专利名称：黄花蒿中青蒿素含量快速检测技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及青蒿素快速检测技术。具体讲涉及通过索氏提取法快速从黄花蒿中提 取青蒿素，并用高效液相色谱技术(HPLC)对青蒿素含量进行快速检测的技术。涉及化学检 测技术领域。
背景技术：
青蒿素是利用我国特有的植物资源黄花蒿研制成功的一种全新的抗疟有效单体。 由于其结构独特，抗疟机理特别，对抗氯喹的恶性疟和脑性疟有特效，且有高效低毒的特 点，而被WHO称为“世界上目前唯一有效的疟疾治疗药物”。青蒿素是一种白色针状晶体，分 子式为C15H2205。1976年通过化学反应、光谱数据和X射线单晶衍射方法证明其为一种含有 过氧基的新型倍半萜内酯。由于其具有特殊的过氧基团，它对热不稳定，易受湿、热和还原 物质的影响而分解。青蒿素是种具有过氧键和内酯环的倍半萜内酯，由于其不具有共扼结构，且化学 性质不活泼，给定量测定带来一定困难。但自从青蒿素发现以来，经过科研工作者的不懈努 力，已经发展出了一系列基于青蒿素各项物理化学性质的分析测定方法。但检测方法要与 一定的分离提取方法相联系，才能有效地应用在研究、生产工作中。由传统的薄层色谱法、 紫外分光光度法以及柱前衍生化-HPLC检测法向直接HPLC法检测过渡势在必行。青蒿素有多个手性碳原子，使得合成步骤非常复杂，产率低、成本高，很难应用于 工业化生产。所以目前药用青蒿素主要从黄花篙植株中提取。因此，准确定量测定青蒿素含 量，对于黄花篙品种选育、青蒿素药物生产以及药理药效研究都有重要的意义。不同栽培条 件和地理环境青蒿素含量差别很大，青蒿素生产企业收购农户青蒿时，需测定青蒿素含量， 才能确定收购价格。青蒿干叶中提取青蒿素一般提取时间较长，需Mh以上，检测方法也不 成熟。由于收购时间比较集中，农户送来青蒿需等2-3周才能得到检测结果，在生产上极为 不便，限制了产业的发展，本发明研究的青蒿素含量快速检测技术在青蒿素产业化开发中 也具有重要价值和应用意义。
发明内容
本发明的目的是建立青蒿素高效液相色谱(HPLC)快速检测技术。本发明的内容包括以青蒿为原料，通过索氏提取法快速提取青蒿素，确定高效液 相色谱技术的色谱条件，建立青蒿素快速检测技术体系。本发明建立青蒿素快速检测技术体系，检测时间短(Ih)，结果可靠，是适于青蒿素 生产企业检测原料中青蒿素含量的成熟技术。(1)从青蒿中提取青蒿素的索氏提取条件为70%乙醇于65°C _85°C水浴，索氏提 取提取时间为 l-2h ；6-8h ； 12-14h ； 18_20h ；24_26h。(2)HPLC 检测色谱条件为色谱柱Agilent Eclipse XDB C8 柱(5 μ m， 4. 6X 150mm)；流动相为以下配方选基一乙睛醋酸缓冲液=20 80;乙睛醋酸缓冲液=25 75 ；乙睛醋酸缓冲液=30 70 ；温度25_;35°C ；流速l-2mL/min ；波长 220nm。本发明解决技术问题的方案分以下四个步骤完成(1)青蒿中青蒿素索氏提取称取IOOg青蒿鲜样，研碎，将样品装入滤纸套筒 中，把套筒小心地插入索氏提取器中，取300mL70 %乙醇加入600mL平底烧瓶中，加入几粒 沸石。水浴加热 65 °C -85 °C，连续提取 1 -Mh，分别在 0. 5-Ih，1 -2h，3-4h，6-8h，12-14h， 18-20h，22-24h收集提取液，并以盐酸中和。(2)样品提纯提取液加热至70°C后经2% (w/v)活性炭脱色，搅拌30min，静置后 以3000r/min离心IOmin后收集上清液，再用1/5体积的10%三氯乙酸除蛋白，以3000r/ min离心去除变性蛋白，上清液真空蒸发浓缩。浓缩后的残渣以200mL70%乙醇沉淀， 3000r/min离心后取上清液真空浓缩至30mL。(3)HPLC检测样品处理方法1 %醋酸水溶液99mL，加入Iml浓缩液，搅拌混勻 后，取不同提取时间的提取液20yL做HPLC分析。标准曲线为以峰面积⑴与对照标准 品浓度(X)进行线性回归，得回归方程为y = 2395. 3χ-1. 3591，R = O. 987，根据回归方程计算出青蒿素浓度。(4)取不同来源的青蒿干叶样品6份，重复5次，用(1)，(2)步骤方法提取后，用 (3)步骤计算出提取l-2h ；6-8h ； 12-14h ；18_20h后青蒿素含量。
