专利名称：用于检测生物标本中的过氧化物还原酶ⅳ抗体的elisa试剂盒及其方法与运用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学检验领域，特别涉及用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的间接ELISA试剂盒及其方法与运用。
背景技术：
类风湿关节炎(RA)是一种以滑膜炎为基本病理改变，以慢性破坏性关节病变为特征的全身性自身免疫病，大多病情呈进行性，最终导致关节纤维性或骨性强直而严重致残，严重影响患者生活质量。未经正确治疗的类风湿关节炎可迁延不愈，甚至导致关节畸形。作为自身免疫性疾病，致病抗原驱动的自身反应性CD4+T细胞活化是类风湿关节炎发病的核心途径。对于类风湿关节炎的诊断，现在主流仍然沿用1987年美国风湿病学学会RA的分类标准，其主要靠临床表现并排除其他关节炎从而对RA进行判断。另外，X线改变和类风湿因子也是判断RA的常用标准。但上述方法操作繁琐且特异性不高，且不适用于早期诊断。众所周知，RA的病理改变从滑膜组织开始逐渐向软骨到骨发展。RA在早期若未得到有效治疗，将会引起关节功能障碍甚至劳动力丧失，并导致全身多脏器受累进而危及生命。如果能尽早对RA病情做出诊断，及早治疗，从而阻止或延缓其发展，将能有效的提高RA 的治疗效果并减少其并发症的发生。而针对RA早期有高度敏感性和特异性的检测指标是实现RA早期诊断和治疗的前提。早期诊断指标中，IL-8、IL-6水平在巨细胞病毒DNA阳性的类风湿关节炎患者中升高和CMV基因组出现之间存在联系，但特异性和敏感性低。在RA自身抗体作为检测指标方面类风湿因子(RF)存在灵敏度低的缺点；在早期RF阴性的类风湿关节炎病人中可 53. 3%的病人抗核周因子(APF)呈阳性，但APF抗原片的保存时间较短(仅为1 2周)，检测稳定性低fa抗体在类风湿关节炎中阳性率为40%，特异性为98. 9%，但类风湿关节炎早期仅约23% ；过氧化物还原酶IV和类风湿关节炎的相关性研究尚未有人报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种试剂盒，该试剂盒能快速检测过氧化物还原酶IV抗体的含量，操作简单，成本低廉。为实现上述目的，本发明的技术方案为
1、用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括抗体捕获剂、酶标二抗和底物。2、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒， 所述抗体捕获剂为过氧化物还原酶IV作不小于5 μ g/mL的稀释。3、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒，抗体捕获剂附于固相支持物上。4、根据3所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒， 所述固相支持物为酶标板或生物芯片。5、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒， 所述生物标本为血清、尿液、细胞、组织物或血浆。6、根据5所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒， 所述生物标本为血清，所述血清为不大于200倍体积稀释的血清稀释液。7、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒， 所述酶标二抗为辣根酶标记山羊抗人IgM作不大于4000倍稀释的稀释液。8、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒， 所述抗体捕获剂与酶标二抗的用量体积比为1:1。
本发明的目的之二在于提供上述试剂盒的用途，该用途能弥补过氧化物还原酶IV抗体检测领域的技术空白，并为类风湿关节炎及其它免疫性疾病提供了诊断思路，特别适用于生物标本的检测。为实现上述目的，本发明的技术方案为
9、1-8所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒在检测过氧化物还原酶IV抗体含量的应用。10、根据9所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒的应用，所述ELISA试剂盒在制备检测类风湿关节炎试剂盒中的应用。11、根据9所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒的应用，所述ELISA试剂盒检测待测血清与正常人血清的过氧化物还原酶IV抗体的含量， 当待测血清的OD45tlnm值大于0. 257为过氧化物还原酶IV抗体阳性，小于或等于0. 257为过氧化物还原酶IV抗体阴性。本发明的目的之三在于提供过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，该方法敏感性高，操作简单。为实现上述目的，本发明的技术方案为
