着。在磁铁顶部的PDMS层约为lmm。PDMS的宽度约为3mm。有需要设计用于将磁铁移A^i移出细胞悬浮液的方法，因为在移入或移出悬浮液时，损失磁铁的机会是很大的。磁铁必需足够小以减少将其从细胞悬浮液中吸出的力。室壁和磁铁之间的摩擦力可能太大而不能从细胞悬浮液中吸出磁铁，因为运动的方向是与磁力垂直的。甚至在具有用于扩大的磁铁的外壳大小时，细胞也可能移向磁极并妨碍检测。在本发明描述的另一个实施方案中考虑了这些问题。图3显示了本方法的基本步骤。将7乂久磁铁安装在中空管一面的内部，封闭所有侧面，如图3A所示。安装有磁体的面具有规定的厚度(d)。该表面可以是平的，或含有促进捕获并观察感兴趣目标以及限制液体中干扰组分(即游离的未结合的磁性颗粒)影响的结构。表面的厚度决定了细胞在外侧的分布。浮子的高獻直径比决定了磁场对浮子外侧区域的影响。因此，该比值应当将磁场的影响限制为大致到达安装了磁铁的浮子的外侧面。将细胞悬浮液注射进具有平坦表面、具有光学透明窗口的管中。加入免疫磁性颗粒和荧光染料。孵育后，将含有永久磁铁的浮子插入管中，使磁铁面向管底部并且关闭管。或者可以在和其它试剂相同的时间插入浮子。通过使试管倒过来，浮子升至流体外面。在试管和浮子之间留有小的流体层，可以忽略其对总体积的影响。使悬浮液与试剂孵育，不干扰浮子或不干扰磁场。孵育后，将管置于试管旋转装置或类似装置上，以使浮子上下移动M细胞悬浮液，如图3B阐明的那样。在足够的时间以完全捕获磁性标记的物俠细胞)后，从旋转装置上取下管，并颠倒放置，以使得浮子升向管平坦表面的光学窗口。利用标准荧光显微镜，aai管底部成像呈现在浮子表面的细胞。图4A展示了具有8聽直径的磁性绿色荧光,angs珠)的荧光图像。使用1/32"x1/16"钕永久盘状磁铁在浮子表面上收集珠子，所述磁铁的表面具有0.17毫米的厚度。图4B显示了在浮子表面上成像的磁珠。图5A展示了在浮子表面收集的CD14-FF选择的细胞的重叠图，所述浮子具有12腿的夕卜直径，j顿l/16"x1/4"钕7乂柱状磁铁，表面厚度为约0.34mm的2个盖片。可以作为绿色信号显示吖啶橙的强度，以区分用于CD45-APC标记的红色。图5B显示了浮子、室和室的盖。对于每一样本的制备，将200^血液(CellSavePreservative管，Immunicon股份公司)与10CD14-FF(0.88g/ml)、10|_d吖啶銜lmM)及10CD45-APC在玻璃室中孵育10分钟，如图5A所示。加入磷Kk缓冲盐水(PBS;2ml)到室中至预定量。加入浮子至室中，使含有磁铁的面朝向室的玻璃底部。旋转室以保证完全混合。IO併中后，颠倒室，并荧光成像在磁铁表面收集的细胞。实施例1CD-Chex，捕获效率为测定捕获效率，使用了具有已知绝对数量的白细胞的CD-Chex和它们的表型。材料和方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>往50WCD-Chex中加入10jnlCD3-FF(克隆Cris7)、10CD4-APC和10CD8-PE。孵育25併中后，将10nl该溶液注入室内。加入具有100nlDAPI的PBS(1.8ml)。然后插入浮子。盖盖后，将室置于旋转装置上，并旋转过夜(约16小时)。颠倒室，获得浮子的图像。结果对于100%的捕获效率，浮子表面含有CD3+:10328个细胞CD3+/CD4+:6783个细胞CD3+/CD8+:3200个细胞用不同的物镜获得图像，所得到的叠加图像如图6所示。图6A展示了使用5xNA0.12物镜获得的图像。图B和C分别是4顿10x,NA0.25和4(KNA0.6物镜获得的图像。蓝色代表DAPI，绿色是CD8-PE且红色是CD4-APC。预计CD8-PE(绿色)标记的细胞数目是3200，而实际的CD8-PE标记的细胞约等于500，捕获效率是16%。