专利名称：基于血脂蛋白快速分离的脂质荧光检测技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种完善的基于蛋白快速分离(FPLC)和荧光检测技术的血清脂蛋白分离和脂质含量测定技术平台，该技术平台可用于人类高脂血症及各种高脂血症模式动物血清脂蛋白谱的绘制和脂蛋白中脂质含量的检测，观察受试化合物对高脂血症动物血清脂蛋白谱和脂质含量的影响。
背景技术：
快速蛋白分离技术是近年发展起来的一种高效便捷的蛋白分离技术，该技术通过将液相系统与不同特性的分离柱联合起来，根据不同的需要分离目的蛋白。在整个分离系统中处于核心地位的是针对待分离蛋白特性所选择的分离柱。在本技术平台中，我们针对所关注的极低密度、低密度、高密度脂蛋白的大小之间存在差异，选择了 Superdex 20010/300GL凝胶分尚柱,该分尚柱具有闻分辨率、省时和闻回收率等特性，适用于分尚分子量在I X 104-6 X IO5之间的球蛋白，血清脂蛋白中的极低密度和低密度脂蛋白为分子量较 大的蛋白，大小主要分布在3000 OOODa左右，而高密度脂蛋白则相对小一些，主要分布在175-500 OOODa之间，故采用该凝胶分离柱能较好地将极低密度和低密度脂蛋白与高密度脂蛋白分开并对蛋白进行收集，后续可对蛋白含量的变化进行统计分析，还可以对分离后脂蛋白内的脂质进行检测，该方法尤其适用于观察调血脂药物对动物脂蛋白含量的影响，快速筛选具有调血脂作用的先导化合物
发明内容
本发明的目的之一在于建立基于蛋白快速分离和荧光检测技术的血清脂蛋白分离和脂质含量测定技术。本发明的目的之二在于利用该技术研究人类和不同种属高脂血症模式动物脂蛋白谱。本发明的目的之三在于观察调血脂受试化合物对高脂血症模式动物血清脂蛋白谱和脂质含量的影响。因此，为了完成本发明的上述目的，本发明主要涉及建立基于蛋白快速分离和荧光检测技术的血清脂蛋白谱和各脂蛋白组分中脂质含量的研究方法。本技术平台中涉及的原理蛋白快速分离本平台采用凝胶过滤色谱柱，根据极目的蛋白大小不同对血清中极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度(HDL)脂蛋白进行分离。总胆固醇与胆固醇的检测
胆固_麵
胆固議酯- 游离胆固_ +脂肪酸
胆^§麵
胆固g- 胆甾4掘-i_+过氧化氢
辣根过氧化物_
.-IiEpIes Eed + 过氧化氬-^ Resorufln庚光)甘油三酯的检测Nile Red+甘油三酯一485nm激发538nm产生荧光
本发明基于血脂蛋白快速分离的脂质荧光检测方法包括如下步骤
A.对分离柱定性可知不同物质随着分子量的减少，其保留体积逐渐变大，不同大小物质的保留体积不同，将未知物质的保留体积与这些标准物质作对比从而对对位未知物的大小进行推测；B.脂蛋白标准品保留体积的确定；C. FPLC样品的准备高速离心将待测血液样品中残留的血细胞去除，同时去除血清中游离的脂质；经过过滤后能除去一些大颗粒物质，D.血清脂蛋白快速分离；E.血清脂蛋白亚组分的收集；F. AmplexRed法检测总胆固醇、游离胆固醇，绘制标准曲线；G. AmplexRed法检测样品血清各收集管中总胆固醇、游离胆固醇；H.利用公式“胆固醇酯浓度=总胆固醇浓度-游离胆固醇浓度”，计算胆固醇酯的浓度。步骤H还可以是Nile Red法检测样品血清FPLC各组分中甘油三酯。步骤A中分离柱的定性的步骤是I)将Gel Filtration Calibration Kits中6种标准品按说明书配置成一定浓度0valbumin 4mg/ml, Conalbumin 3mg/ml, Aldolase 4mg/ml, Ferritin I. 2mg/ml,Thyroglobulin 5mg/ml, Blue Dextran 2000 lmg/ml。2)取各样品800微升，IOOOOg离心10分钟，0. 22微米滤膜过滤，过滤后样品收集至I毫升注射器中(200微升/支，每个样品3支)，用于上样。3)标准品FPLC分离(a)分离条件进样体积100微升；流速0. 3ml/min ;信号采集波长280纳米。(b)分离用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将样品进入上样环中，进样，0. 3ml/min 洗脱。(c)统计统计Blue Dextran 2000和其它5种蛋白保留体积,计算平均值。步骤B中脂蛋白标准品保留体积的确定的步骤是I)取已知浓度的 VLDL(0. 