12、运用1-8任一项所述ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，a、将生物标本与ELISA试剂盒中的抗体捕获剂接触并保温；b、将未结合的生物标本分离，得抗原-抗体复合物；C、在步骤b所得的抗原-抗体复合物加入ELISA试剂盒中的酶标二抗，得双抗复合物；d、检测结合于抗体捕获剂的过氧化物还原酶IV抗体的含量。13、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，所述方法还包括将步骤d所得的过氧化物还原酶IV抗体的含量与正常人过氧化物还原酶IV 抗体的含量进行比较判断。14、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，步骤a中，将抗体捕获剂包被酶标板，将待测生物标本与抗体捕获剂接触，保温并用封闭液封闭；所述生物标本为不大于200倍体积稀释的血清稀释液，所述抗体捕获剂为过氧化物还原酶IV作小于5 μ g/ml的稀释液。15、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，
5步骤b中，将步骤a中保温并用封闭液封闭的酶标板洗涤将未结合的生物标本分离，得抗原-抗体复合物。16、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，步骤c中，在步骤b所得的抗原-抗体复合物加入ELISA试剂盒中的酶标二抗进行保温反应， 得双抗夹心复合物；所述酶标二抗为辣根酶标记山羊抗人IgM作不大于4000倍稀释的稀释液。17、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，步骤d中，在步骤c所得的双抗复合物中加入底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液，通过测显色样品液的OD45tlnm值检测结合于抗体捕获剂的过氧化物还原酶IV抗体的含量。
18、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，所述方法还包括阴性对照组和空白对照组，所述阴性对照组为源自于正常人的生物标本。19、根据18所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，所述待测生物标本的OD45tlnm值大于阴性对照组样本的OD45tlnm值平均值与其2倍标准方差之和时，判定为过氧化物还原酶IV抗体阳性，述待测生物标本的OD45tlnm值小于或等于阴性对照组样本的OD45tlnm值平均值与其2倍标准方差之和时为阴性。本发明的有益效果在于本试剂盒能特异性的检测过氧化物还原酶IV抗体的含量，其成本低，敏感性佳；运用本试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体的含量，并与正常人的过氧化物还原酶IV的抗体水平进行比较，可特异性教高的诊断类风湿关节炎，所以该试剂盒可以制备成类风湿关节炎诊断试剂盒，尤其适用于早期诊断。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中
图1为间接ELISA法检测初诊RA、复诊RA及正常人血清中过氧化物还原酶IV抗体的分析图。图2为过氧化物还原酶IV间接法ELISA标准曲线，横坐标为小鼠抗人单克隆抗体稀释倍数，纵坐标为不同稀释倍数抗体所对应的OD450值。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。本实施例中所述抗原包被物人过氧化物还原酶IV的获得是通过构建原核表达质粒、转化表达菌并发酵培养，收集到大量的含有过氧化物还原酶IV的菌体沉淀，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗人IgM，作为间接法ELISA的二抗；进一步确定了人过氧化物还原酶IV包被浓度和检测血清的最佳浓度范围及阴阳性临界值的确定，制定了一种特异性和敏感性高的类风湿关节炎过氧化物还原酶IV抗体检测方法，其能捕获7. Sng/ mL过氧化物还原酶IV抗体。实施例过氧化物还原酶IV抗体间接法ELISA试剂盒及其方法与运用一包被物人过氧化物还原酶IV的制备
构建人过氧化物还原酶IV表达质粒，用PET原核表达系统制备重组抗原TRX-过氧化物还原酶IV融合蛋白。1根据GenBank中检索到的人过氧化物还原酶IV成熟蛋白序列编码，设计合成编码过氧化物还原酶IV蛋白的DNA ；
2分别在DNA5'端和3'端设计EcoR I和Hind III酶切位点，经聚合酶链反应(PCR)、 构建重组质粒PET过氧化物还原酶IV ； 3在BL21 (DE3)经IPTG诱导表达； 4 Ni-NTA亲和层析制备TRX-过氧化物还原酶IV ；
5通过DNA测序、融合蛋白的相对分子质量分析及Western印迹来鉴定TRX-过氧化物还原酶IV质粒及表达的过氧化物还原酶IV抗原的正确性。二、过氧化物还原酶IV抗体的间接法ELISA试剂盒及其方法与运用 1、实验材料
1.1、试剂
