专利名称：一种快速检测铜离子的胶体金增敏层析试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种快速检测铜离子的胶体金增敏层析试纸条及其制备方法和用途，属于免疫学技术领域。
背景技术：
铜是全球用量比较大的重金属之一，现代化工业以及农药化肥的使用、高铜动物添加剂所伴生的铜对环境的污染日益严重。铜在自然界中分布极广，在动植物和人类生活中起到重要作用。高浓度的铜对水生生物和生态系统都有负面影响，抑制河流的自净能力和破坏水的生物平衡系统。当水中铜含量达0.01mg/L时，对水体自净有明显的抑制作用；超过3. Omg/L会产生异味；超过15mg/L就无法饮用，水生生物不能存活。工业废水的排放是铜污染农业土壤的主要来源。由于生物富集作用，铜在土壤和农作物中累积，会造成农作 物特别是水稻和大麦根系生长不良，抑制植物的光合作用，并会污染粮食籽粒，严重的可造成植物的死亡。过量铜在人体内富集，会出现恶心、呕吐、上腹疼痛、急性溶血和肾小管变形等中毒现象，严重者还可导致急性肾衰等危害。铜粉尘可引起咽痛、咳嗽和咯痰，严重会导致胸闷气憋，发冷发烧。我国地下水质量标准(GB/T14848-93)中规定，主要适用于集中式生活饮用水水源及工、农业用水的铜离子限量< I mg/L。因此对环境及农产品中的铜含量的实时监测非常重要。目前，检测铜离子的方法主要是仪器分析法。目前常用的重金属仪器分析检测方法包括电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、石墨炉原子吸收法、紫外-可见分光光度法、原子荧光分析法等。以上这些检测方法虽然能精确测量样品中单种金属的总量，但检测相对费力、费时、费用昂贵，需要进行大量的样品预处理，且样品的检测需在大型分析设备的室内进行，不能用于现场检测。另外，比色检测方法灵敏度达不到要求，生物传感器结合便携式仪器仍处于研究阶段。免疫学检测方法的建立为重金属污染物的检测提供了一种新的途径。ELISA方法具有检测速度较快、费用低廉、简单易携、高度的灵敏度和选择性的特点。这种方法理论上能应用于能产生合适抗体的任何污染物质。近几十年，国内外学者通过选择或合成双功能鳌合剂鳌合重金属离子并与载体蛋白偶联制备出完全抗原，进一步制备出金属特异性单抗。目前，抗Hg(II)、In(III)、Cd(II)、Pb(II)、Cu(II)和Cr(III)等金属鳌合剂复合物抗体相继被研制出来。重金属离子单克隆抗体的制备是免疫学检测方法的基础和关键因素。本发明在制备的铜完全抗原基础上，采用杂交瘤技术制备了特异性抗重金属铜的单克隆抗体，并对其性质进行了鉴定，为免疫学检测方法的建立奠定了基础。Paulk和Taylor自1971年首次将胶体金引入了免疫化学,建立以胶体金标记抗原(或抗体)检测相应抗体(或抗原)的免疫学新方法，为研制特异、敏感、快速(5 10 min出结果)和便捷的免疫学检测技术和临床诊断方法奠定了基础。经过几十年的发展，该技术被广泛应用于生物医学和食品安全快速检测等领域，特别是胶体金免疫层析试纸条以其便捷、快速、准确和无污染等特点被广泛应用于食品安全检测领域，成为目前进行快速诊断的主要方法之一。胶体金标记免疫层析技术具有敏感、特异、便捷、快速的特点，非常适合在基层和现场使用。目前应用酶联免疫检测技术和试纸条技术检测环境中的重金属离子还处于实验室的试验阶段。如果能够应用这些抗体在重金属污染地区进行的现场快速检测和常规检测，这对于重金属污染地区的补救和恢复工作具有很大的意义，因而发展和普及应用重金属快速检测技术潜力很大。
发明内容
本发明的目的针对现有检测铜离子的技术的不足和缺陷，提供一种快速检测铜离子的金标增敏层析试纸条及其制备方法，使其能更加快速、简便、超灵敏检测铜离子残
