专利名称：一种水产品中雪卡毒素的检测方法
技术领域：
本发明涉及ー种毒素的检测方法，特别涉及一种水产品中雪卡毒素的检测方法。
背景技术：
雪卡毒素中毒是ー种全球爆发的海洋食源性疾病，其中太平洋属雪卡毒素是最毒的雪卡毒素，食用含有0. lPg/kg的珊瑚鱼即可引起中毒。雪卡毒素(P-CTXl)是ー类脂溶性聚醚化合物，由13个连续连接成阶梯状的醚环组成，包括5，6，7，8，9元醚环，整个骨架具有反式或顺式的立体化学特征。性质为耐热、易被氧化、不溶于水、可溶于极性有机溶剤。其来源于ー种腰鞭毛藻-冈比尔盘藻(Gambierdiscus toxicus),并能通过食物链的传递而影响到人类的生命健康，毎年都有西加毒素中毒的相关报道。目前国内外已有多种检测方法，但是每种方法都有其优缺点，主要的方法有小鼠生物法、细胞毒性试验、高效液相色谱-质谱分析、免疫測定法等。小鼠生物法的缺点是特异性差、灵敏度低、准确性和重现性·差、不能断定个体毒素成分、操作要求较高技巧、对试验动物的种系及体重要求苛刻；细胞毒性试验的缺点是该技术特异性差，不能确定毒素的准确成分，实验配置及操作人员的技术要求高；免疫測定法的缺点是可能非特异性的检测出其它的聚醚类海洋毒素，引起假阳性的产生；高效液相色谱/质谱分析(HPLC/MS)这种方法具有灵敏度高，可比性和重复性好，可检测样品中各种毒素成分的实际含量水平等特点，一般将HPLC/MS作为其它检测的方法的重要辅助方案，提供准确的參考标准，但是该方法基质效应干扰较大，回收率普遍不高，波动在27%-75%之间。Dechraoui等采用样品均质后超声提取鱼体内的雪卡毒素，优化了样品前处理步骤，但是回收率仍然不稳定。刘红河等将鱼类样品经丙酮提取后，用冷冻脱月旨，经PSA固相萃取柱浄化后，C18色谱柱分离，采用电喷雾串联四极杆质谱进行检测，方法的定量检出限为0. lg/L，平均回收率为82. 3^-87.2 ^因此HPLC/MS是目前研究热点，但至今尚未建立ー种快速溶剂萃取-固相萃取-液相色谱-串联质谱法(ASE-SPE-HPLC/MS/MS)检测水产品中雪卡毒素的检测方法。国内已经在申报的检测雪卡毒素的发明专利有申请号为CN201110149270. 5公开的一种雪卡毒素钠离子荧光探针检测法和申请号为CN201010277323. 7提供的一种毛细管电泳电化学酶联免疫分析检测雪卡毒素，但是这些方法实际检测时灵敏度不高，对于水产品中雪卡毒素的快速检测应用难度较大。
发明内容
本发明提供ー种定性分析结果可靠、检测限低、适用于水产品中雪卡毒素的快速检测的检测方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是
一种水产品中雪卡毒素的检测方法，该方法包括如下步骤
a、样品前处理将待测的鱼肉样品充分混匀并搅碎，装入容器内，密封、冷藏备用；
b、快速溶剂萃取准确称取经前处理的鱼肉样品，放于瓷研钵中，与等重量的硅藻土混匀后转移至不锈钢萃取池中，萃取池两端用玻璃纤维滤膜密封，萃取池用甲醇快速溶剂萃取(ASE)，收集全部萃取溶剂，萃取液于负压状态旋转蒸发干燥处理后，用甲醇溶解，得到粗提液；
C、固相萃取上述粗提液加入等量的去离子水，混匀后依次用SPE固相萃取C18柱浄化和SPE硅胶柱浄化，洗脱液氮气吹干，甲醇溶解后待测；
d、液相色谱-串联质谱分析ESI+模式，选择离子化后的CTX的分子离子[M+NHJ+作为母离子，其 m/z 为 1128. 7，子离子 m/z 为 1093. 7、1075. 7,1057. 7、1039. 7，MRM 监测。e、雪卡毒素标准曲线的制备，取无毒石斑鱼肌肉样品的基质加标配制成系列浓度，求出回归方程与相关系数，根据标准曲线以确定被检测样品中雪卡毒素的含量。本发明通过快速溶剂萃取，大大提高了雪卡毒素的回收率，并结合C18柱和硅胶柱两种SPE小柱，有效去除了其他物质的干扰，提高了实际检测的灵敏度，且HPLC/MS/MS具有·较强的分离能力、定性分析结果可靠、检测限低等优点，本发明适合水产品中雪卡毒素的定性定量检测及食品安全监测。