专利名称：能同时检测狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病的免疫胶体金试纸及其制备方法
技术领域：
本发明涉及养殖动物疫病的检测器具，具体涉及一种能同时检狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病的免疫胶体金试纸。本发明还涉及该试纸的制备方法。
背景技术：
犬痕热(Caninedistemper,CD)是由犬痕热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的犬和肉食目中许多动物包括狐狸、貉子和水貂的一种高度接触性传染病；细小病毒病(Canine Parvo, CP)是由细小病毒(Canine Parvovirus, CPV)引起的犬类动物包括狐狸、貉子和水貂的一种急性传染病。这两种传染病常引起大批狐狸、貉子和水貂等动物发病，病死率一般在30% 80%之间。随着我国狐狸、貉子和水貂等毛皮动物的饲养量的大幅度增力口，以及异地交流的增多，这两种传染病在我国狐狸、貉子和水貂等毛皮动物中的发病率和致死率均有升高的趋势，是目前对我国狐狸、貉子和水貂等毛皮动物养殖业危害最大的疫 病，受到了广泛的重视。目前，病毒分离、电镜技术、中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)等方法已经在犬瘟热、细小病毒病的诊断中发挥了作用。但是这些方法各有弊端，常规的病毒分离鉴定及中和试验过程繁琐，耗时较长；电镜技术难以在基层推广应用；分子生物学技术如PCR等敏感、特异，技术和设备要求高，这些检测方法难以在兽医临床现场使用。免疫层析胶体金技术具有简便快速，特异性强，敏感性高，肉眼判读，实验结果易保存，无需特殊仪器设备和试剂等优点，已经被广泛应用在兽医临床疾病检测或诊断中。目前，检测犬的众多疫病有其相应疫病的胶体金试纸，而没有专用于检测狐狸、貉子和水貂疫病的胶体金试纸。若临床上狐狸、貉子和水貂发生犬瘟热或(和)细小病毒病，只能借用检测犬的犬瘟热或(和)细小病毒病胶体金试纸，而制备犬的犬瘟热或(和)细小病毒病胶体金试纸所需抗犬瘟热病毒或(和)细小病毒的单克隆抗体的抗原均从犬中分离，用在狐狸、貉子、水貂上可能会造成假阳性或假阴性结果，准确性差。至今，还没有从水貂中分离的病原体作为抗原制备的单克隆抗体制作免疫层析胶体金试纸，更没有能同时检测狐狸、貉子、水貂的犬瘟热和细小病毒病两种疫病的试纸。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，提供一种能同时检测狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病的免疫胶体金试纸，该试纸使用方便，操作简单，检测快速、准确，并且能够用同一试纸同时检测狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病。本发明的目的还在于提供一种能同时检测狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病的免疫胶体金试纸的制备方法。实现上述目的的技术方案是一种能同时检测狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病的免疫胶体金试纸，包括在上面设置加样孔和显色区开口的试纸条卡盒，以及设置在该试纸条卡盒内的试纸条；所述的试纸条包括有硬质聚氯乙烯衬板、硝酸纤维素膜、样品垫和吸收垫，所述的硬质聚氯乙烯衬板设置在所述的试纸条卡盒的盒底面上，所述的硝酸纤维素膜置于所述的硬质聚氯乙烯衬板的上面，在所述试纸条卡盒的一端设有置于所述硝酸纤维素膜上面的一长胶体金结合垫和置于所述长胶体金结合垫上面的一短胶体金结合垫，所述的样品垫置于所述的短胶体金结合垫的上面，该样品垫的上面与所述的加样孔相对应，所述的吸收垫置于所述试纸条卡盒的另一端位于所述硝酸纤维素膜的上面；所述的长胶体金结合垫和短胶体金结合垫上分别喷涂有抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体-胶体金标记物，该抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