辣根酶标记山羊抗人IgM购自Lifescience公司；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L) 购自北京中山生物技术公司；小鼠抗人过氧化物还原酶IV单克隆抗体购自Abcam公司； 1.2、仪器
紫外分光光度仪Backmen公司。1.3、主要试剂配制
封闭液加入IOmL封闭液贮液到90mlTBS中，在-15 _25°C稳定保存。0. 5%封闭液加入5mL封闭液贮液到95mLTBS中，在-15 _25°C稳定保存。血清稀释液用0. 5%的封闭液稀释一抗。HRP标记的抗小鼠或人IgG用0. 5%的封闭液稀释为1 :10000倍，得到二抗工作液。包被液0. 85M (PH 9. 6)碳酸盐缓冲液1. 59g Na2CO3加2. 93g NaHCO3，三蒸水定容1000mL。洗涤液0. OlM pH7. 4 PBS +吐温-20 (T)使最终质量分数为0. 05%。 底物溶液磷酸盐-柠檬酸缓冲液(ρΗ5·0 5·5) :0. IM柠檬酸Μ. 3mL加入25. 7ml 0. 2M Na2HPO4 · Iffl2O加入邻苯二胺40. Omg,定容至50mL,临用前加0. 15mL体积分数为30%的 H202。终止剂22. 2mL硫酸加入蒸馏水177. 8mL。1.4、待测样品5例RA滑膜组织由北京大学附属人民医院风湿免疫科栗占国教授提供；534例RA (其中初诊67例、复诊467例)、65例0A、120例SLE、10例硬皮病 (scleroderma)、15例皮肌炎(dermatomyositis)及120例正常对照(NC)血液标本源自西南医院。将收集的促凝血液标本4°C过夜后经3，OOOrpm离心30分钟，取上清，IOOul分装，-70°C保存。2、过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒及其方法与运用
2.1、最佳过氧化物还原酶IV包被浓度和检测血清稀释倍数的确定
采用方阵滴定法，具体步骤如下(1)将含10μ g/ul重组表达的人过氧化物还原酶IV 按照如下浓度稀释(5μ g/ml、10y g/ml、20y g/ml、50y g/ml、100y g/ml)，100y L/ 孔加于酶标板中，置4°C湿盒孵育12小时，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(2)加入100 μ 1/孔封闭液，4°C湿盒封闭过夜，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(3)待测血清按照1 :20、1 :50、
71 :100,1 :200倍稀释，100 μ 1/孔，37°C湿盒作用lh，洗板机洗涤10次，3min/次，拍干；(4) 将HRP标记的山羊抗人IgG按照1 :4000稀释，100 μ 1/L，加入酶标板中，37°C湿盒孵育30 分钟，洗板机洗涤10次，3min/次，拍干；酶标二抗按照已确定比例1 :4 000使用；(5)加入 TMB底物100μ 1/孔，37°C避光显色5min后，加入100 μ 1/孔2mol/L硫酸终止反应；(6)检测用酶标仪测OD45tlnm值。同时以1%的BSA/PBS溶液作空白对照，以P/N值最大的人过氧化物还原酶IV包被物浓度和待测血清稀释度为最佳工作浓度。分别将人过氧化物还原酶IV包被物和待测血清作系列稀释，进行方阵试验，结果见表1。方阵滴定结果显示，人过氧化物还原酶IV包被浓度为50μ g/ml，待测血清1 :200 倍稀释时，类风湿关节炎血清OD45tlnm值大于1.0，阴阳性血清OD45tlnm比值(P / N)最大为 10. 45 ；人过氧化物还原酶IV包被浓度为20 μ g/ml，待测血清1 :200倍稀释时，类风湿关节炎血清OD45tlnm值大于1.0，阴阳性血清OD45tlnm比值(P / N)为10. 08，仅比最大阴阳性血清 OD450nm比值小0. 37，考虑抗原包被成本，因此选择人过氧化物还原酶IV包被浓度为20 μ g/ ml为最佳包被浓度；待测血清1 :200倍稀释为最佳稀释浓度。
权利要求
1.用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述 ELISA试剂盒包括抗体捕获剂、酶标二抗和底物。
2.根据权利要求1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述抗体捕获剂为过氧化物还原酶IV作终浓度不小于5 μ g/mL的稀释液。
3.根据权利要求1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒，其特征在于抗体捕获剂附于固相支持物上。
4.根据权利要求3所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述固相支持物为酶标板或生物芯片。
5.根据权利要求1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述生物标本为血清、尿液、细胞、组织物或血浆。
