专利名称：一种具有多价效应和纳米尺寸效应的多肽荧光探针的构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物分子领域。
背景技术：
自1992年绿色荧光蛋白(GFP)的cDNA序列被克隆以来，基于GFP的标记技术迅 速发展。随着GFP晶体结构的解析，荧光蛋白突变导致理化特性改变的研究，以及新荧光蛋 白物种的发现，荧光蛋白及其突变体作为报告分子或功能探针已被广泛地用于生命科学的 研究中，例如基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物等。基于荧光蛋白的分子标记技术，具有生物相容性好、可用于长时程动态监测、以及 活细胞内精确空间定位的特点，在活体和活细胞水平的生物分子动态研究中发挥了重要作 用。尤其是源自珊瑚虫的红色荧光蛋白(dRFP583)的发现，以及在此蛋白基础上突变获得 的一批成熟更快、荧光强度更强、光谱红移的红色荧光蛋白和远红色荧光蛋白，如TagRFP、 mKate、Katushka, mLumin等，极大地促进了荧光蛋白标记技术在活体分子成像研究中的应 用。然而，橙色、红色和远红色荧光蛋白(发射峰大于550nm)通常是以二聚体或四聚 体的形式存在。对于生物分子(如蛋白质、离子、核酸分子等)功能研究而言，荧光蛋白的多 聚化很容易造成以荧光蛋白作为标签的目标蛋白非特异性地聚集，或影响其所标记蛋白质 的理化性质，从而导致检测的光学信号不能真实地反映生物分子信息。因此，可发生多聚化 的荧光蛋白不适合作为荧光标记物用于目标蛋白的运动、定位及相互作用研究。现阶段针 对荧光蛋白标记技术的研究热点之一，是如何获得理化特性好的荧光蛋白单体。而对如何 将荧光蛋白突变体的多聚化性质应用于生物学研究中，关注较少，仅限于对活细胞的示踪。靶向性多肽(targeting ρ印tide，简称TP)的鉴定通常是使用化学小分子染料对 多肽进行标记，例如，用FITC标记多肽进行细胞水平的光学成像鉴定，或Cy5. 5标记多肽在 活动物体内进行光学成像鉴定。以荧光蛋白作为靶向性多肽的报告分子，用于活细胞表面 的检测或多肽特异性的鉴定，虽有报道，但并非主流方法。其原因在于，与荧光染料标记方 法相比，荧光蛋白偶联的多肽探针检测灵敏度较低，且仅限于活细胞水平的研究应用，尚未 见到用于活体分子成像的报道。研究表明，细胞表面受体介导的内吞作用，其内吞效率与配体的效价密切相关。针 对受体介导内吞的这种特性，将靶向肽与纳米载体进行共价偶联，适当增加纳米载体表面 偶联的靶向肽数目，由此产生的多价性质使得受体介导纳米载体内吞的效率显著提高。目 前尚无文献报道利用荧光蛋白的多聚化特性形成具有多价效应的多肽荧光探针。在根据多价效应进行信号放大的方法中，生物素和亲合素(ABC法)或链霉素和亲 和素(SP法)的标记方法应用最为广泛。但是ABC法和SP法都不适应于内源性生物素含 量较高的组织如肝脏、肾脏和脾脏，因此存在一定的局限性。
发明内容
本发明的目的是建立一种构建多肽荧光探针的方法，此探针具有多价效应、纳米 尺寸效应和广泛生物组织适用性，可高灵敏度地用于活细胞表面标志物的检测或多肽特异 性的活体鉴定。本发明所采用的技术方案是一种具有多价效应和纳米尺寸效应的多肽荧光探针的构建方法，该构建方法是利 用基因重组技术，将靶向肽序列同时融合到荧光蛋白的氨基端和羧基端，或分别融合到荧 光蛋白的氨基端或羧基端，构建成多肽荧光探针；所述荧光蛋白能发生四聚化。 进一步地，所述多肽荧光探针具有多价效应和纳米尺寸效应。一种具有多价效应和纳米尺寸效应的多肽荧光探针的应用，所述多肽荧光探针可 用于灵敏地检测活细胞表面标志物。