&3甶O本发明的技术方案一种铜离子胶体金增敏层析检测试纸条，由衬板I和在衬板 上依次衔接的样品垫2、增敏垫4、金标结合垫3、包被膜5和吸水垫6组成金标结合垫3为吸附小金标记铜离子抗体的玻璃纤维棉，增敏垫4为吸附大金标记羊抗鼠IgG的玻璃纤维棉，在包被膜5上依次有用铜离子偶联载体蛋白的溶液印制的直线式隐形检测线T线7，同时用可以与铜单克隆抗体结合的羊抗鼠IgG溶液印制的直线式隐形对照线C线8，两条线平行排列。所述小金标记铜离子抗体为IOnm粒径胶体金溶液标记的铜离子抗体；
所述大金标记羊抗鼠IgG为35nm粒径胶体金溶液标记的羊抗鼠IgG。所述的试纸条所述的衬板为不吸水的硬质塑胶条，或不吸水硬纸条；所述的样品垫为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜；所述的包被膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、或羧化纤维素膜；所述的吸水垫为吸水滤纸或滤油纸。所述的铜离子抗体为铜离子单克隆抗体；所述的金标结合垫吸附小金标记铜离子单克隆抗体；增敏垫吸附大金标记羊抗鼠IgG，并能够与铜离子抗体特异性结合；所述的偶联铜离子的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白KLH，或为牛血清白蛋白BSA，双功能偶联剂为I-(4-异硫氰苄基)_乙烯基二胺-见N，IT，四乙酸(ITCBE)，螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。本发明的有益效果本发明的检测试纸条具有下列优点
①特异性强，敏感性高。该胶体金增敏层析检测试纸条具有两个金标垫，金标结合垫是小金标记高亲和力的铜离子单克隆抗体，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对抗体的特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。增敏垫是大金标记羊抗鼠IgG，可以和铜离子单克隆抗体特异性结合，目的是在减少小金标记铜离子单克隆抗体的工作浓度，提高检测灵敏度的同时，又保证阴性结果的空白值，避免假阳性。因此，该试纸条对其他重金属离子没有交叉，具有较强的特异性和较高的敏感性，检出最低限量可达到10ng/mL。②简便、快速、时效性强。使用胶体金层析检测试纸条，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条加入被检样品液后，在IOmin内即可判定检测结果。③结果显示形象、直观、准确。检测试纸条均以显示红色线T线和C线作为检测结果阳性和阴性标记，即在包被膜上显示一条红色线C线时，表示在被检样品中被检物浓度高于检测线；显示两条红色线T线和C线时，表示在被检样品中被检物浓度低于检测线。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。④节省费用，适用范围广，便于推广。使用检测试纸条，比用仪器分析和ELISA试剂盒的费用大幅下降。另外，试纸条的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括专业检验，海关检疫，卫生检疫，质量监测，加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。
图I铜离子胶体金增敏层析检测试纸条剖面结构示意图。I、衬板，2、样品垫，3、金标结合垫，4、增敏垫，5、包被膜，6、吸水垫，7、隐形检测线T线，8、隐形对照线C线。图2铜离子胶体金增敏层析检测试纸条俯视结构示意图。
具体实施例方式要制成铜离子检测试纸条，首先需要制备偶联铜离子的载体蛋白，用于制备相应的检测线(T线)和免疫原制备抗体。I、铜与载体蛋白偶联