作为优选，快速溶剂萃取的条件为压カ为1500 psi，温度设定在75_85°C，升温和静止时间均为5-8min，吹扫时间为60_80s，循环2_3次，收集全部萃取溶剤。作为优选，SPE固相萃取C18柱上样后，分别用甲醇水溶液清洗和洗脱，得到洗脱液；在洗脱液中加入三氯甲烷和IM NaCl溶液，其中，洗脱液、三氯甲烷和NaCl溶液的体积比为12 10 :6. 3-10，漩涡混匀，4000-8000rpm离心，弃去上层液体，N2吹干，得到的残渣用三氯甲烷溶解，上样到预先用三氯甲烷平衡好的SPE硅胶柱中，上样后，用三氯甲烷清洗，三氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，洗脱液N2吹干，用甲醇溶解，得到P-CTXl甲醇溶液。洗脱液中加入IM NaCl溶液，可以有效防止溶液的乳化作用，提高回收率。清洗液三氯甲烷的体积可以根据实际情况选择，清洗液越多，清洗效果越好，但是耗费时间长。作为优选，固相萃取中，用于清洗的甲醇水溶液，甲醇和水的体积比为13:7 ;用于洗脱的甲醇水溶液，甲醇和水的体积比为4:1 ;所述三氯甲烷和甲醇的混合液中，三氯甲烷和甲醇的体积比为9: I。作为优选，固相萃取中涉及的洗脱过程洗脱速度均为3mL/min。作为优选,步骤d中色谱条件为色谱柱Luna C18 column (250X2. 0mm, 5 u m;Phenomenex, Manchester, UK)或相当者；柱温25. 0°C;进样量20. OML ;流动相A :5mM的甲酸铵+0. 1%的甲酸，B :こ腈。作为优选，所述的步骤还包括回收率实验。本发明具有以下优点
I、应用范围广。本发明可加强海洋生物的雪卡毒素的监控，有利于改善海洋环境，从源头上控制雪卡毒素的产生。有利于水产品流通环节中的监控减少食品中雪卡毒素中毒事件，保障食品安全。2、本发明采用了快速溶剂萃取(ASE)进行加温、加压萃取，与传统提取方法相比，提高了雪卡毒素的提取效率，并节约了提取溶剂(提取溶剂的体积为40mL，而传统方法的提取溶剂高达300mL)，減少了超声提取后后期带来的繁琐手工操作。3、本发明采用了快速溶剂萃取-固相萃取-液相色谱-串联质谱法(ASE-SPE-HPLC/MS/MS)检测水产品中的雪卡毒素，大大提高了雪卡毒素的回收率，并结合C18柱和硅胶柱两种SPE小柱，有效去除了其他物质的干扰，提高了实际检测的灵敏度，且HPLC/MS/MS具有较强的分离能力、定性分析结果可靠、检测限低等优点，与传统的检测方法相比，具有更好的利用价值。4、仪器自动进样，适合大批量生物样品的检测。
图I为利用本发明涉及的雪卡毒素标准色谱 图2为利用本发明涉及的雪卡毒素标准质谱 图3为利用本发明涉及的样品中雪卡毒素色谱 图4为利用本发明涉及的样品中雪卡毒素质谱图；· 图5为利用本发明涉及的空白样品色谱图。
具体实施例方式下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进ー步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量単位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。实施例I ASE-SPE-HPLC/MS/MS检测水产品中的雪卡毒素
1、样品前处理
将待测的鱼肉样品充分混匀并搅碎，装入容器内，密封、冷藏(_18°C)备用；
2、快速溶剂萃取(ASE)
准确称取步骤I处理后的鱼肉样品5. 0g，放入瓷研钵中，加入5. Og的硅藻土，混匀后转移至22. OmL的不锈钢萃取池中，萃取池两端用玻璃纤维滤膜密封。萃取池用甲醇快速溶剂萃取(ASE)，压カ为1500 psi，温度设定在75°C，升温和静止时间均为5min，吹扫时间为60s，循环2次，收集全部萃取溶剤。萃取液于负压状态旋转蒸发近干，用甲醇溶解并定容至5. OmL，得到粗提液；