一种具有多价效应和纳米尺寸效应的多肽荧光探针的应用，所述多肽荧光探针可 用于多肽特异性的活体鉴定。本发明具有以下优点本发明构建出的具有多价效应和纳米尺寸效应的多肽荧光探针，可以用于活细胞 表面标志物的灵敏检测以及特异性多肽的活体鉴定，具有高效、直接、经济等特点。由于荧 光蛋白的多聚化特性，使得多肽荧光探针与细胞受体之间存在一种多价效应，极大提高探 测灵敏度，因此只要能发生四聚化的荧光蛋白，都在此专利技术应用范围内。此外，基于四 聚体荧光蛋白的多肽探针具有纳米尺寸(> 7nm)，使之在生物活体内的靶向运输和分布优 于小分子化学探针。与一般的生物素和亲合素(ABC法)或链霉素和亲和素(SP法)的标 记方法相比，ABC法和SP法能使探针达到4价效应，而本专利中基于四聚化荧光蛋白的多 肽探针可以实现8价效应；而且ABC法与SP法对于有些内源性生物素含量较高的组织如肝 脏、肾脏和脾脏不是很适用，而本专利方法可用于一切活细胞、组织、以及整体动物。本发明 的多肽荧光探针只需一次构建，低成本大量扩增，且纯化简单。同时本发明的多价效应探针 使用只需一步，而ABC法与SP法制备的多价效应探针使用时是二步法。
图1为荧光蛋白偶联的多肽探针与活细胞表面标志物相互作用的示意图。(a)基 于单体荧光蛋白的多肽探针，其单价作用难以诱导受体介导的内吞，(b)基于多聚化荧光蛋 白的多肽探针，及其多价效应导致的高效受体介导内吞。图2为等摩尔浓度fRFP，fRFP-TP和TP_fRFP_TP的相对荧光强度光谱图。图 3 为 fRFP，fRFP-TP 和 TP_fRFP-TP 的 10 % SDS-PAGE 凝胶电泳图。(a) SDS-PAGE 凝胶电泳的白光图像，(b) SDS-PAGE凝胶电泳的荧光图像。图4为fRFP，fRFP-TP,TP-fRFP-TP和白蛋白(BSA)的快速蛋白质液相色谱(FPLC) 图。图5为激光共聚焦显微成像比较fRFP，fRFP-TP和TP_TP_fRFP-TP进入 SK0V-3 (ErbB2+)细胞或 IfepG2 (ErbB2")细胞的效率。(a) fRFP 与 SK0V-3 孵育，(b) fRFP-TP 与 SK0V-3 孵育，(c)TP-fRFP-TP 与 SK0V-3 孵育，(d) TP-fRFP-TP 与 IfepG2 孵育。标尺= 20mmo
图6为使用ErbB2_和ErbB2+共存的NIH3T3细胞进行激光共聚焦显微成像，验证 TP-fRFP-TP探针的特异性，标尺=10_。
具体实施方式
实施例1本实施例选用的是远红荧光蛋白KatuShkaS158A (简称fRFP)，该荧光蛋白优良的 光学特性参数(例如，荧光亮度高、荧光光谱> 620nm)，使之无论是在活细胞还是在活体动 物的光学成像研究中均有非常大的应用价值。其具体构建步骤如下1)利用基因重组技术将靶向性多肽(targeting peptide,简称TP)序列 LTVSPffYLTVSPffY分别偶联到fRFP的氨基端或羧基端，形成fRFP-TP或TP-fRFP，或同时偶 联到氨基和羧基端，形成TP-fRFP-TP。由于Katushka的多聚化特性，使得此荧光蛋白-多 肽复合体成为具有多价效应的探针。荧光蛋白偶联的多肽探针与活细胞表面标志物相互作 用时，细胞表面受体介导的单价或多价探针内吞的示意图，如图1所示。