具体实施例方式在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。实施例1取重庆恒星生物制药有限责任公司基地种植的青蒿，称取IOOg青蒿叶干样， 研碎，将样品装入滤纸套筒中，把套筒小心地插入索氏提取器中，取300mL70 %乙醇加入 600mL平底烧瓶中，加入几粒沸石。水浴加热，分别在提取lh，6h，12h，18h，Mh收集提取 液，重复3次。提取液以盐酸中和后加热至70°C后经2% (w/v)活性炭脱色，搅拌30min， 静置后以3000r/min离心IOmin后收集上清液，再用1/5体积的10%三氯乙酸除蛋白，以 3000r/min离心去除变性蛋白，上清液真空蒸发浓缩。浓缩后的残渣以200mL70%乙醇沉 淀，3000r/min离心后取上清液真空浓缩至30mL。浓缩样品采用以下方式处理醋酸水 溶液99mL，加入ImL提取液，搅拌混勻后，做HPLC分析。精密量取20ul注入液相色谱仪，记 录色谱图；色谱条件为色谱柱:Agilent Eclipse XDB C8柱(5 μ m，4. 6X 150mm)；流动相 为乙睛醋酸缓冲液=25 75 ；温度25°C;流速lmL/min ；波长260nm。标准曲线以峰 面积(Y)与对照品浓度(X)进行线性回归，得回归方程为y = 2395. 3χ-1. 3591,R = 0. 987。 根据公式计算出不同提取时间青蒿素含量占干重的比例为提取lh，占0. 113% ；提取6h， 占 0. 261% ；提取 12h,占 0. 415% ；提取 18h,占 0. 614% ；提取 24h,占 0. 619% ；。提取 Ih 后与充分提取(24h)的比值为0. 183取从重庆市黔江区农户收集的青蒿干叶3份，重庆酉阳农户收集的青蒿干叶3份， 分别提取Ih ；6h ； 12h ； 18h ；24h后，提取液提纯后用HPLC检测。通过计算得到6份样品 提取Ih后青蒿素含量占干重的比例分别为0. 123%,0. 117%,0. 128%,0. 210,0. 197%, 0. 173%，不同来源青蒿中青蒿素含量差异极显著。不同来源青蒿干叶中青蒿素含量提取Ih后与充分提取(24h)的比值分别为0. 180,0. 179,0. 185,0. 178,0. 182,0. 184，差异不显著， 其平均值0. 181，可用来作为青蒿素充分提取时含量推算。实施例2索氏提取过程按实施例1进行，所不同之处在于HPLC分析色谱条件为色谱条件 为色谱柱=AgilentEclipse XDB C8柱(5 μ m,4. 6X 150mm)；流动相为乙睛醋酸缓冲液 =30 70;温度30°C;流速1.5mL/min;波长260nm。不同来源青蒿干叶提取Ih后青蒿 素含量与充分提取的比值，差异不显著，平均值为0. 180。
权利要求
1.青蒿素含量快速检测技术，该技术包括(1)青蒿素索氏快速提取和纯化；( 高效液 相(HPLC)检测。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于以青蒿干叶为原料采用索氏提取法提取青 蒿素，提取条件为70%乙醇水浴65°C-85°C，提取时间为1-池，根据其含量与充分提取Mh 后含量的比值0. 181，推算出青蒿干叶的青蒿素含量。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于高效液相(HPLC)检测的色谱条件为色谱 柱Agilent EclipseXDB C8柱(5 μ m，4. 6X 150mm)；流动相为以下配方选基一乙睛醋 酸缓冲液=25 75 ；乙睛醋酸缓冲液=30 70 ；乙睛醋酸缓冲液=25 75 ；温度 25-350C ；流速:l-2mL/min ；波长260nm。
全文摘要
本发明提出一种青蒿素含量快速检测技术。该技术是以青蒿干叶为原料，通过索氏提取法快速提取青蒿素，确定高效液相色谱技术的色谱条件，计算出提取1-2h青蒿素含量与充分提取后青蒿素含量比值，确定青蒿素快速检测技术。提取条件为70％乙醇水浴65℃-85℃，提取时间为1-2h。提取液用活性炭脱色和三氯乙酸除蛋白后，用70％乙醇沉淀，取上清液，进行HPLC检测，色谱条件为色谱柱AgilentEclipseXDB C8柱(5μm，4.6×150mm)；流动相为以下配方选基一乙睛∶醋酸缓冲液＝23∶77；乙睛∶醋酸缓冲液＝30∶70；乙睛∶醋酸缓冲液＝25∶75；温度25-35℃；流速1-2mL/min；波长260nm。
文档编号G01N30/08GK102053121SQ200910191258
公开日2011年5月11日 申请日期2009年10月29日 优先权日2009年10月29日
发明者冉义坤, 冉辉, 刘成林, 张梅 申请人:重庆恒星生物技术有限责任公司