专利名称：一种快速筛检动物食品样中抗菌药物残留的检测方法
技术领域：
本发明涉及抗菌药物残留检测分析技术领域，具体地说属于一种利用细菌的生长受到被检样品中抗菌药物抑制而快速筛检食品样品中青霉素药物残留的检测方法。
背景技术：
抗菌药物残留一直是困扰食品安全的严重问题。青霉素类药物是一类重要的 β_内酰胺类抗生素，因其高效、低毒是目前兽医学临床上应用最受青睐的药物之一由于该类药物的广泛使用，使其在动物源性食品上的残留现象越来越严重，虽然青霉素类药物本身对机体没有很强毒性，但容易引起药物过敏反应，是各类过敏药物之最同时，若长期食用低浓度该类抗生素，会使细菌产生耐药性，菌群失调，导致人体免疫力降低此外，还给动物源性食品生产加工带来不可估计的损失因此，建立针对青霉素类药物残留的快检测方法， 开发价格适中的试剂盒产品对控制动物源性食品卫生质量、保障消费者健康、保证工业生产等具有重要的社会经济意义。目前，针对食品抗菌素残留一般有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、分光光度计、化学发光法、酶抑制法、毛细管电泳技术(CE)等。用上述方法检测存在仪器设备复杂、样本前处理和测定操作繁琐的缺陷，设备成本大，检测费用高，对检测人员的要求也高，不适合大量样本筛检，不利于在基层食品检测部门推广应用。开发一种操作方便、费用低、可靠、可用大量检测样品中青霉素药物残留的检测方法势在必行。微生物检测法是根据抗菌物质对微生物的生理机能及代谢的抑制作用来定性或定量确定样品中的抗菌物质残留，具有快速、敏感、廉价等优点。通常在被检测样中培养对抗生素敏感的微生物，如果样品中没有抗生素存在，由于微生物的生长可以观察到培养基变混浊、不透明或由于微生物产酸导致指示剂颜色变化；如果有抗生素或其他抑菌物质存在则会观察到培养基上有抑菌圈形成或培养基仍旧透明，或没有颜色变化。目前，牛奶等液体样的抗菌药物残留微生物检测法主要有氯化三苯基四氮哇法，并已列入国家标准。但该方法的具体操作过程中，干扰因素多；待检的食品样品往往带有固有微生物或外来微生物， 不能保证待检样品无菌状态，这些微生物的存在会严重影响微生物检测法。比如刚采集的生牛乳含有细菌，在温度适宜的条件下，细菌繁殖很快，而且菌相出现交替演变的现象。一般刚采集的生牛乳的PH是中性，含有丰富的乳糖，有利于生牛乳中自然存在的乳酸细菌，例如乳链球菌(Streptococcus lactis)很快地繁殖。它们发酵乳糖产生乳酸，使牛乳的PH降低，并引起蛋白质凝结成乳酪状。低pH最终也抑制了乳链球菌的繁殖，被能耐受更低PH的的菌种乳杆菌(Lactobacillus)所代替，它们完成乳糖发酵，并使 PH更加降低。在这种低pH条件下酵母菌利用乳酸而生长。随着乳糖和乳酸的减少，pH再度上升，大部分假单孢菌(Pseudomonas)和芽孢杆菌(Bacillus)生长繁殖。待检的食品样品还不能采用灭菌的方法，因为这样会影响食品品质；无菌技术，是微生物学的基本要求，这样的现实情况就给才用微生物检测法检测法带来很大问题这些干扰微生物来源不清，种类繁多，严重影响检测细菌的生长(抑制或促进检测微生物的生长)，或者干扰微生物大量繁殖影响到酸碱指示剂的指示结果，对检测结果影响很大，会产生假阴性或假阳性结果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术在推广使用过程中存在的上述缺陷，提供一种不需要特定大型分析仪器设备，具有灵敏度高、可信度高、使用方法简单的筛检方法，使其能有效降低牛奶等动物食品样品中固有微生物等杂菌干扰，减少产生假阴性或假阳性结果。本发明的目的通过以下技术方案实现为解决上述技术问题，本发明提供一株对青霉素药物敏感性高并应用于青霉素药物检测的短双歧杆菌(Bifidobacterium breve) LJM-006 CGMCC No. 5418。本发明的短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve) LJM-006,于 2011 年 10 月 28 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)，保藏编号为 CGMCC No. 5418。本发明的短双歧杆菌LJM-006分离于一名浙江省健康青年人粪便中。本发明的短双歧杆菌LJM-006菌株具有下述微生物学特征(I)菌落形态LJM_006菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光泽、表面光滑、凸起、质地软、边缘整齐，直径1-1. 5_。(2)个体形态为不规则G+无芽孢杆菌，有直杆、弯杆、火柴头状、哑铃形状和大雁状，其中以大雁状为主。(3)生理生化特征D_核糖(+) ;L-阿拉伯糖(-);乳糖(+);纤维二糖(-);松三糖 (+);棉籽糖(+);山梨醇(-);淀粉(-);葡萄糖酸钠(-);木糖(-);甘露糖(+);果糖(+); 半乳糖(+);蔗糖(+);麦芽糖(+);海藻糖(-);密二糖(+);甘露醇(+);菊糖(-);水杨素 (-);F6PPK酶(+);对氧的反应(在好气固体培养基上不生长)；硝酸盐还原(_);触酶(_)； 靛基质反应(_)。厌氧下生长良好，有氧环境中不生长。最适生长温度37_41°C ;最低生长温度 25-280C ;最高 43-450C ;生长最适 pH 6. 