体为用纯化的貂源犬瘟热病毒和重组的酵母表达的带组氨酸标签的细小病毒的VP2基因蛋白免疫Balb/c小鼠，经细胞融合，筛选得到抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体为杂交瘤细胞系分泌的，所述的硝酸纤维素膜上分别喷涂有兔抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒抗体构成的两条检测线和兔抗鼠抗体构成的一条质控线，该两条检测线和质控线与所述的显色区开口相对应。 所述能同时检测狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病的免疫胶体金试纸的制备方法，它包括以下步骤
1、制备纯化的貂源犬瘟热病毒和重组的酵母表达的带组氨酸标签的细小病毒的VP2基因蛋白；
2、分别用纯化的貂源犬瘟热病毒和重组的酵母表达的带组氨酸标签的细小病毒的VP2基因蛋白免疫Balb/c小鼠，经细胞融合，筛选得到分泌抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体的杂交瘤细胞系；
3、制备抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体；
4、用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
5、将步骤3制得的抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体分别加入步骤4制备得到的胶体金中，分别得到抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体一胶体金标记物；
6、将抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体一胶体金标记物分别喷涂在长胶体金结合垫和短胶体金结合垫上；
7、制备兔抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒抗体，制备兔抗鼠抗体；
8、将兔抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的抗体喷涂在硝酸纤维素膜上构成两条检测线，并将兔抗鼠抗体喷涂在硝酸纤维素膜上构成一条质控线；
9、将硬质聚氯乙烯衬板、硝酸纤维素膜、长胶体金结合垫、短胶体金结合垫、样品垫、吸收垫按顺序粘结在一起组成试纸条，并将该试纸条按要求固定装入试纸条卡盒内，得到所述的能同时检测狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病的免疫胶体金试纸。本发明借助胶体金标记显色的免疫层析反应，以制备能同时检测狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病的免疫胶体金试纸，结构更加合理，应用兔抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒抗体作为检测线，建立竞争免疫层析快速检测待测样品中是否含有犬瘟热病毒和细小病毒。与现有技术相比，本发明具有以下突出优点
I、适用于狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病的快速检测，并且能用同一试纸同时检测犬瘟热病毒和细小病毒。
2、本发明的试纸检测结果特异性强，灵敏度高。犬瘟热病毒或细小病毒细胞半数感染量(TCID5tl)达9. 4X IO5稀释至I :512仍可检测到。3、本发明的试纸不需任何仪器设备，携带方便，检测成本低。4、本发明的试纸操作简单易掌控，无需专业人员操作。5、本发明的试条保存方便，稳定性好。