60mg/ml)、LDL(I. 55mg/ml)、HDL(2. 01mg/ml)各 800 微升，IOOOOg离心10分钟，0. 22微米滤膜过滤，过滤后样品收集至I毫升注射器中(200微升/支，每个样品3支)，用于上样。2)标准品FPLC分离(a)分离条件进样体积100微升；流速0. 3ml/min ;信号采集波长280纳米。(b)分离用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将样品进入上样环中，进样，0. 3ml/min 洗脱。(c)统计统计三种蛋白保留体积，计算平均值。步骤D中血清脂蛋白快速分离的条件为(a)分离条件进样体积100微升；流速0. 3ml/min ;接样体积0. 5ml,信号采集波长280纳米。(b)分离用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将血清样品进入上样环中，进样,0. 3ml/min洗脱,洗脱至4ml时开始收集样品,0. 5ml/管。(c)统计通过对各峰面积进行积分统计。步骤F中血清脂蛋白亚组分的收集条件为FPLC洗脱至4ml时开始收集样品，0. 5ml/管，将洗脱组分转移至0. 5mlEP管中，根据FPLC谱图中各洗脱部分序号对贮存管进 行编号，4度保存，以备后续检测之用。
图 I :标准品 Blue Dextran2000 (Mr 2000 000)及 Tyroglobulin (Mr :669OOODa) FPLC图谱及保留体积图2 :标准品 Ferritin (Mr :440 OOODa)及 Aldolase (Mr :158 OOODa) FPLC 图谱及保留体积图 3 :标准品 Conalbumin (Mr 75 OOODa)及 Ovalbumin (Mr :44 OOODa)FPLC 图谱及保留体积图4 =VLDL标准品(Mr 3800 OOODa) FPLC图谱及保留体积图5 =LDL标准品(Mr 3500 OOODa) FPLC图谱及保留体积图6 :HDL标准品(Mr 175-500 OOODa) FPLC图谱及保留体积图7 :小鼠血清FPLC图谱图8大鼠血清脂蛋白的快速分离图9金黄地鼠血清脂蛋白的快速分离图10豚鼠血清脂蛋白的快速分离图11猪血清脂蛋白的快速分离图12人鼠血清脂蛋白的快速分离图13 Amplex Red法检测总胆固醇标准曲线图14 =Amplex Red法检测游离胆固醇标准曲线图15 :金黄地鼠血清FPLC图谱图16 :金黄地鼠血清FPLC各收集管总胆固醇图谱图17 :金黄地鼠血清FPLC各收集管游离胆固醇图谱图18 :金黄地鼠血清FPLC各收集管胆固醇酯图谱图19:血清FPLC图谱图20 :血清FPLC各收集管甘油三酯图谱
具体实施例方式下述实施例具体显示本发明的应用。但本实施例不限定本发明的使用范围。
实施例I :Superdex 200 10/300GL分离柱定性实验及利用脂蛋白标准品确定各脂蛋白保留体积实验材料[主要试剂]NaCl、KCl'Na2HPO4 2H20,KH2PO4,Na2EDTA,NaN3>NaOH ；Gel FiltrationCalibration Kits，极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)。[主要试剂配置]FPLC洗脱液配制8g NaCUO. 2g KCl、1.8g Na2HPO4 2H20、0. 24gKH2P04、I. 861g Na2EDTA、0. 2g NaN3, NaOH 调 pH 至 7. 2，终体积为 1L。[主要仪器]AKATA Purifier 10 System, (GE Healthcare Life Sciences)
900 fraction collector (GE Healthcare Life Sciences)Superdex 200 10/300GL column(GE Healthcare Life Sciences)方法[Superdex 200 10/300GL 分离柱定性实验]I)将Gel Filtration Calibration Kits中6种标准品按说明书配置成一定浓度0valbumin 4mg/ml, Conalbumin 3mg/ml, Aldolase 4mg/ml, Ferritin I. 2mg/ml,Thyroglobulin 5mg/ml, Blue Dextran 20001mg/mlo2)取各样品800微升，IOOOOg离心10分钟，0. 