免疫抗原铜-I- (4-异硫氰苄基)-乙烯基二胺-N，N，N，’ -四乙酸_匙孔血蓝蛋白(Cu-EDTA-KLH)的制备。先将2mg的I- (4-异硫氰苄基)_乙烯基二胺-N，N, N\ -四乙酸(ITCBE)和4. 5mg的KLH蛋白在pH 9. 4的2-[4_(2_羟乙基)_1_哌嗪]乙磺酸(HEPES)缓冲液中反应24h后，在4°C、8000r/min的条件下，超滤IOmin去除未偶联上的ITCBE，再用pH7. 4的HEPES缓冲液洗取截留物，然后逐滴加入I mg/mL的Cu2+标准溶液1000 μ L反应Ih后，使用超滤离心管去除未鳌合上的Cu2+，再用HEPES缓冲液稀释截留物，最终得到2mL的溶液。使用前，用100 mmol/L EDTA和O. lmol/L pH 7. 4的HEPES缓冲液对超滤离心管预处理。 检测抗原铜_1_ (4-异硫氛节基)_乙稀基二胺-N, N, Nf, f -四乙酸_牛血清白蛋白(Cu-EDTA-BSA)的制备，用BSA代替KLH，方法同上。无Cu2+检测抗原I-(4_异硫氛节基)-乙稀基二胺四乙酸_牛血清白蛋白(ITCBE-BSA)的制备，用三蒸水替代Cu2+的标准溶液即可，用BSA替代KLH，其余步骤同上。2、抗铜离子单克隆抗体的制备
单抗制备用铜离子载体蛋白结合的免疫抗原(Cu-EDTA-KLH)免疫6_8周龄雌性BALB/c小鼠，免疫剂量为IOOyg/次，采用快速佐剂，腿部肌肉注射。首免，用铜离子载体蛋白免疫抗原与等体积快速佐剂I: I混合，充分混匀；首免3周后进行加强免疫，方法同上，连续免疫3-4次,每次间隔3周,最后一次免疫后10 15天。完全抗原金属离子-螯合剂-载体蛋白与螯合剂-载体蛋白同时包被酶标板，以间接ELISA检测小鼠血清效价，结果显示小鼠血清效价可达I : 8000 I : 128000，并金属离子-螯合剂-载体蛋白的OD值远大于螯合剂-载体蛋白检测值，说明制备的抗原具有较好的免疫原性。免疫3-4次后对小鼠进行尾静脉加强免疫。3、单克隆抗体的制备和腹水纯化取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗铜离子与EDAT螯合剂络合物的单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱导腹水；收集的腹水用辛酸硫酸铵法纯化。4、胶体金制备
由于氯化金极易吸湿，因此使用小剂量封装的氯化金时，必须一次配完。将Ig的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1%的水溶液。放在4°c冰箱内保存，保存时间长达几个月至I年左右。大粒径胶体金的制备取1%的氯金酸溶液10mL，配制成浓度为O. lg/L的氯金酸溶液。取O. lg/L氯金酸溶液200 mL放入锥形瓶，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾并持续2min,在100r/min磁力搅拌下，加入1%柠檬酸三钠水溶液2. 8mL,保持温度和搅拌速度不变，继续搅拌加热6min，直至溶液呈透亮的酒红色。室温冷却，4°C保存备用。获得直径约为35nm的大粒径胶体金溶液用于标记羊抗鼠IgG。 小粒径胶体金的制备洁净的三口烧瓶中加入79mL超纯水，ImL 1%氯金酸溶液作为A液；取一洁净的小瓶子，加入4mL 1%柠檬酸三钠溶液，O. ImL, 1%单宁酸溶液，O. ImL25mM碳酸钾溶液和15. 8mL超纯水作为B液；A、B液均加热到60°C，然后在高速搅拌下把B液迅速加入A液中，最终反应液在60 V下继续搅拌40min形成深红色溶液，然后将溶液加热回流3min形成亮红色溶液，最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的金纳米粒子。获得直径约为IOnm的小粒径胶体金溶液用于标记铜离子抗体。5、铜离子抗体标记的小金结合垫和羊抗鼠IgG标记的大金增敏垫的制备