所述的快速溶剂萃取參数见表I。表I ASE萃取參数
权利要求
1.一种水产品中雪卡毒素的检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤 a、样品前处理将待测的鱼肉样品充分混匀并搅碎，装入容器内，密封、冷藏备用； b、快速溶剂萃取准确称取经前处理的鱼肉样品，放于瓷研钵中，与等重量的硅藻土混匀后转移至不锈钢萃取池中，萃取池两端用玻璃纤维滤膜密封，萃取池用甲醇快速溶剂萃取(ASE)，收集全部萃取溶剂，萃取液于负压状态旋转蒸发干燥处理后，用甲醇溶解，得到粗提液； C、固相萃取上述粗提液加入等量的去离子水，混匀后依次用SPE固相萃取C18柱净化和SPE硅胶柱净化，洗脱液氮气吹干，甲醇溶解后待测； d、液相色谱-串联质谱分析ESI+模式，选择离子化后的CTX的分子离子[M+NHJ+作为母离子，其 m/z 为 1128. 7，子离子 m/z 为 1093. 7、1075. 7,1057. 7、1039. 7，MRM 监测； e、雪卡毒素标准曲线的制备，取无毒石斑鱼肌肉样品的基质加标配制成系列浓度，求出回归方程与相关系数，根据标准曲线以确定被检测样品中雪卡毒素的含量。
2.根据权利要求I所述的一种水产品中雪卡毒素的检测方法，其特征在于快速溶剂萃取的条件为压力为1500 psi，温度设定在75-85°C，升温和静止时间均为5_8min，吹扫时间为60-80s，循环2-3次，收集全部萃取溶剂。
3.根据权利要求I或2所述的一种水产品中雪卡毒素的检测方法，其特征在于SPE固相萃取C18柱上样后，分别用甲醇水溶液清洗和洗脱，得到洗脱液；在洗脱液中加入三氯甲烷和IM NaCl溶液，其中，洗脱液、三氯甲烷和NaCl溶液的体积比为12 10 :6. 3_10，漩涡混匀，4000-8000rpm离心，弃去上层液体，N2吹干，得到的残渣用三氯甲烷溶解，上样到预先用三氯甲烷平衡好的SPE硅胶柱中，上样后，用三氯甲烷清洗，三氯甲烷和甲醇的混合液洗脱，洗脱液N2吹干，用甲醇溶解，得到P-CTXl甲醇溶液。
4.根据权利要求3所述的一种水产品中雪卡毒素的检测方法，其特征在于固相萃取中，用于清洗的甲醇水溶液，甲醇和水的体积比为13:7 ;用于洗脱的甲醇水溶液，甲醇和水的体积比为4:1 ;所述三氯甲烷和甲醇的混合液中，三氯甲烷和甲醇的体积比为9:1。
5.根据权利要求3所述的一种水产品中雪卡毒素的检测方法，其特征在于固相萃取中涉及的洗脱过程洗脱速度均为3mL/min。
6.根据权利要求I或2所述的一种水产品中雪卡毒素的检测方法，其特征在于步骤d中色谱条件为色谱柱Luna C18 column (250X 2. 0mm, 5 μ m; Phenomenex, Manchester,UK)或相当者；柱温25. (TC;进样量20. Ομ ;流动相A 5mM的甲酸铵+0. 1%的甲酸，B :乙月青。
7.根据权利要求I或2所述的一种水产品中雪卡毒素的检测方法，其特征在于所述的步骤还包括回收率实验。
全文摘要
本发明涉及一种毒素的检测方法，特别涉及一种水产品中雪卡毒素的检测方法。本发明采用快速溶剂萃取-固相萃取-液相色谱-串联质谱法(ASE-SPE-HPLC/MS/MS)检测水产品中的雪卡毒素，通过快速溶剂萃取，大大提高了雪卡毒素的回收率，并结合C18柱和硅胶柱两种SPE小柱，有效去除了其他物质的干扰，提高了实际检测的灵敏度，且HPLC/MS/MS具有较强的分离能力、定性分析结果可靠、检测限低等优点，本发明适合水产品中雪卡毒素的定性定量检测及食品安全监测。
文档编号G01N30/06GK102788850SQ20121026749
公开日2012年11月21日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者万婧, 周向阳, 周秀锦, 董莉莉, 邵宏宏, 颜建波 申请人:周秀锦, 舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心