附图是本发明能同时检测狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病的免疫胶体金试纸的结构示意图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。如附图，本发明能同时检测狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病的免疫胶体金试纸包括有试纸条和试纸条卡盒3,试纸条固定在试纸条卡盒3内。试纸条卡盒3有盒体和上盖两部分，在上盖靠左侧的位置开设有加样孔1，在上盖中部位置开设有显色区开口 2。试纸条是由硬质聚氯乙烯衬板4、硝酸纤维素膜5、样品垫6、吸收垫7、长胶体金结合垫8和短胶体 金结合垫9通过粘结组合成一体而构成，其具体组合结构是硝酸纤维素膜5置于硬质聚氯乙烯衬板4的上面，在硝酸纤维素膜5的上面靠左侧由下至上依次设置长胶体金结合垫8、短胶体金结合垫9和样品垫6，吸收垫7设置在硝酸纤维素膜5上面靠右侧的位置。试纸条可采用粘接、卡槽固定、盒体上盖压紧的方式固定在试纸条卡盒内。在硝酸纤维素膜5的中部喷涂有两条检测线10和一条质控线11。长胶体金结合垫8和短胶体金结合垫9由玻璃纤维素膜制成，一个长胶体金结合垫8和一个短胶体金结合垫9为一组，该两胶体金结合垫上分别喷涂胶体金标记的抗水貂的犬瘟热病毒单克隆抗体和细小病毒VP2基因蛋白单克隆抗体，所述的抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体为用纯化的貂源犬瘟热病毒和重组的酵母表达的带组氨酸标签的细小病毒的VP2基因蛋白免疫Balb/c小鼠，经细胞融合，筛选得到抗貂源犬痕热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体为杂交瘤细胞系分泌的。硝酸纤维素膜5为试纸条的检测膜，上面靠左侧的为两条检测线10，质控线11位于右侧，两条检测线10分别喷涂兔抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒抗体，质控线11喷涂兔抗鼠抗体。当被检样品中含有相应病毒时，病毒可分别先与金标抗貂源犬瘟热病毒单克隆抗体和细小病毒VP2基因单克隆抗体结合，然后在层析作用下与相应检测线上的抗体结合而富集后形成肉眼可见的色带，进而根据显色结果进行判定。本发明能同时检测狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病的免疫层析胶体金试纸的具体制备方法是
I、抗貂源犬瘟热病毒单克隆抗体的制备将从水貂中分离的犬瘟热病毒河北株培养纯化，以培养纯化的貂源犬瘟热病毒河北株免疫Balb/c小鼠，第I次腹部皮下注射完全弗氏佐剂+貂源犬瘟热病毒抗原(I =DlOOyL,按SOyg蛋白/只小鼠的量，初次免疫4只无特定病原体(SPF)的Balb/c雌性小鼠。一周后皮下第一次加强免疫，注射不完全弗氏佐剂+犬瘟热病毒抗原(I : I) 100 μ L，抗原量为50 μ g ;再过14d后，腹腔注射不完全弗氏佐剂+貂源犬瘟热病毒抗原(I : I) 200 μ L，抗原量为100 μ g，间隔14d，尾静脉采血，测定免疫效果。上述，当抗体效价达到要求后，于融合前3d (与上次免疫相隔2周以上)用非乳化抗原加强免疫一次。3d后，无菌取脾进行融合。经过细胞融合，细胞上清用抗原包被的酶标板来筛选，同时设阴、阳性对照。得到的阳性克隆经过多次检测，分泌抗体稳定。有限稀释法克隆3次后，阳性检出率达100%。依法共得14株阳性克隆细胞，再用纯化的貂源犬瘟热病毒包被酶标板，作复合检测，将14株阳性的细胞株，再次用貂源犬瘟热病毒包板，采用酶联免疫吸附试验方法，做第二次筛选，得到3株阳性杂交瘤细胞株编号为4-lE7、6-2H10、7-lC6。将筛选出来的3株阳性细胞株进行亚类鉴定，得到3株免疫球蛋白IgGl类型的阳性杂交瘤细胞株。其腹水效价可达到1:51200和1:204800，细胞培养上清液效价可达到1:256和1:512。将收集的腹水12 OOOXg离心15min，弃去表层油脂，上清用辛酸-硫酸铵法纯化。经辛酸-硫酸铵盐析法纯化尚有少量杂带，单抗样品再经G-蛋白亲和纯化后，几乎无任何杂带出现，抗体纯度非常高。获得的单抗仅与犬瘟热病毒发生特异性反应，而与其它病毒如细小病毒和犬传染性肝炎病毒-I型(CAV- I )及犬传染性肝炎病毒-II型(CAV- II)没有交叉反应。2、抗酵母表达貂源细小病毒VP2基因蛋白的单克隆抗体的制备用聚合酶链式反