22微米滤膜过滤，过滤后样品收集至I毫升注射器中(200微升/支，每个样品3支)，用于上样。3)标准品FPLC分离(a)分离条件进样体积100微升；流速0. 3ml/min ;信号采集波长280纳米。(b)分离用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将样品进入上样环中，进样，0. 3ml/min 洗脱。(c)统计统计Blue Dextran 2000和其它5种蛋白保留体积,计算平均值。[脂蛋白标准品保留体积的确定]I)取已知浓度的 VLDL(0. 60mg/ml)、LDL(I. 55mg/ml)、HDL(2. 01mg/ml)各 800 微升，IOOOOg离心10分钟，0. 22微米滤膜过滤，过滤后样品收集至I毫升注射器中(200微升/支，每个样品3支)，用于上样。2)标准品FPLC分离(a)分离条件进样体积100微升；流速0. 3ml/min ;信号采集波长280纳米。(b)分离用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将样品进入上样环中，进样，0. 3ml/min 洗脱。(c)统计统计三种蛋白保留体积，计算平均值。结果及分析[Superdex 200 10/300GL分离柱定性实验结果]实验结果见图I、图2和图3;从实验结果可知不同物质随着分子量的减少，其保留体积逐渐变大，以上各图显示了六种不同大小物质的保留体积，其中五种为不同分子量的蛋白质，将未知物质的保留体积与这些标准物质作对比能对位未知物的大小进行推测。[脂蛋白标准品保留体积的确定]实验结果见图4、图5和图6 ;从实验结果可得到VLDL、LDL、HDL标准品蛋白保留体积分别为7. 61ml,7. 856mlUI. 065ml，通过重复进样对谱图的分析表明，该蛋白分离系统对脂蛋白的分离具有很好的重复性。 实施例2 =FPLC样品的准备材料[主要试剂]NaCl、KCl、Na2HPO4 · 2H20、KH2PO4, Na2EDTA, NaN3> NaOH[主要试剂配置]血清稀释液配制8gNaCUO. 2g KCl、1.8g Na2HPO4 · 2H20、0. 24gKH2P04、I. 861g Na2EDTA、0. 2g NaN3, NaOH 调 pH 至 7. 2，终体积为 1L。[主要仪器]Eppendorf多用途低温高速离心机[实验材料]新鲜非抗凝血600微升
方法[FPLC样品的制备]新鲜血液室温静止60分钟后5000g离心10分钟，分离血清；将等量血清与血清稀释液混合，IOOOOg离心10分钟，经O. 22微米针式滤器过滤，收集于I毫升普通注射器中，4度保存备用(短时间保存6小时)。结果及分析实验结果通过高速离心将残留的血细胞去除，同时去除血清中游离的脂质；经过过滤后能除去一些大颗粒物质，防止样品堵塞分离柱。实施例3 :小鼠血清脂蛋白的快速分离材料[主要试剂]NaCl、KCl、Na2HPO4 · 2H20、KH2PO4, Na2EDTA, NaN3> NaOH[主要试剂配置]FPLC洗脱液配制8g NaCUO. 2g KCl、1.8g Na2HPO4 · 2H20、0. 24gKH2P04、I. 861g Na2EDTA、0. 2g NaN3, NaOH 调 pH 至 7. 2，终体积为 1L。[主要仪器]AKATA Purifier 10 System, (GE Healthcare Life Sciences)900 fraction collector (GE Healthcare Life Sciences)Superdex 200 10/300GL column(GE Healthcare Life Sciences)[实验材料]FPLC样品方法[血清脂蛋白快速分离](a)分离条件进样体积100微升；流速0. 3ml/min ;接样体积0. 5ml,信号采集波长280纳米。(b)分离用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将血清样品进入上样环中，进样,0. 3ml/min洗脱,洗脱至4ml时开始收集样品,O. 5ml/管。(c)统计通过对各峰面积进行积分统计。[血清脂蛋白亚组分的收集]FPLC洗脱至4ml时开始收集样品，O. 5ml/管，将洗脱组分转移至O. 5mlEP管中，根据FPLC谱图中各洗脱部分序号对贮存管进行编号，4度保存，以备后续检测之用。结果及分析实验结果见图7,通过与标准蛋白及VLDL、LDL> HDL标准品保留体积的对比,可以推测获得的血清蛋白图谱中峰I中含有极低密度脂蛋白，峰2含有低密度脂蛋白，峰3含有高密度脂蛋白，峰4含有血清白蛋白。实施例4 :大鼠血清脂蛋白的快速分离材料