实施例2:fTO7乂久磁铁的两种方法之间的比较为确定CdlTracke^分析后对照细胞的图像，所述分析使用了插入和从细胞悬浮液移除磁铁的方銜方法l)和使用了具有固定在如本发明描述的浮子上的永久磁铁的方S(方法2)。才才料和方法在用CellTracke,系统分析后，将来自CellTracke,筒的对照细胞转移至类似图5B的室内。使用巴斯德吸管用PBS洗涤筒若干次，并且将所有用于洗涤的液俠约500微升)转移至室内。添加额外的PBS至2ml的总^f只。将小瓶置于管旋转装置上。设置转速使得在一次旋转中浮子移动通过全部流体。在完全混合后，将1.5ml对照细胞、以及50inlEpcam铁磁流体和10DAPI试剂(CellSearchTM，VeridexLLC)注入小瓶中。孵育30併中后，在多个时间点获得图像。结果方法l:图7A的图像显示了40个旋转后的结果。图片质量适合于很容易地计数细胞。绿色细胞的数目对应于556个循环肿瘤细胞(CTC)的最高值和47个CTC的低值。ioo个旋转后，大多数细胞M;埋在铁磁流体层之下。此时细胞不可见并不能被计数。方法2图7B的图像是皿500个旋转后的获得的。尽管是更低量的铁磁流体，图片质量仍然足以计数细胞。细胞数目如下高值209，低值25，预期的是高值435，低值23。因此，对于高值的回收率是45%，以颜于低值是100%。实施例3铁磁流体的量用递增的铁磁流体确定图片质量。随着铁磁流体量的增加，图片质量降低。细胞变得埋藏在铁磁流体层之下，并且不能被检测到。这在某种程度上导致了低的回收率。材料和方法以1:100稀释COMPEL磁性微球体，Dragon绿，2.914107/ml，直径8.44lot#6548(BangsLaboratoriesInc，目录号UMC4F)。将系统缓冲液(1.5ml)加入到玻璃小瓶中，并加入50微升含有14570个小珠、以及20、40、60和80微升EpCam铁磁流俠20mg/ml)。旋转15和30併中后，获得荧光图像。将管旋转装置设置在10ipm，导致150和300个旋转。浮子是Coming1/16"直径磁铁。结果用5x和40x物镜获得图像。如图8所示，用5x和40x物镜成像20、40、60和80微升的EpCam。图8所示缺失的图像在保存过程中遗失了。实施例4评估捕获效率为确定不同大小的磁铁的捕获效率材料和方法方法A:1.用对照细胞分析CellTracks筒之后，清空筒中内装物。收集两个筒中的内装物。不清楚从筒中移出的对照细胞的精确数目，因为一些细胞粘附在玻璃上。将100Ml这一细胞悬浮液转移至试管中，并加入1.5mlPBS。2.装满四个管，且其中两个^柳浮子和Coming1/16"直径长度1/4"的磁铁，而另外两个使用Coming1/16"直径长度1/2"的磁铁。3.将管置于管旋转装置上30併中。旋车ti!度10RPM。4.从管中移除浮子，并将管置于Quadrupole磁铁中10併中。10^!中后，移除液体并用300微升PBS替换。移除并涡旋振荡管。5.将300微升转移至筒中，并在CellTracks⑧系统上重复扫描筒以确定有多少个细胞剩余在液体中。6.通过将浮子上的细胞数除以剩余液体的重复扫描中发现的细胞数来计算效率。结果磁铁浮子CellTracks重复扫描捕获效率1/16XW256199.6%1/16X'/4"225nana201/16X1/2，，230299.1l/16X!/2"218na方法B1.用对照细胞分析CellTracks筒之后，清空筒中内装物。如果需要大量的细胞的话，可以汇集筒。不清楚从筒中移出的对照细胞的精确数目，因为一些细胞粘附在玻璃上。将IOOmI这一细胞悬浮液转移至管中，并加入1.5mlPBS。2.两类浮子，Coming1/16"直径长度1/4"的磁铁和Comingl/16'，直径长度l/2"。