质粒pRSET-f RFP-TP，pRSET-TP-fRFP-TP 构建过程如下以 pRSET_KatushkaS158A 为模板，PCR 扩增出 KatushkaS 158A-GGGS-LTVSP WYLTVSPff(上游弓丨物CGGGATCCCGATGGTGGGTGAGGATAGCGTGCTGATCACC，下游弓丨物R1， CGTAAGATACCAAGGAGACACGGT CAGGCTACCGCCTCCGCTGTGCCCCAGTTTGCTAGG ；R2, CCCAAGCTTTTA ATACCAAGGGCTAACCGTAAGATACCAAGGAGACACGGTCGGC)与 LTVSPWYLTVSPWY_GGGS_KatushkaS1 58A-SGGG-LTVSPWYLTVSPWY (上游引物F1，GGTATCTTACGGTTAGCCCTTGGTATGGAGGCGGTAGCATGGTGGGTGAGGAT AGCGTG ；F2, CGCGGATCCCCTGACCGTGTCTCCTTGGTATCTTACGGTTAGCCCTTGGTATGGAGG, Rl, CGTAA GATACCAAGGAGACACGGTCAGGCTACCGCCTCCGCTGTGCCCCAGTTTGTAGG ； R2，CCCAAGCTTTTAATACCA AGGGCTAACCGTAAGATACCAA GGAGACACGGTCAGGC)，扩增后的 PCR 片段切胶回收后，用 BamHI/ HindIII双酶切，然后酶联入pRSET载体(BamHI/Hindlll)中，构建质粒pRSET-fRFP-TP和 pRSET-TP-fRFP-TPο2)等摩尔浓度fRFP、fRFP_TP和TP_fRFP_TP的相对荧光强度及荧光光谱图，如图 2所示。实验结果表明，TP与fRFP偶联后影响了 fRFP的荧光强度。3)多肽探针的10% SDS-PAGE凝胶电泳和FPLC分析与鉴定。10% SDS-PAGE凝胶 电泳结果，如图3所示，表明fRFP，fRFP-TP与TP-fRFP-TP均为四聚体。如图4所示，fRFP, fRFP-TP和TP-fRFP-TP的FPLC结果，精确地鉴别了由于fRFP上偶联TP的效价不同而导 致的三种蛋白质的分子量差异，与BSA (7nm)相比较可知，fRFP-TP和TP-fRFP-TP的纳米尺 寸大于7nm。因而，此类多肽探针具有纳米颗粒的尺寸效应，在生物体内不会立即从肾脏排 出，预计其体内循环的半衰期将长于小分子化学探针，有助于在肿瘤组织局部的蓄积。
4)等摩尔浓度的fRFP、fRFP-TP和TP-fRFP-TP分别与SK0V-3细胞孵育2h，激光 共聚焦显微成像结果，如图5所示，证实具有多价(八价)性质的TP-fRFP-TP能最有效地 被ErbB2+细胞摄取。 5)NIH3T3(ErbB2-)细胞转染ErbB2_mCitrine质粒后，仅部分细胞表达 ErbB2-mCitrine,即ErbB2阳性与阴性细胞共存。TP-fRFP-TP与此细胞群孵育后，仅高表达ErbB2的NIH3T3细胞可以特异摄取TP-fRFP-TP，而NIH3T3本身未检测到fRFP信号，如图 6所示。6)纯化的远红色荧光蛋白靶向肽TP-fRFP-TP过滤除菌后，尾静脉注射荷瘤裸鼠， 可用于肿瘤的整体荧光成像。实施例2本实施例选用的是红荧光蛋白DsRed，激发和发射峰波长分别为557纳米和579纳 米。将ErbB2受体靶向肽LTVSPWY重组在四聚体荧光蛋白DsRed的羧基端和氨基两端，形 成 LTVSPWYLTVSPWY-GGGS-DsRed-SGGG-LTVSPWYLTVSPWY(简称 TP-DsRed-TP)。ErbB2 受体 阳性肿瘤细胞株SK0V-3细胞可高效摄入TP-DsRed-TP。