[主要试剂]NaCl、KCl、Na2HPO4 · 2H20、KH2PO4, Na2EDTA, NaN3> NaOH[主要试剂配置]FPLC洗脱液配制8g NaCUO. 2g KCl、1.8g Na2HPO4 · 2H20、0. 24gKH2P04、I. 861g Na2EDTA、0. 2g NaN3, NaOH 调 pH 至 7. 2，终体积为 1L。[主要仪器]AKATA Purifier 10 System, (GE Healthcare Life Sciences)900 fraction collector (GE Healthcare Life Sciences)Superdex 200 10/300GL column(GE Healthcare Life Sciences)[实验材料]FPLC样品方法[血清脂蛋白快速分离](a)分离条件进样体积100微升；流速0. 3ml/min ;接样体积0. 5ml,信号采集波长280纳米。(b)分离用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将血清样品进入上样环中，进样,0. 3ml/min洗脱,洗脱至4ml时开始收集样品,O. 5ml/管。(C)统计通过对各峰面积进行积分统计。[血清脂蛋白亚组分的收集]FPLC洗脱至4ml时开始收集样品，O. 5ml/管，将洗脱组分转移至O. 5mlEP管中，根据FPLC谱图中各洗脱部分序号对贮存管进行编号，4度保存，以备后续检测之用。结果及分析实验结果见图8实施例5 :金黄地鼠血清脂蛋白的快速分离材料[主要试剂]NaCl、KCl、Na2HPO4 · 2H20、KH2PO4, Na2EDTA, NaN3> NaOH[主要试剂配置]FPLC洗脱液配制8g NaCUO. 2g KCl、1.8g Na2HPO4 · 2H20、0. 24gKH2P04、I. 861g Na2EDTA、0. 2g NaN3, NaOH 调 pH 至 7. 2，终体积为 1L。[主要仪器]AKATA Purifier 10 System, (GE Healthcare Life Sciences)900 fraction collector (GE Healthcare Life Sciences)Superdex 200 10/300GL column(GE Healthcare Life Sciences)[实验材料]FPLC样品方法[血清脂蛋白快速分离](a)分离条件进样体积100微升；流速0. 3ml/min ;接样体积0. 5ml,信号采集波长280纳米。(b)分离用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将血清样品进入上样环中，进样,0. 3ml/min洗脱,洗脱至4ml时开始收集样品,0. 5ml/管。
(c)统计通过对各峰面积进行积分统计。[血清脂蛋白亚组分的收集]FPLC洗脱至4ml时开始收集样品，O. 5ml/管，将洗脱组分转移至O. 5mlEP管中，根据FPLC谱图中各洗脱部分序号对贮存管进行编号，4度保存，以备后续检测之用。结果及分析实验结果见图9
实施例6 :豚鼠血清脂蛋白的快速分离材料[主要试剂]NaCl、KCl、Na2HPO4 · 2H20、KH2PO4, Na2EDTA, NaN3> NaOH[主要试剂配置]FPLC洗脱液配制8g NaCUO. 2g KCl、1.8g Na2HPO4 · 2H20、0. 24gKH2P04、I. 861g Na2EDTA、0. 2g NaN3, NaOH 调 pH 至 7. 2，终体积为 1L。[主要仪器]AKATA Purifier 10 System, (GE Healthcare Life Sciences)900 fraction collector (GE Healthcare Life Sciences)Superdex 200 10/300GL column(GE Healthcare Life Sciences)[实验材料]FPLC样品方法[血清脂蛋白快速分离](a)分离条件进样体积100微升；流速0. 3ml/min ;接样体积0. 5ml,信号采集波长280纳米。(b)分离用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将血清样品进入上样环中，进样,0. 