3.将管置于管旋转装置上15併中。旋^fil度10RPM。4.从管中移除浮子，并将有剩余液体的管置于Quadrupole磁铁内部10併中。10併中后，移除液体并用300微升PBS替换。从Quadrupole中移出管，并涡旋振荡。5.将300微升转移至CellTracks筒并置于磁铁内部，15射中后，在CellTracks上重复扫描。6.通过将浮子上的细胞数除以剩余液体的重复扫描中发现的细胞数计算效率。结果:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>方法C:1.用对照细胞分析CellTracks筒之后，清空筒中内装物。如果需要大量的细胞的话，可以汇集筒。不清楚从筒中移出的对照细胞的精确数目，因为一些细胞粘附在玻璃上。2.用仪器缓冲液两倍稀释细胞悬浮液，并将100^1这一细胞悬浮液转移至管中，并力口入1.5mlPBS。3.两类浮子，Coming1/16"直径长度l/4，，的纖禾口Corning謹，，直径长度1/2"。4.将管置于管旋转装置上。旋转速度IORPM。5.在第l、2、3、4、5、7、10和15分钟确定所收集的细胞数。6.在DAPI和DIOC上鉴定细胞。结果图9中的图表以时间函数显示了所收集的细胞数。尽管上面描述并详细地例示了本发明的某些优选的实施方案，但本发明并不限于这些实施方案。可以对其进行各种修改，而不违背本发明的精神，该改进的全部的保护范围描述于下述权利要求中。权利要求1.检测和计数生物样本中靶群体的方法，其包括a.从个体获得所述生物样本；b.用荧光标记来标记所述生物样本中的所述靶群体，其中所述标记物对于所述靶群体是特异性的；c.将所述靶群体与磁性颗粒偶联；d.将小永久磁铁直接加入到所述样本中；e.分离所述标记的靶群体，其中所述分离包括从所述样本中移出含有所述靶群体的所述磁铁；f获得所述靶群体的图像，并且g.分析所述图像以检测并计数所述标记的靶群体。2.权利要求1的靶群体，其中所述耙群体是表达CD4的细胞。3.权利要求1的小7K久磁铁，其中所述磁铁是钕。4.权利要求1的小永久磁铁，其中所述磁铁是具有约1.6mm的直径和0.8mm高度的盘。5.用PDMS硅酮包被的权利要求1的小永久磁铁。6.检测和计数生物样本中耙群体的方法，其包括a.在室中获得所述生物样本；b.用荧光标记物标记所述生物样本中的所述靶群体，其中所述标记物对于所述耙群体是特异性的；c.将所述耙群体与磁性颗粒偶联；d.将含有小永久磁铁的浮子直接加入到所述样本中；e.使浮子沿着室的观察窗口稳定；f.获得所述耙群体的图像，并且g.分析所述图像以检测并计数所述标记的$巴群体。7.检测和计数生物样本中革巴群体的装置，其包括a.样本收集管，其中所述收集管在一个面上具有光学观察表面；b.在所述收集管内的含有7ll久磁铁的浮子；以及c.所述收集管的盖子。全文摘要描述了用于通过图像细胞术计数液体中细胞的系统，用于评估靶群体，诸如在不同体液中的白细胞子集或在环境样本、食品和体液中的细菌污染。简而言之，将荧光标记的靶细胞与磁性颗粒或珠连接。在一个实施方案中，将小的永久磁铁直接插入到含有标记的细胞的室中。用PDMS硅橡胶包被磁铁以提供平滑和平坦的表面上，其允许在单焦面上成像。从样本中移除磁铁，并通过CCD相机捕获通过靶细胞发射的荧光亮光。在另一个实施方案中，具有永久磁铁的浮子使得靶细胞在样本溶液内沿着单成像平面排列。可以用新的算法进行图像分析，以提供表面上的细胞的计数，反映出最初样本中的靶细胞浓度。文档编号G01N21/64GK101533012SQ20091013077公开日2009年9月16日申请日期2009年2月13日优先权日2008年2月15日发明者A·G·J·蒂贝,L·W·M·M·特尔斯塔彭申请人:维里德克斯有限责任公司