一种近红外生物荧光染料在活细胞成像中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种近红外生物荧光染料在活细胞成像中的应用；通过培养细胞、配制染料溶液、染色、成像，完成使用近红外生物荧光染料将活细胞成像；本发明使用近红外生物荧光染料染色可以减少光源对细胞及组织的损伤，降低自发荧光的干扰，染色更彻底；本发明使用的近红外荧光染料对线粒体或RNA染色具有特异性。
【专利说明】一种近红外生物荧光染料在活细胞成像中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及活细胞与成像，提供一种近红外生物荧光染料在活细胞成像中的应用。
【背景技术】
[0002]随着生命科学研究的快速发展，生物荧光染料在细胞免疫学、分子生物学、分子遗传学等方面应用越来越广泛，已经成为生命科学研究的重要工具之一。
[0003]RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内，RNA和蛋白质生物合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内，RNA是遗传信息的载体。常用的RNA成像方法有；带有荧光标记的RNA微注射，RNA原位荧光杂交，通过绿色荧光蛋白(GFP)或其衍生物YFP标记与RNA结合的蛋白或是有机染料小分子对RNA进行染色成像。目前商用的用于RNA染色的染料只有SYTO RNASelect—种，且其结构尚未公布。有机小分子荧光染料具有分子体积小，细胞通透性好，光稳定性好等特点。用于DNA染色的有机染料报道很多，但是RNA的却很少，这是由于有机染料对DNA双链结构的选择性要高于RNA的单链结构，所以RNA选择性染料的开发具有重要的应用价值。
[0004] 线粒体是有氧呼吸产生能量的主要场所，能将细胞中的一些有机物当燃料，使这些与氧结合，经过复杂的过程，转变为二氧化碳和水，同时将有机物中的化学能释放出来，供细胞利用。由于线粒体的作用，生物组织内有机物能在氧的参与下转变成无机物，如二氧化碳和水，并为生物组织和细胞提供进行生命活动所需的能量或ATP。目前线粒体的荧光探针主要有:Mitotracker 系列，JC-1, Rhodanmine 123, Rhodanmine 6G, Di0C7 (3), Acridneorange-lOnonyl bromide, DASPMI 和 DASPEI。
[0005]活细胞成像技术的发展有助于我们实时地研究细胞的生命活动，获取更具价值的细胞信息。用于活细胞成像的生物荧光染料很多，但是大部分这些荧光染料的吸收和发射都在400nm-600nm，发射在近红外区域(650nnT900nm)的染料很少。现有的染料在进行染色时，受背景荧光的干扰大。因此，需要对染料和染色过程进行改进，以便减弱背景荧光的干扰，使染色更彻底。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是现有荧光染料在进行染色时，受背景荧光的干扰大，染色不彻底等。本发明通过细胞培养、配制染料溶液、染色步骤，用近红外生物荧光染料将活细胞成像；本发明染色可以减少光源对细胞及组织的损伤，降低自发荧光的干扰，染色更彻底；本发明使用的一些近红外荧光染料对线粒体或者RNA染色具有特异性。
[0007]本发明提供一种近红外生物荧光染料在活细胞成像的应用，应用方法包括以下步骤:
[0008]I)细胞培养
[0009]将细胞接种于共聚焦皿中，在37°C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养12~24h ；其中，细胞培养液中含相应的培养基、10%体积百分数的胎牛血清、lOOiig/mL青霉素和100 u g/mL链霉素；
[0010]2)染料溶液的配制
[0011]将近红外生物荧光染料用二甲亚砜(DMSO)配成5mlTl0mM的染料溶液；
[0012]3)染色
[0013]直接向原细胞培养液中加入步骤2)得到的染料溶液，摇匀，使近红外生物荧光染料的最终浓度为500niT5 u M，得到原细胞培养液和染料溶液的混合液，在37°C、5%C02、饱和湿度中孵育细胞10分钟以上，将线粒体或RNA染色；
[0014]4)成像
[0015]移去步骤3)的混合液，用磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲溶液)冲洗细胞2次以上，之后加入新鲜的细胞培养液，在活细胞工作站中保持37°C、5%C02、饱和湿度，用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像，激发波长为640nm ；
[0016]其中，所述近红外生物荧光染料具有式(I)结构:
[0017]
【权利要求】