5-7. 0 ;在 pH4. 5-5. 0 或 8. 0-8. 5 不生长。LJM-006菌株与同属同种标准菌株相比对青霉素药物敏感性提高了 100倍以上。本发明还提供一种食品中抗菌药物残留的检测方法，所述方法包括以下步骤(I)菌株活化将短双歧杆菌LJM-006菌株接种于营养琼脂斜面培养基上，调节该培养基的PH值至6. 8 7. 2，于35 37°C下进行优化培养，并进行转种继代培养；(2)菌悬液制备取步骤(I)所得短双歧杆菌LJM-006接种于营养琼脂斜面培养基，35±2°C厌氧培养24小时，用灭菌生理盐水将菌苔洗下，制成悬液，调整其OD6tltl值至 0. 25 0. 35，置2-8 °C冰箱中保存；(3)检测管制备以重量计，取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠 5g，K2HPO4 2g，MgSO4 7H20 0. 5g，MnSO4 4H20 0. 2g，低聚果糖 3g，柠檬酸二铵 2g，吐温-80 lmL，蒸馏水1L，加热溶解校正pH值至6.5，115°C高压灭菌15-20分钟，冷却温度为 50 65°C，并迅速取IOmL上述液体，注入IOmL试管内，作为测试菌液待用；(4)样品前处理取待检的动物食品样品匀浆组织5g，用无菌I %磷酸盐缓冲液20mL稀释,镟润混勻，于80°C水浴加热5min,冷却后于5，000r/min离心15min,取上清液作
为供试样品液；(5)样品检测参照TTC法，检验动物食品中抗生素的残留量。取步骤⑷所得供试样品液20 100 μ L加到步骤(3)所述检测管中，密闭封口后于35±2°C厌氧培养8 10小时，加TTC O. 3mL，36±l°C水浴培养30min，根据显色状态判定试验结果检样呈乳的原色时为阳性，呈红色为阴性。本发明的工作菌株为短双歧杆菌LJM-006，已于2011年10月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo. 5418。本发明所述的动物性食品样品包括牛奶、猪肉、牛肉、鸡肉、鸡蛋等。表I显色状态判断标准
权利要求
1.一种快速筛检动物食品样中抗菌药物残留的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)菌株活化将双歧杆菌接种于营养琼脂斜面培养基上，调节该培养基的PH值至6.8 7. 2，于35 37°C下进行优化培养，并进行转种继代培养；(2)菌悬液制备取步骤(I)所得双歧杆菌接种于营养琼脂斜面培养基，35±2°C厌氧培养24小时，用灭菌生理盐水将菌苔洗下，制成悬液，调整其0D_值至O. 25 O. 35，置 2-8 °C冰箱中保存；(3)检测管制备以重量计，取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠 5g，K2HPO4 2g，MgSO4 · 7H20 O. 5g，MnSO4 · 4H20 0. 2g，低聚果糖 3g，柠檬酸二铵 2g，吐温-80 ImL,蒸馏水1L，加热溶解校正pH值至6. 5，115°C高压灭菌15-20分钟，冷却温度为50 650C，并迅速取IOmL上述液体，注入IOmL试管内，作为测试待用；(4)样品前处理取待检的动物食品样品匀浆组织5g，用无菌I%磷酸盐缓冲液20mL 稀释，镟润混勻，于80°C水浴加热5min,冷却后于5,000r/min离心15min,取上清液作为供试样品液；(5)样品检测参照TTC法，检验动物食品中抗生素的残留量。取步骤(4)所得供试样品液20 100 μ L加到步骤(3)所述检测管中，密闭封口后于35±2°C厌氧培养8 10小时，加TTCO. 3mL，36±l°C水浴培养30min，根据显色状态判定试验结果检样呈乳的原色时为阳性，呈红色为阴性。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述双歧杆菌为短双歧杆菌LJM-006菌株。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述抗菌药物为青霉素。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述动物食品为牛奶、猪肉、牛肉、鸡肉、鸡虫寸ο
全文摘要
本发明公开了一种快速筛检动物食品样中抗菌药物残留的检测方法，它包括菌株活化，菌悬液制备，检测管制备，样品前处理，样品检测；利用抗菌药物能抑制对它敏感的细菌生长或繁殖的原理，吸取待检样品加入检测管中，培养一定时间，根据检测管内培养基颜色的变化判断样品中是否含有抗菌药物残留。与现有技术比较，本发明保持了TTC检测法可靠性的基础上解决了该方法中的食品样品中固有微生物或杂菌干扰所造成的假阳性、假阴性结果的问题；具有检测方法简单、干扰小、灵敏度高、准确度高等特点，适用于动物食品样品中抗菌药物残留的高通量快速筛选检测。
文档编号G01N21/78GK102590196SQ20121001420
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月6日 优先权日2012年1月6日
发明者刘佳明, 夏思思, 张志鹏, 樊晓阁, 胡瑜 申请人:温州医学院