3ml/min洗脱,洗脱至4ml时开始收集样品,O. 5ml/管。(C)统计通过对各峰面积进行积分统计。[血清脂蛋白亚组分的收集]FPLC洗脱至4ml时开始收集样品，O. 5ml/管，将洗脱组分转移至O. 5mlEP管中，根据FPLC谱图中各洗脱部分序号对贮存管进行编号，4度保存，以备后续检测之用。结果及分析实验结果见图10实施例7 :猪血清脂蛋白的快速分离材料[主要试剂]NaCl、KCl、Na2HPO4 · 2H20、KH2PO4, Na2EDTA, NaN3> NaOH[主要试剂配置]FPLC洗脱液配制8g NaCUO. 2g KCl、1.8g Na2HPO4 · 2H20、
0.24gKH2P04、I. 861g Na2EDTA、0. 2g NaN3, NaOH 调 pH 至 7. 2，终体积为 1L。[主要仪器]AKATA Purifier 10 System, (GE Healthcare Life Sciences)900 fraction collector (GE Healthcare Life Sciences)Superdex 200 10/300GL column (GE Healthcare Life Sciences)[实验材料]FPLC样品方法
[血清脂蛋白快速分离](a)分离条件进样体积100微升；流速0. 3ml/min ;接样体积0. 5ml,信号采集波长280纳米。(b)分离用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将血清样品进入上样环中，进样,0. 3ml/min洗脱,洗脱至4ml时开始收集样品,O. 5ml/管。(C)统计通过对各峰面积进行积分统计。[血清脂蛋白亚组分的收集]FPLC洗脱至4ml时开始收集样品，O. 5ml/管，将洗脱组分转移至O. 5mlEP管中，根据FPLC谱图中各洗脱部分序号对贮存管进行编号，4度保存，以备后续检测之用。
结果及分析实验结果见图11实施例8 :人血清脂蛋白的快速分离材料[主要试剂]NaCl、KCl、Na2HPO4 · 2H20、KH2PO4, Na2EDTA, NaN3> NaOH[主要试剂配置]FPLC洗脱液配制8g NaCUO. 2g KCl、1.8g Na2HPO4 · 2H20、0. 24gKH2P04、I. 861g Na2EDTA、0. 2g NaN3, NaOH 调 pH 至 7. 2，终体积为 1L。[主要仪器]AKATA Purifier 10 System, (GE Healthcare Life Sciences)900 fraction collector (GE Healthcare Life Sciences)Superdex 200 10/300GL column(GE Healthcare Life Sciences)[实验材料]FPLC样品方法[血清脂蛋白快速分离](a)分离条件进样体积100微升；流速0. 3ml/min ;接样体积0. 5ml,信号采集波长280纳米。(b)分离用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将血清样品进入上样环中，进样,0. 3ml/min洗脱,洗脱至4ml时开始收集样品,O. 5ml/管。(C)统计通过对各峰面积进行积分统计。[血清脂蛋白亚组分的收集]FPLC洗脱至4ml时开始收集样品，O. 5ml/管，将洗脱组分转移至O. 5mlEP管中，根据FPLC谱图中各洗脱部分序号对贮存管进行编号，4度保存，以备后续检测之用。结果及分析实验结果见图12实施例9:Amplex Red法检测总胆固醇、游离胆固醇标准曲线材料[主要试剂]NaCl、Tris、Triton-XlOO ；CholesteroI oxidase、Cholesterolesterase、Horseradish Peroxidase、Amples Red ；CholesteroK Cholesteryl oleate、2-PropanoI、DMSO。[主要试剂配置]