应方法对貂源细小病毒VP2基因进行扩增，成功扩增到了细小病毒VP2基因，将细小病毒VP2基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体pPICZAA中，构建真核重组表达载体pPICZAA-VP2，将该重组质粒线性化后，转化巴斯德毕赤酵母X-33中，甲醇诱导表达细小病毒VP2基因，聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法鉴定表达蛋白。结果成功扩增了细小病毒VP2基因，构建了真核重组表达载体PPICZAA-VP2，在巴斯德毕赤酵母中表达出约68 kD蛋白。免疫印迹法鉴定后，表达蛋白为目的蛋白基因VP2。表达菌株扩大表达体系于培养基中培养，上清液用70%过硫酸铵4°C沉淀浓缩，采用His选择镍-亲和层析柱分离纯化获得重组的酵母表达的带组氨酸标签的VP2基因蛋白，表达量约3mg/L。以纯化的酵母重组表达的细小病毒VP2基因蛋白免疫Balb/c小鼠，将过滤后的重组VP2基因蛋白用完全弗氏佐剂隔两周加强一次免疫，换用不完全弗氏佐剂乳化的抗原。一般在3免和4免后第IOd检测Balb/c小鼠抗体效价，当抗体效价达到效价达I : 5000 I : 10000以上时供融合用。取免疫Balb/c小鼠脾脏制备成脾细胞，以聚乙二醇PEG1500为融合剂与骨髓瘤细胞进行融合。挑细胞单克隆，培养于96孔细胞培养板。用免疫原包板，对挑选的克隆采用酶联免疫吸附试验方法，做第一次筛选，得到27株阳性杂交瘤细胞株。用有限稀释法克隆纯化阳性孔，将27株阳性的细胞株，用貂源细小病毒再次包板，采用酶联免疫吸附试验方法，做第二次筛选，得到11株阳性杂交瘤细胞株。通过酶联免疫吸附试验方法筛选，获得4株能稳定分泌抗细小病毒VP2基因蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。4株单克隆抗体中，2株属于免疫球蛋白IgG2b亚类，2株属于免疫球蛋白IgGl亚类，其腹水效价可达到1:51200和1:204800，细胞培养上清液效价可达到1:256,1:512。所获得的单克隆抗体仅与细小病毒及其细小病毒VP2基因蛋白发生特异性反应，而与其它病毒如犬瘟热病毒和犬传染性肝炎病毒-I型及犬传染性肝炎病毒-II型没有交叉反应；荧光免疫染色病毒检测进一步表明单克隆抗体的特异性效果好。3、胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法来制备胶体金。用容量瓶量取IOOmL的三蒸去离子水，倒入规格为500. OmL的平底烧瓶中，将烧瓶放在磁力加热搅拌器的加热套内，放入磁力搅拌子，打开搅拌旋钮至适当速度，打开加热旋钮，加热至沸腾。加入I. OmL 1%氯金酸(HAuCH)溶液，继续加热2min，然后按100. OmL 0.01 %氯金酸；加入1.8mL 1%柠檬酸三钠溶液，继续加热。浅黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后2min内逐渐由黄变灰再变黑最后变红或橙红色。待溶液变为亮红色或橙红色后，再继续加热搅拌15min。制备的胶体金外观呈清亮透明的橙红色，通过分光光度计扫描其在吸收光谱中产生最大吸收所对应的波长Xmax为522nm,通过电镜观察,颗粒大小均勻,平均直径为18. 5nm。4、貂源犬瘟热病毒单克隆抗体(1C6)和细小病毒VP2基因蛋白单克隆抗体(2B3)胶体金标记与纯化。取一系列小试管，分别加入5 mL胶体金，用O. I mol/L碳酸钾(K2CO3)调节胶体金的PH值分别调为6,6. 5、7、7· 5、8、8. 5、9、9· 5、10 ;然后在每种不同pH值的胶体金中分别加入I. Omg/mL的犬瘟热病毒单克隆抗体(1C6) 100. Ομ ，用封口膜封闭试管口，静置15min,4°C 2000r/min离心10 min。取上清用紫外一可见光分光光度计在可见光范围内(400 600 nm)进行扫描，获得胶体金可见光吸收光谱，测定最大吸收波长、吸光值。以出现最大吸收峰时对应的胶体金PH值为最佳标记pH值。犬瘟热病毒单克隆抗体(1C6)胶体金标记的最佳pH值为8. O,当ImL胶体金中单克隆抗体添加量为IOPg时，对应的吸收峰最大，在此基础上再加20%，即最适标记量为12Pg/mL胶体金。