其具体构建步骤如下1)质粒 pRSET-LTVSPWYLTVSPWY-GGGS-DsRed-SGGG-LTVSPWYL TVSPWY 构建过程如 下以 pDsRed-Express 为模板，PCR 扩增出 LTVSPWYLTVSPff-GGGS-DsRed-SGGG-LTVSP WYLTVSPW(上游引物F1，CGCGGATCCCTTTTGTGATGGTTTCTATGCTTGTTATAAAGATGTTGGTGG, F2, CTATGCTTGTTATAAAGATGTTGGTGGTGGTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCA ；下游引物R1 :CCCAAG CTTGTAGACAAGTATTGTGCATACTTTGGTGA CTGTTTCGGTG, R2 TACTTTGGTGACTGTTTCGGTGGTGGTCA GGAA CAGGTGG TGGCG GCC)2)纯化的TP-DsRed-TP过滤除菌后，与SK0V-3细胞孵育2h，激光共聚焦显微成像 结果证实具有ErbB2靶向性。实施例3本实施例选用的是绿色荧光蛋白ZsGreen，成熟后为四聚体，激发和发射峰波长分 别为493纳米和505纳米。将ErbB2受体靶向肽LTVSPWY重组在ZsGreen羧基端和氨基两 端，形成 LTVSPWYLTVSPWY-GGGS-ZsGreen-SGGG-LTVSPWYLTVSPWY (简称 TP-ZsGreen-TP)。具 体实施途径与实施例2相同。TP-ZsGreen-TP同样有多价效应，SK0V-3细胞可通过细胞表 面的ErbB2受体高效介导多肽探针的摄入。除上述三个实施例中提到的三种四聚体荧光蛋 白外，其它四聚体荧光蛋白ZsYellowl和AmCyanl也可用于制备具有多价效应的多肽探针。上述三个实施例所述的基因重组是指利用不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片 段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发 明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当可理解，并可对本发明的技术方案进行修 改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要 求范围当中。
权利要求
一种具有多价效应和纳米尺寸效应的多肽荧光探针的构建方法，其特征在于，该构建方法是利用基因重组技术，将靶向性多肽序列分别融合到荧光蛋白的氨基端、羧基端、或氨基和羧基两端，构建成多肽荧光探针；所述荧光蛋白能发生四聚化。
2.根据权利要求1所述的具有多价效应和纳米尺寸效应的多肽荧光探针的构建方法， 其特征在于，所述多肽荧光探针具有多价效应和纳米尺寸效应。
3.一种具有多价效应和纳米尺寸效应的多肽荧光探针的应用，其特征在于，所述多肽 荧光探针可用于高灵敏地检测活细胞表面标志物。
4.一种具有多价效应和纳米尺寸效应的多肽荧光探针的应用，其特征在于，所述多肽 荧光探针可用于特异性多肽的活体鉴定。
全文摘要
本发明公开了一种具有多价效应和纳米尺寸效应的多肽荧光探针的构建方法及其应用，属于生物分子领域。该构建方法是利用基因重组技术，将多肽荧光探针序列分别融合到荧光蛋白的氨基端、羧基端、或氨基和羧基两端，构建成多肽荧光探针；所述荧光蛋白能发生四聚化。利用该方法构建出来的多肽荧光探针具有多价效应和纳米尺寸效应，并且可用于高灵敏地检测活细胞表面标志物以及特异性多肽的活体鉴定。
文档编号G01N21/64GK101876658SQ20091031036
公开日2010年11月3日 申请日期2009年11月25日 优先权日2009年11月25日
发明者张智红, 骆海明, 骆清铭 申请人:华中科技大学