1.一种近红外生物荧光染料在活细胞成像的应用，其特征在于，应用方法包括以下步骤: 1)细胞培养 将细胞接种于共聚焦皿中，在37°C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养12~24h ；其中，细胞培养液中含相应的培养基、10%体积百分数的胎牛血清、100iig/mL青霉素和100 u g/mL链霉素； 2)染料溶液的配制 将近红外生物荧光染料用二甲亚砜配成5mlTl0mM的染料溶液； 3)染色 向原细胞培养液中加入步骤2)得到的染料溶液，摇匀，使近红外生物荧光染料的最终浓度为500nM~5 u M，得到原细胞培养液和染料溶液的混合液，在37°C、5%C02、饱和湿度中孵育细胞10分钟以上，将线粒体或RNA染色； 4)成像 移去步骤3)的混合液，用磷酸盐缓冲溶液冲洗细胞，之后加入新鲜的细胞培养液，在活细胞工作站中保持37°C、5%C02、饱和湿度，用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像，激发波长为640nm ； 其中，所述近红外生物荧光染料具有式(I)结构:
2.根据权利要求1所述的，近红外生物荧光染料在活细胞成像的应用，其特征在于，当R4为氢、低级烃基、醚基、低级烷氧基、取代烷基、酰基、氰基或卤素时，所述近红外生物荧光染料对RNA染色成像。
3.根据权利要求1所述的，近红外生物荧光染料在活细胞成像的应用，其特征在于，当R4为芳基时，所述近红外生物荧光染料对线粒体染色成像。
4.根据权利要求1所述的，近红外生物荧光染料在活细胞成像的应用，其特征在于，所述近红外生物荧光染料中，R1与R3、R1与R13、R2与R3> R2与R13、R7与R6> R7与R10> R8与R6、R8与R1Q、R1与R2或R7与R8可形成如下Ia-1n结构:
5.根据权利要求1所述的，近红外生物荧光染料在活细胞成像的应用，其特征在于，所述Rp R2、R7、R8、R9、R11的烃基为直链、支链或环状烃基；所述烃基为1-20个碳原子烃基； 所述Rp R2> R4> R7' R8> R9、R11的醚基中碳原子数为4~20，氧原子数≤8 ；
所述RpRyRpRpIVIVR11的取代烷基为直链或支链；所述取代烷基为苄基、?-甲酸基取代1-20个碳原子烷基、甲酸盐基取代1-20个碳原子烷基、甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基、甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基、磺酸基取代1-20个碳原子烷基、磺酸盐基取代1-20个碳原子烷基、卤素取代1-20个碳原子烷基、Co-羟基取代1-20个碳原子烷基、? -氰基取代1-20个碳原子烷基、? -氨基取代1-20个碳原子烷基、? -巯基取代1-20个碳原子烷基或马来酰亚胺取代1-20个碳原子烷基；其中，所述Co-甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基中甲酸酯基为甲酸2-20个碳原子烃基酯基、甲酸2-20个碳原子取代烷基酯基或苄酯基；所述的甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基中甲酰胺基为2-40个碳原子烃基甲酰胺基或2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基； 所述Rp R2> R4、R7、R8> R9> R11的酰基为2-6个碳原子烷基酰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、1-6个碳原子取代苯甲酰基或卤素取代苯甲酰基； 所述Rp R2> R4、R7、R8> R9> R11的芳基为苯基、低级烷基取代苯基、低级烷氧基取代苯基、卤素取代苯基、硝基取代苯基、甲酸基取代苯基、甲酸盐基取代苯基、甲酸酯基取代苯基、甲酰胺基取代苯基、磺酸基取代苯基、磺酸盐基取代苯基、磺酰氯基取代苯基、羟基取代苯基、氨基取代苯基、胺基取代苯基、氰基取代苯基；其中，所述甲酸酯基取代苯基中酯基为2-20个碳原子烃基酯基、2-20个碳原子取代烷基酯基或苄酯基，所述甲酰胺基取代苯基中甲酰胺基为2-40个碳原子烃基甲酰胺基或2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基，所述胺基取代苯基中的胺基为NR7R8 ； 所述R3、R4、Re、Re、Ri。、Ri2> Ri3的低级经基为甲基、二氣甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、稀丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戍基、异戍基、新戍基、叔戍基或己基； 所述r3、r4、r5、r6、r10> r12、R13的低级烷氧基为甲氧基、三氟甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、环丙氧基、稀丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戍氧基、异戍氧基、新戍氧基、叔戊氧基或己氧基； 所述r3、r4、r5、r6、r1q、r12、r13的卤素为氟、氯、溴或碘； 所述X e为平衡电荷的任意有机或无机阴离子。