由于都 是鼠源单克隆抗体，细小病毒VP2基因蛋白单克隆抗体(2B3)与细小病毒单克隆抗体(1C6)最适标记相同。于50. OmL的小烧杯中加入20. OmL的胶体金，调pH至最佳标记pH值后，在搅拌的状态下缓慢加入一定量稀释好的lmg/mL的单克隆抗体,搅拌30min,加入10%牛血清白蛋白(BSA)至终浓度为1%，继续搅拌30 min，4°C放置2h后，将上述胶体金标记物分装于7. OmL的离心管中，以2 000r/min离心15min,吸出上清,弃沉淀；以8 700r/min离心45 min,弃去上清夜,加入标记洗漆液至原体积；再次以10 000r/min离心30min,弃去上清夜,加入标记洗漆液至原体积；以10 000r/min离心30 min,弃去上清夜,沉淀用I. OOmL标记洗漆液重悬,置4 °C冰箱备用。5、硝酸纤维素膜和胶体金结合垫包被6%甲醇的0.01 mol/L pH 7. 2磷酸盐缓冲液(PBS)为包被缓冲液，0. 22um膜滤过，置4°C备用。封闭液采用2%牛血清白蛋白(BSA)、1% 吐温 20,0. 5% 聚乙烯毗咯烷酮 K30 (PVP K30)，2. 5% 蔗糖、0. 02% 叠氮纳(NaN3)、
0.01 mol/L PH7.4 PBS溶液，0. 22 μ m微孔滤膜滤过，置4°C备用。检测膜为硝酸纤维素膜，选用Millipore HF135，膜的流速为135 士 34 s/cm，孔径大约为0. 45Mm。先将兔抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒抗体、兔抗鼠抗体用所述包被缓冲液稀释后，分别喷涂于所述的硝酸纤维素膜Millipore HF135上，作为检测线10 (犬瘟热线和细小病毒病线)和质控线11，喷涂在检测膜硝酸纤维素膜检测线10上犬瘟热线的兔抗貂源犬瘟热病毒抗体浓度为I. 5mg/mL,喷涂量为2-3PL/cm ;喷涂在检测膜硝酸纤维素膜检测线10上细小病毒病线的兔抗貂源细小病毒抗体浓度为I. 0mg/mL，喷涂量为3_4pL/cm ;喷涂在检测膜硝酸纤维素膜质控线11上兔抗鼠抗体浓度为0. 8mg/mL,喷涂量为l_3PL/cm,于37°C温箱烘干备用。长、短胶体金结合垫的材料为玻璃纤维膜，将胶体金标记的抗貂源犬瘟热病毒单克隆抗体和细小病毒VP2基因蛋白单克隆抗体稀释后，分别喷涂于长胶体金结合垫8和短胶体金结合垫9上，37°C烘干备用。喷涂在长胶体金结合垫的胶体金标记抗貂源犬瘟热病毒单克隆抗体(I. 5mg/mL)和短胶体金结合垫抗貂源细小病毒VP2基因蛋白单克隆抗体(I. 5mg/mL)作5倍稀释，喷涂量分别为 50-6(^L/cm。6、试纸的组装将处理好的样品垫6、喷涂有抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒VP2基因蛋白单克隆抗体-胶体金标记物的长胶体金结合垫8、短胶体金结合垫9、喷涂有兔抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒抗体作为检测线10和喷涂有兔抗鼠抗体作为质控线11的硝酸纤维素膜5、吸收垫7顺序依次粘附在硬质聚氯乙烯衬板4上，组成试纸条，将该试纸条安装在上面开有加样孔I和显色区开口 2的试纸条卡盒3内，真空封装，常温保存，有效期6个月。本发明能同时检测狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病的免疫层析胶体金试纸的应用
I、狐、貉、貂样品的预处理收集到的疑似犬瘟热的狐、貉、貂样品如病狐、貉、貂的眼泪、鼻拭和细小病毒感染的狐、貉、貂粪便或病死的狐、貉、貂脏器样品，各有阴性样品作对照。疑似犬瘟热病毒狐、貉、貂的病料如眼泪、鼻拭、病死脏器样品每份取约O. 5g(mL)左右，加生理盐水约O. 5mL,制成混悬液。疑似细小病毒感染的狐、貉、貂的粪便每份取约 O. 5g左右，加生理盐水约O. 5mL,充分摇动后静置5min (或离心)。2、检测分别取上清液IOOPL滴在本发明试纸上，IOmin后观察结果。同时分别取ΙΟΟμ O. OlM PBS和已知的TCID5tl为9. 4Χ IO5的犬瘟热病毒、细小病毒细胞培养液(I :512稀释)于另两个试纸的加样孔中，做阴性空白和阳性标准品对照试验。3、结果判定在质控线11呈现红色线时，在加样孔I中加入疑似犬瘟热的狐、貉、貂样品，在显色区开口 2处，检测线10出现红色线，为犬瘟热阳性，即样品中含有犬瘟热病毒，不出现红色线，为犬瘟热阴性，即样品中不含有犬瘟热病毒；在加样孔I中加入疑似细小病毒感染的狐、貉、貂的样品，检测线10出现红色线，为细小病毒病阳性，即样品中含有细小病毒，未出现红色线，为细小病毒病阴性，即样品中不含有细小病毒。若质控线11未出现红色线，则试纸无效。本发明的应用效果举例