6.根据权利要求5所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述生物标本为血清，所述血清为不大于200倍体积稀释的血清稀释液。
7.根据权利要求1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述酶标二抗为辣根酶标记的山羊抗人IgM作不大于4000倍稀释的稀释液。
8.根据权利要求1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述抗体捕获剂与酶标二抗用量体积比为1:1。
9.权利要求1-8所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶IV抗体的ELISA试剂盒在检测过氧化物还原酶IV抗体含量的应用。
10.根据权利要求9所述的ELISA试剂盒的应用，其特征在于所述ELISA试剂盒在制备检测类风湿关节炎试剂盒中的应用。
11.根据权利要求9所述的ELISA试剂盒的应用，其特征在于所述ELISA试剂盒检测待测血清与正常人血清的过氧化物还原酶IV抗体的含量，当待测血清的OD45tlnm值大于 0. 275为过氧化物还原酶IV抗体阳性，小于或等于0. 275为过氧化物还原酶IV抗体阴性。
12.运用权利要求1-8任一项所述ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，a、将生物标本与ELISA试剂盒中的抗体捕获剂接触并保温；b、将未结合的生物标本分离，得抗原-抗体复合物；C、在步骤b所得的抗原-抗体复合物加入ELISA试剂盒中的酶标二抗，得双抗复合物；d、检测结合于抗体捕获剂的过氧化物还原酶IV抗体的含量。
13.根据权利要求12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，其特征在于所述方法还包括将步骤d所得的过氧化物还原酶IV抗体的含量与正常人过氧化物还原酶IV抗体的含量进行比较判断。
14.根据权利要求12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，其特征在于步骤a中，将抗体捕获剂包被酶标板，将待测生物标本与抗体捕获剂接触， 保温并用封闭液封闭；所述生物标本为不大于200倍体积稀释的血清稀释液，所述抗体捕获剂为过氧化物还原酶IV作不小于5 μ g/ml的稀释液。
15.根据权利要求12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，其特征在于步骤b中，将步骤a中保温并用封闭液封闭的酶标板洗涤将未结合的生物标本分离，得抗原-抗体复合物。
16.根据权利要求12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，其特征在于步骤c中，在步骤b所得的抗原-抗体复合物加入ELISA试剂盒中的酶标二抗进行保温反应，得双抗夹心复合物；所述酶标二抗为辣根酶标记山羊抗人IgM作不大于4000倍稀释的稀释液。
17.根据权利要求12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，其特征在于步骤d中，在步骤c所得的双抗复合物中加入底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液，通过测显色样品液的OD45tlnm值检测结合于抗体捕获剂的过氧化物还原酶IV抗体的含量。
18.根据权利要求12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，其特征在于所述方法还包括阴性对照组和空白对照组，所述阴性对照组为源自于正常人的生物标本。
19.根据权利要求18所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶IV抗体含量的方法，其特征在于所述待测生物标本的OD45tlnm值大于阴性对照组样本的OD45tlnm值平均值与其 2倍标准方差之和时，判定为过氧化物还原酶IV抗体阳性，待测生物标本的OD45tlnm值小于或等于阴性对照组样本的OD45tlnm值平均值与其2倍标准方差之和时为阴性。
全文摘要
本发明涉及医学领域，特别涉及用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒及其方法与运用，所述ELISA试剂盒包括抗体捕获剂、酶标二抗、底物；本试剂盒能特异性的检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量，其成本低，敏感性佳；运用本试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量，并与正常人的过氧化物还原酶Ⅳ的抗体水平进行比较，判断过氧化物还原酶Ⅳ抗体是否为阳性。
文档编号G01N33/543GK102346186SQ20111002563
公开日2012年2月8日 申请日期2011年1月24日 优先权日2011年1月24日
发明者吴乔, 吴玉章 申请人:中国人民解放军第三军医大学