6.根据权利要求1所述的，近红外生物荧光染料在活细胞成像的应用，其特征在于，所述Rp R2, R7' R8, R9, R11的直链、支链或环状的包含1-20个碳原子的烃基为甲基、三氟甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、稀丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戍基、异戍基、新戍基、叔戍基、己基、2-甲基戊基、环己基、庚基、2-甲基己基、辛基、2—甲基庚基、壬基、葵基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基或十八烷基； 所述RpHRrIVIVR11中碳原子数为4~20，氧原子数≤8的醚基为CH2CH2OCH2CH3、CH2CH20CH2CH20H、CH2CH2 (OCH2CH2) 2CH2CH3、CH2CH2 (OCH2CH2) 2CH2CH20H、CH2CH2 (OCH2CH2) 3ch2ch3、CH2CH2 (OCH2CH2) 3CH2CH20H、CH2CH2 (OCH2CH2) 4CH2CH3 或 CH2CH2 (OCH2CH2) 4CH2CH20H ； 所述R1，R2，R4，R7，R8,R9，R11中的甲酸基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mCOOH,其中m为1-18 ； 所述R1,R2，R4，R7，R8，R9，R11中的甲酸盐基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mCOOM,其中m为1-18，M为平衡电荷的阳离子；当mRpIVIVRn中所述ω-甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基中甲酸酯基为甲酸2-20个碳原子烃基酯基时，所述ω-甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mCOO(CH2)nCH3、(CH2)niCOOC(CH3)3 或(CH2) ^cOOCH2CH=CH2，其中 m 为 1-18, η 为 0-18 ;当 R1' R2、R4、R7'R8、R9、Rn中所述ω -甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基中甲酸酯基为甲酸2-20个碳原子取代烷基酯基时，所述ω-甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mCOO(CH2)nCH2C00H、(CH2)^COO(CH2)n CH2COOM'(CH2XCOO (CH2)nCH2SO3H 或(CH2)niCOO (CH2)nCH2SO3M,其中 m 为 1-18，η 为0-18，M为平衡电荷的阳离子;所述札、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-甲酸苄酯基取代1-20个碳原子烷基为(CH2) mC00CH2C6H5，其中m为1-18 ； 当所述1、R2> R4、R7> R8> R9> R11中ω -甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基中的甲酰胺基为2-40个碳原子烃基甲酰胺基时，ω-甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mCONH(CH2)nCH3、(CHACON (CH2)nCH3]2，其中 m为 l_18，n 为 0-18 ;所述mRpIVIVRn 中 ω-甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基中的甲酰胺基为2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基时，ω -甲酰胺基取代 1-20 个碳原子烷基为(CH2 )mC0NH (CH2) nCH2C00H、(CH2 )mC0N [ (CH2) nCH2C00H] 2、( CH2)mC0NH (CH2) nCH2C00M、(CH2) mC0N [ (CH2) nCH2C00M] 2、( CH2) mC0NH (CH2) nCH2S03H、(CH2) mC0N [ (CH2)nCH2S03H]2、(CH2)mC0NH(CH2)nCH2S03M或(CH2)mC0N[ (CH2)nCH2S03M]2，其中 m 为 1-18，n 为 0-18，M为平衡电荷的阳离子； 所述R1、R2、 R4、R7、R8、R9、R11中的ω -磺酸基取代1-20个碳原子烷基为(CH2) mS03H，其中m为1-18 ； 所述R1、R2、 R4、R7、R8、R9、R11中的ω -磺酸盐基取代1-20个碳原子烷基为(CH2) mS03M，其中m为1-18，M为平衡电荷的阳离子； 所述R1、R2、 R4、R7、R8、R9、R11中的ω-卤素取代1-20个碳原子烷基为(CH2) mCl，(CH2)mBr, (CH2)mI,其中 m 为 1-18 ； R1、R2、 R4、R7、R8、R9、R11中的ω-羟基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mOH,其中m为 1-18 ； 所述R1、R2、 R4、R7、R8、R9、R11中的ω-氰基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mCN,其中m为 1-18 ； 所述R1、R2、 R4、R7、R8、R9、R11中的ω-氨基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mNH2，其中m为 1-18 ； 所述R1、R2、 R4、R7、R8、R9、R11中的ω-巯基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mSH,其中m为 1-18 ； 所述R1、R2、 R4、R7、R8、R9、R11中2-6个碳原子烷基酰基为乙酰基、丙酰基、丁酰基或叔丁酸基； 所述R1、R2、 R4、R7、R8、R9、R11中1-6个碳原子取代苯甲酰基为甲基取代苯甲酰基、乙基取代苯甲酰基、丙基取代苯甲酰基、丁基取代苯甲酰基或叔丁基取代苯甲酰基； 所述R1、R2、 R4、R7、R8、R9、R11中卤素取代苯甲酰基为氯取代苯甲酰基、溴取代苯甲酰基或碘取代苯甲酰基； 所述R1、R2、 R4、R7、R8、R9、R11中低级烷基取代苯基为甲基取代苯基、乙基取代苯基、丙基取代苯基、异丙基取代苯基、丁基取代苯基、异丁基取代苯基、戍基取代苯基、叔丁基取代苯基或己基取代苯基；所述Rp R2> R4、R7> R8> R9> R11中低级烷氧基取代苯基为甲氧基取代苯基、乙氧基取代苯基、丙氧基取代苯基、丁氧基取代苯基、戍氧基取代苯基、叔丁氧基取代苯基或己氧基取代苯基； 所述1、R2、R4> R7、R8、R9、R11中卤素取代苯基为氟取代苯基、氯取代苯基、溴取代苯基或鹏取代苯基； 所述mRpIVIVRn中的甲酸2-20个碳原子烃基酯基取代苯基为C6H4COO(CH2)nCH3 或 C6H4C00CH2CH=CH2，其中 n 为 0-18 ； 所述Rp R2> R4、R7、R8> R9> R11中的甲酸2-20个碳原子取代烷基酯基取代苯基为C6H4COO (CH2) n CHfOOH、C6H4 ⑶ O(CH2)n CHfOOM、C6H4COO (CH2) nCH2S03H 或 C6H4COO (CH2)nCH2S03M，其中n为0-18，M为平衡电荷的阳离子； 所述mRpIVIVRn中的2-40个碳原子烃基甲酰胺基取代苯基为C6H4CONH(CH2)nCH3 或 C6H4CON [(CH2)nCH3]2，其中 n 为 0-18 ； 所述Rp R2> R4、R7' R8> R9> R11中的2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基取代苯基为C6H4CONH (CH2) nCH2C00H、C6H4CON [ (CH2) nCH2C00H] 2、C6H4CONH (CH2) nCH2OT0M、C6H4CON [ (CH2)nCH2C00M]2、C6H4CONH(CH2)nCH2SO3H, C6H4CON [ (CH2) nCH2S03H] 2、C6H4CONH(CH2)nCH2SO3M,C6H4CON[ (CH2)nCH2S03M]2，其中n为0-18，M为平衡电荷的阳离子；
所述 Rp R2> R4> R7> R8> R9> R11 中的胺基取代苯基为 C6H4NH(CH2)nCH3、C6H4N[(CH2)nCH3]2、C6H4NH (CH2) nCH2C00H、C6H4N [ (CH2) nCHf00H] 2、C6H4NH (CH2) nCH2C00M、C6H4N [ (CH2) nCH2C00M] 2、C6H4NH (CH2) nCH2S03H、C6H4N [ (CH2) nCH2S03H] 2C6H4NH (CH2) nCH2S03M、C6H4N [ (CH2) nCH2S03M] 2、乙酰 基胺基取代苯基、叔丁氧羰基胺基取代苯基、苯甲酰基胺基取代苯基、甲基取代苯甲酰基胺基取代苯基、乙基取代苯甲酰基胺基取代苯基、氯取代苯甲酰基胺基取代苯基、溴取代苯甲酰基胺基取代苯基或马来酰亚胺基取代苯基，其中n为0-18。
【文档编号】G01N21/64GK103725758SQ201210382198
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月10日 优先权日:2012年10月10日
【发明者】汪鹏飞, 周炳江, 刘卫敏, 陈建宏, 庄晓青 申请人:中国科学院理化技术研究所