I)反应缓冲液的配置=NaCl O. 2922g、Tris O. 6057g、Triton-XlOO O. 1ml，用 HCl调至ρΗ7· 4，终体积为50ml。2)催化酶用反应缓冲液将反应酶溶解,终浓度分别为Cholesterol oxidase75U/ml、Cholesterol esterase 200U/ml、Horseradish Peroxidase 200U/ml3) Amplex Red 的配置用 DMSO 溶解 Amples Red 至 400 μ g/ml4)Cholesterol、Cholesteryl oleate 的配置用含有 10 % Triton-XlOO 的2-PropanoI将Cholesterol、Cholesteryl oleate 与 Cholesterol 混合物分别配置成浓度为30720 μ mol/L> 1920 μ mol/L (Cholesteryl oleate 960 μ mol/L> Cholesterol960 μ mol/L)的储备液，应用时用含 10% Triton-XlOO 的 2-Propanol 稀释至 7680、3840、1920、960、480、240、120、60、30、15、7· 5,3. 25,1. 625 μ mol/L 浓度梯度。 [主要仪器]突光酶标仪Spectra Max Gemini XS美国MD公司[实验材料]不同浓度胆固醇与胆固醇酯混合溶液方法[样品中总胆固醇的检测]反应混合物的准备(20份):Cholesterol oxidase 26 μ I、Cholesterolesterase 40 μ I、Horseradish Peroxidase 40 μ I、Amplex Red 100 μ、反应缓冲液1694 μ I。反应在96孔黑板中加入95 μ I反应混和物,然后加入5 μ I样品，37度孵育30分钟，在571nm激发光下检测585nm发射信号值。[样品中游离胆固醇的检测]反应混合物的准备(10份):Cholesterol oxidase 26 μ I、HorseradishPeroxidase 40 μ I> Amplex Red 100 μ、反应缓冲液 1734 μ I。反应在96孔黑板中加入50 μ I反应混和物,然后加入50 μ I样品，37度孵育30分钟，在57 Inm激发光下检测585nm发射信号值。结果及分析实验结果见图13和14实施例10 =Amplex Red法检测金黄地鼠血清FPLC各收集管中总胆固醇、游离胆固醇及胆固醇酯浓度的计算材料[主要试剂]NaCl、Tris、Triton-XlOO ；CholesteroI oxidase、Cholesterolesterase、Horseradish Peroxidase、Amples Red ；CholesteroK Cholesteryl oleate、2-PropanoI、DMSO。[主要试剂配置]I)反应缓冲液的配置=NaCl 0. 2922g、Tris 0. 6057g、Triton-XlOO 0. 1ml，用 HCl调至ρΗ7· 4，终体积为50ml。2)催化酶用反应缓冲液将反应酶溶解,终浓度分别为Cholesterol oxidase75U/ml、Cholesterol esterase 200U/ml、Horseradish Peroxidase 200U/ml
3) Amplex Red 的配置用 DMSO 溶解 Amples Red 至 400 μ g/ml[主要仪器]突光酶标仪Spectra Max Gemini XS美国MD公司[实验材料]FPLC收集样品方法[FPLC收集样品中总胆固醇的检测]反应混合物的准备(10份):Cholesterol oxidase 13 μ I、Cholesterolesterase 20 μ l>Horseradish Peroxidase 20 μ l>Amplex Red 50 μ、反应缓冲液 397 μ I。
反应在96孔黑板中加入50 μ I反应混和物，然后加入50 μ I FPLC收集样品，37度孵育30分钟，在571nm激发光下检测585nm发射信号值。[FPLC收集样品中游离胆固醇的检测]反应混合物的准备(10份):Cholesterol oxidase 13 μ I、HorseradishPeroxidase 20 μ I、Amplex Red 50 μ、反应缓冲液 417 μ I。反应在96孔黑板中加入50 μ I反应混和物，然后加入50 μ I FPLC收集样品，37度孵育30分钟，在571nm激发光下检测585nm发射信号值。[胆固醇酯的计算]计算公式胆固醇酯浓度=总胆固醇浓度-游离胆固醇浓度结果及分析，实验结果见图15-18实施例11 Nile Red法检测金黄地鼠血清FPLC各组分中甘油三酯材料[主要试剂]NileRed、无水甲醇[主要试剂配置]Nile Red工作液的配制用无水甲醇将Nile Red配置为0. 8mg/ml浓度[主要仪器]突光酶标仪Spectra Max Gemini XS美国MD公司[实验材料]FPLC收集样品方法在96孔黑板中加入95μ I FPLC收集样品，然后加入5 μ INile Red工作液，轻微震荡I分钟，在485nm激发光下检测538nm发射信号值。结果及分析实验结果见图19-20