I、特异性试验对己知的犬瘟热病毒和细小病毒细胞培养液进行交叉试验，同时设PBS阴性对照。用O. OlM PBS对己知的TCID5tl为9. 4X IO5的犬瘟热病毒和细小病毒细胞培养液作倍比稀释至1:512，分别取IOOPL滴在加样孔，用本发明试纸检测，进行敏感性试验。当样品中同时含有犬瘟热病毒和细小病毒时，在显色区开口 2中，检测线10 (两条红色检测线)均呈阳性反应(有2条红色条带出现)，而当样品中只含有犬瘟热病毒或细小病毒时，则只在对应的一条检测线上呈现阳性反应(在相应位置有I条红色线出现)，PBS阴性对照(检测线无任何条带出现)以及犬传染性肝炎病毒-I型及犬传染性肝炎病毒-II型等其它病毒均呈阴性反应(均无条带出现)，多次重复5次后结果相同，说明该方法具有高度的特异性。2、敏感性试验用PBS对已知犬瘟热病毒或细小病毒(细胞半数感染量TCID5tl为
9.4Χ IO5)作倍比稀释至1:512，分别取IOOPL滴在加样孔，试纸仍呈阳性反应(检测线有2条红色条带出现)，证明本发明试纸的敏感性强。3、稳定性试验将本发明的5批试纸(批次号120516、120518、120519、120528、120530)在37°C恒温培养箱中放置7d后，与保存4°C的同批试纸同时检测10份犬瘟热病毒和细小病毒阳性样品和10份犬瘟热病毒和细小病毒阴性样品，结果显示37°C作用7d对本发明的试纸无破坏作用，证明试纸在高温下稳定。4、保存期试验将同一批制备的本发明的试纸，分别在4°C和室温保存I至6个月，于O个月、3个月、6个月取出，检测I份倍比稀释的犬瘟热病毒和细小病毒阳性样品进行保存期敏感性试验，检测10份已知的犬瘟热病毒和细小病毒阳性样品和犬瘟热病毒和细小病毒阴性样品进行保存期特异性试验，观察期敏感性、特异性和稳定性，以确定试纸的保存期。结果显示本发明的试纸经室温保存6个月期特异性、敏感性均不发生改变。
5、与酶联免疫吸附试验、血凝试验方法比较临床上狐、貉、貂的犬瘟热确诊常用酶联免疫吸附试验检测，狐、貉、貂的细小病毒病确诊常用血凝试验方法检测。120份被检犬瘟热疑似病例狐、貉、貂的眼泪(鼻拭、病死脏器)样品中，用酶联免疫吸附试验检测阳性为47份，阴性为73份，用本发明试纸检测阳性为49份，阴性为71份，结果显示犬瘟热用本发明试纸方法检测阳性率40. 83%较酶联免疫吸附试验检测检测阳性率39. 16%高(试验结果同时用聚合酶链式反应方法检测，是相符的);120份被检细小病毒病疑似病例狐、貉、貂的粪便(病死脏器)样品中，用血凝实验方法检测阳性为50份，阴性为70份，用本发明试纸检 测阳性为53份，阴性为67份，结果显示细小病毒病用本发明试纸方法检测阳性率79. 10%较血凝试验实验方法检测检测阳性率71. 42%高(试验结果同时用聚合酶链式反应方法检测，是相符的)。
权利要求
1.一种能同时检测狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病的免疫胶体金试纸，包括在上面设置加样孔和显色区开口的试纸条卡盒，以及设置在该试纸条卡盒内的试纸条；所述的试纸条包括有硬质聚氯乙烯衬板、硝酸纤维素膜、样品垫和吸收垫，其特征是所述的硬质聚氯乙烯衬板设置在所述的试纸条卡盒的盒底面上，所述的硝酸纤维素膜置于所述的硬质聚氯乙烯衬板的上面，在所述试纸条卡盒的一端设有置于所述硝酸纤维素膜上面的一长胶体金结合垫和置于所述长胶体金结合垫上面的一短胶体金结合垫，所述的样品垫置于所述的短胶体金结合垫的上面，该样品垫的上面与所述的加样孔相对应，所述的吸收垫置于所述试纸条卡盒的另一端位于所述硝酸纤维素膜的上面；所述的长胶体金结合垫和短胶体金结合垫上分别喷涂有抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体-胶体