用O. I mo I/L K2CO3或O. I mo I/L HCl调节胶体金溶液为pH 9. 0，将10 mL胶体金(10nm)溶液加入50 mL烧杯中，用电磁搅拌器250 rpm搅拌,逐滴加入150 μ L 0. 2mg/mL的铜离子单克隆抗体溶液，平衡过夜。逐滴加入5% BSA，使BSA的终浓度为1%，持续搅拌5min，用以饱和游离的胶体金。再将金标抗体溶液常温低速(3000 rpm)离心15 min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀。取红色上清溶液于4°C以11000 rpm离心20 min。溶液分为二层上层透明上清，下层为管底可流动的暗红色沉淀。轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用重悬液(0. OlM硼酸盐缓冲液，pH8. 0)混悬，恢复原体积后再离心，所用重悬液为0. 05M的CBS缓冲液。如此重复2 4次，以彻底除去未结合的蛋白质。最后用重悬液将沉淀混悬为原体积的I /10，4 °C保存备用，获得小金标记铜离子抗体。用0. 05M的CBS缓冲液以1:100 500稀释的胶体金标记抗体吸附于精制玻璃纤维棉中，37°C干燥，制得铜离子抗体标记的小金结合垫。羊抗鼠IgG标记的大金增敏垫的制备过程同上。胶体金溶液用35nm的金溶液，离心转速调节为8000 rpm离心20 min。用0. 05M的CBS缓冲液以1:100 500稀释的胶体金标记羊抗鼠IgG吸附于精制玻璃纤维棉中，37°C干燥，制得羊抗鼠IgG标记的大金增敏垫。6、铜离子胶体金层析试纸条检测反应原理
铜(Cu)原子量仅为64，属于小分子物质。制备的铜离子单克隆抗体对游离铜不能捕获，但是可以识别Cu和乙二胺四乙酸(EDTA)形成的Cu-EDTA络合物。本发明采用竞争法，即样品中的Cu-EDTA络合物和固定在包被膜上的包被抗原Cu-EDTA-BSA竞争胶体金标记的抗Cu-EDTA单克隆抗体。
为了提高试纸条的灵敏度，制备了铜离子抗体标记小金(10 nm)结合垫和羊抗鼠IgG标记大金(35 nm)增敏垫，小金结合垫置于大金增敏垫之下。小金标记的铜离子抗体能够特异性识别样品溶液中的Cu-EDTA，并能够与大金标记羊抗鼠IgG结合。当试纸条以样品垫末端浸入样本后，样品溶液沿着试纸条通过毛细作用从下往上泳动，溶解金标垫上干燥的铜离子抗体标记小金结合垫和羊抗鼠IgG标记大金增敏垫。若待测样品中没有Cu存在，则小金标铜离子抗体会直接泳动到检测线(T)和硝酸纤维膜上的Cu-EDTA-BSA发生免疫反应，从而胶体金颗粒发生聚集，形成红色的线条，然后其他未与Cu-EDTA-BSA结合的金标抗体继续通过毛细管作用向前泳动，与控制线(C)的羊抗鼠二抗发生结合反应，同样形成红色线条，这样包被膜上就会有两条红色线条，表示样品为阴性。随着样品中Cu离子含量的增加，部分抗 体和样品中的Cu-EDTA结合，不能与检测线(T)的Cu-EDTA-BSA结合，所以检测线(T)上的颜色深度逐渐变浅。若待测样品中铜含量超过10ng/mL,金标抗体全部和样品中的Cu-EDTA发生免疫结合，就不会再有抗体与T线包被原结合，从而T线上红色线条消失，表示样品为阳性。C线是为检验金标免疫层析方法本身是否有效而设定的，所以无论样品中是否存在Cu，控制线C都应该显色。如果控制线C不显色，则说明试纸条失效。由于大金标记的羊抗鼠IgG在硝酸纤维膜上的流动性比小金标记的铜离子抗体慢，故在小金标铜离子抗体和硝酸纤维膜上的Cu-EDTA-BSA发生免疫反应后，增敏垫上的大金标记的羊抗鼠IgG涌动到硝酸纤维膜上的Cu-EDTA-BSA处和小金标铜离子抗体发生结合反应，红色线条的颜色进一步加深，所以随着反应时间的延长，T线和C线上的颜色(红色)越深。所以通过添加一个增敏垫可以减少小金标记铜离子单克隆抗体的工作浓度，提高了检测灵敏度，增加的大金标记增敏垫可以保证阴性结果的空白值，避免假阳性。7，实施举例