权利要求
1.一种基于血脂蛋白快速分离的脂质荧光检测方法包括如下步骤 A.对分离柱定性可知不同物质随着分子量的减少，其保留体积逐渐变大，不同大小物质的保留体积不同，将未知物质的保留体积与这些标准物质作对比从而对对位未知物的大小进行推测； B.脂蛋白标准品保留体积的确定； C.FPLC样品的准备高速离心将待测血液样品中残留的血细胞去除，同时去除血清中游离的脂质；经过过滤后能除去一些大颗粒物质， D.血清脂蛋白快速分离； E.血清脂蛋白亚组分的收集； F.AmplexRed法检测总胆固醇、游离胆固醇，绘制标准曲线； G.AmplexRed法检测样品血清各收集管中总胆固醇、游离胆固醇； H.利用公式“胆固醇酯浓度=总胆固醇浓度-游离胆固醇浓度”，计算胆固醇酯的浓度。
2.根据权利要求I的方法，其特征在于，步骤H还可以是NileRed法检测样品血清FPLC各组分中甘油三酯。
3.根据权利要求I的方法，其特征在于，步骤A中分离柱的定性的步骤是 1)将GelFiltration Calibration Kits中6种标准品按说明书配置成一定浓度Ovalbumin 4mg/ml, Conalbumin 3mg/ml, Aldolase 4mg/ml, Ferritin I. 2mg/ml,Thyroglobulin 5mg/ml, Blue Dextran 2000 lmg/ml ； 2)取各样品800微升，IOOOOg离心10分钟，0.22微米滤膜过滤，过滤后样品收集至I毫升注射器中(200微升/支，每个样品3支)，用于上样； 3)标准品FPLC分离 (a)分离条件进样体积100微升；流速0.3ml/min ;信号采集波长280纳米； (b)分离用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将样品进入上样环中，进样，0.3ml/min洗脱； (c)统计统计BlueDextran 2000和其它5种蛋白保留体积,计算平均值。
4.根据权利要求I的方法，其特征在于，步骤B中脂蛋白标准品保留体积的确定的步骤是 1)取已知浓度的VLDL(0. 60mg/ml)、LDL(I. 55mg/ml)、HDL(2. 01mg/ml)各 800 微升，IOOOOg离心10分钟，0. 22微米滤膜过滤，过滤后样品收集至I毫升注射器中(200微升/支，每个样品3支)，用于上样； 2)标准品FPLC分离 (a)分离条件进样体积100微升；流速0.3ml/min ;信号采集波长280纳米； (b)分离用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将样品进入上样环中，进样，0.3ml/min洗脱； (c)统计统计三种蛋白保留体积，计算平均值。
5.根据权利要求I的方法，其特征在于，步骤D中血清脂蛋白快速分离的条件为 (a)分离条件进样体积100微升；流速0. 3ml/min ;接样体积0. 5ml,信号采集波长:280纳米；(b)分离用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将血清样品进入上样环中，进样，·0. 3ml/min洗脱,洗脱至4ml时开始收集样品,0. 5ml/管； (C)统计通过对各峰面积进行积分统计。
6.根据权利要求I的方法，其特征在于，步骤F中血清脂蛋白亚组分的收集条件为FPLC洗脱至4ml时开始收集样品，0. 5ml/管，将洗脱组分转移至0. 5mlEP管中，根据FPLC谱图中各洗脱部分序号对贮存管进行编号，4度保存，以备后续检测之用。
全文摘要
本发明涉及一种完善的基于蛋白快速分离(FPLC)和荧光检测技术的血清脂蛋白分离和脂质含量测定技术平台，该技术平台可用于人类高脂血症及各种高脂血症模式动物血清脂蛋白谱的绘制和脂蛋白中脂质含量的检测，观察受试化合物对高脂血症动物血清脂蛋白谱和脂质含量的影响。
文档编号G01N30/02GK102735763SQ20111008103
公开日2012年10月17日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者朱海波, 杨柳 申请人:中国医学科学院药物研究所