金标记物，所述的抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体为用纯化的貂源犬瘟热病毒和重组的酵母表达的带组氨酸标签的细小病毒的VP2基因蛋白免疫Balb/c小鼠，经细胞融合，筛选得到抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体为杂交瘤细胞系分泌的，所述的硝酸纤维素膜上分别喷涂有兔抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒抗体构成的两条检测线和兔抗鼠抗体构成的一条质控线，该两条检测线和质控线与所述的显色区开口相对应。
2.一种权利要求I所述的能同时检测狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病的免疫胶体金试纸的制备方法，其特征是它包括以下步骤 (1)制备纯化的貂源犬瘟热病毒和重组的酵母表达的带组氨酸标签的细小病毒的VP2基因蛋白； (2)分别用纯化的貂源犬瘟热病毒和重组的酵母表达的带组氨酸标签的细小病毒的VP2基因蛋白免疫Balb/c小鼠，经细胞融合，筛选得到分泌抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体的杂交瘤细胞系； (3)制备抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体； (4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金； (5)将步骤(3)制得的抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体分别加入步骤(4)制备得到的胶体金中，分别得到抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体一胶体金标记物； (6)将抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体一胶体金标记物分别喷涂在长胶体金结合垫和短胶体金结合垫上； (7)制备兔抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒抗体，制备兔抗鼠抗体； (8)将兔抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的抗体喷涂在硝酸纤维素膜上构成两条检测线，并将兔抗鼠抗体喷涂在硝酸纤维素膜上构成一条质控线； (9)将硬质聚氯乙烯衬板、硝酸纤维素膜、长胶体金结合垫、短胶体金结合垫、样品垫、吸收垫按顺序粘结在一起组成试纸条，并将该试纸条按要求固定装入试纸条卡盒内，得到所述的能同时检测狐、貉、貂犬瘟热和细小病毒病的免疫胶体金试纸。
全文摘要
本发明公开了一种能同时检测狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病的免疫胶体金试纸及其制备方法。该试纸由试纸条卡盒试纸条组成，试纸条由硬质聚氯乙烯衬板、硝酸纤维素膜、长胶体金结合垫、短胶体金结合垫、样品垫、吸收垫按顺序粘结在一起组成；所述的长、短胶体金结合垫分别喷涂有抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒的VP2基因单克隆抗体-胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上分别喷涂有兔抗貂源犬瘟热病毒和细小病毒抗体构成的两条检测线和兔抗鼠抗体构成的一条质控线。本发明的试纸适用于狐、貉、貂的疫病快速检测，并且用同一试纸能够同时完成狐、貉、貂的犬瘟热和细小病毒病两种疫病的检测，其检测简单方便、快速、准确。
文档编号G01N33/577GK102879573SQ20121037915
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月9日 优先权日2012年10月9日
发明者史秋梅, 贺英, 张艳英, 潘素敏, 高桂生, 邵欣华, 梁银聚, 甄盼盼, 李彩虹 申请人:河北科技师范学院, 河北新华科极兽药有限公司