(I)把选定浓度的包被抗原及羊抗鼠IgG喷在包被膜上，分别作为检测线(T)和控制线(C)，在37°C烘箱干燥lOmin。将一定浓度的金标铜离子单克隆抗体包被在金标结合垫上，将金标记羊抗鼠IgG包被在增敏垫上。试纸条组成为一个衬板，在其上按顺序粘上样品垫、增敏垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫。将贴好的板切割成3mm宽的条，然后将试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。(2)检测固体样品前处理成消化液小麦在70°C干燥72h，研磨彻底，小麦和萃取液(O. 2 mo I /L HCl)按照I : 10(w/v)振荡萃取2h。新鲜的茄子切成片状，与相同质量的超纯水混合压榨成汁状，IOg茄子汁和IOmL的超纯水混合然后和5mL的I mol/L的HCl混合均匀，振荡萃取2h。(3)操作方法将样品萃取液和EDTA螯合剂溶液按9 l(v/v)比例混合均匀，37°C反应O. 5 h使铜离子和EDTA充分螯合，得到样品溶液。(4)将铜离子胶体金层析检测试纸条样品垫端插入100 μ L待测样品液中，插入深度不超过标记线，约5-10min读取试纸条检测结果，读取时，试纸条水平放置，正面观察。(5)结果判定如果在包被膜上仅有C线一条红线显色，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中铜离子浓度大于10ng/mL ;如果在包被膜上C线和T线两条红线都显色，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中铜离子浓度低于10ng/mL ;如果在包被膜上C线红线不显色，则表明试纸条已失效。
权利要求
1.一种铜离子胶体金增敏层析检测试纸条，其特征在于由衬板(I)和在衬板上依次衔接的样品垫(2)、增敏垫(4)、金标结合垫(3)、包被膜(5)和吸水垫(6)组成；金标结合垫(3)为吸附小金标记铜离子抗体的玻璃纤维棉，增敏垫(4)为吸附大金标记羊抗鼠IgG的玻璃纤维棉，在包被膜(5)上依次有用铜离子偶联载体蛋白的溶液印制的直线式隐形检测线T线(7)，用可以与铜单克隆抗体结合的羊抗鼠IgG溶液印制的直线式隐形对照线C线(8)，两条线平行排列； 所述小金标记铜离子抗体为IOnm粒径胶体金溶液标记的铜离子抗体； 所述大金标记羊抗鼠IgG为35nm粒径胶体金溶液标记的羊抗鼠IgG。
2.根据权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述的铜离子抗体为铜离子单克隆抗·体；所述的金标结合垫吸附小金标记铜离子抗体；增敏垫吸附大金标记羊抗鼠IgG，并能够与铜离子抗体特异性结合；所述的偶联铜离子的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白KLH，或为牛血清白蛋白BSA，双功能偶联剂为I-(4-异硫氰苄基)-乙烯基二胺-N，N，IT，f -四乙酸ITCBE,重金属螯合剂为乙二胺四乙酸EDTA。
全文摘要
一种快速检测铜离子的胶体金增敏层析试纸条，属于免疫学技术领域。本发明由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、增敏垫、包被膜和吸水垫组成金标结合垫为吸附小金标记铜离子抗体的玻璃纤维棉，增敏垫为吸附大金标记羊抗鼠IgG的玻璃纤维棉，在包被膜上依次有用铜离子偶联载体蛋白的溶液印制的直线式隐形检测线T线，同时用羊抗鼠IgG溶液印制的直线式隐形控制线C线，两条线平行排列。所提供的快速检测铜离子的金标层析试纸条特异性强，敏感性高；能更加快速、灵敏、简便地检测铜离子残留；结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判；节省费用，适用范围广，便于推广；具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。
文档编号G01N33/577GK102879571SQ201210359920
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者冯民, 邢常瑞, 匡华, 王小晋, 王利兵, 胥传来, 刘丽强, 朱臻怡, 何健, 唐政, 戴建平 申请人:中华人民共和国淮安出入境检验检疫局, 江南大学