专利名称：一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法
技术领域：
本发明涉及检测污水的锰含量的方法的领域。
背景技术：
锰Mn广泛分布于生态系统中，是机体的必需微量元素之一。地壳中锰的平均含量为1000mg/kg，环境中的锰污染会造成水体色度大、腥味高。锰含量过高会影响生命体的正常生长发育甚至致死。锰的过量摄入会造成某些器官病变，对人体产生慢性毒害。长期饮用锰含量较高的水，可引起食欲不振、呕吐、腹泻、胃肠道紊乱以及神经系统损伤等疾病。随着、工农业、交通以及医药行业的发展，特别是近年来随着无铅汽油的广泛应用，人们接触低浓度锰的机会日益增加，锰与环境健康的关系日趋受到重视。目前中国水域生态系统和土壤生态系统中包括锰在内的重金属污染日益严重，如铁锰超标的地下水占地下水总量的20%，且主要集中在松花江流域和长江中下游地区，黄河流域、珠江流域等部分地区也有分布。我国猛的生活饮用水水质分级分别为一级0.lmg/L, 二级0.3mg/L,三级0.5mg/L。对环境中锰含量的监测方法主要是仪器分析，如原子吸收和离子色谱等，这些仪器分析方法都需要昂贵设备，前处理步骤繁琐，造价低昂，而且往往由于缺乏特异标样而无法获得精确数值。化学分析中包括过硫酸铵分光光度法、高碘酸银钾分光光度法和甲醛肟分光光度法等测定锰的方法，这些方法都需要大量药品，步骤繁杂，工作量大，而且误差较大。
发明内容
本发明是要解决现有的检测污水的锰含量的方法，存在设备昂贵、处理复杂，成本高，工作量大及误差较大的问题，而提供了一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法。一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法，具体是按以下步骤完成的:一、配置为LB液体培养基:将酵母膏、蛋白胨和NaCl加入水中混合，在IlO0C 130°C灭菌10mirT30min，得到LB液体培养基；其中，所述的蛋白胨与酵母膏的质量比为(1.5 2.5):1，所述的NaCl与酵母膏的质量比为(1.5 2.5): 1，所述的水的体积与酵母膏的质量的比为(0.8L 1.2L):1g ；二、称取步骤一得到的LB液体培养基，向其中加入荧光细菌，在36°C 38°C的温度下，在50/mirT70/min的条件下震荡培养8tTl2h，得到平台期菌液；其中，加入的荧光细菌的体积与步骤一的酵母膏的质量比为(ImLlmL):1g ；三、称取步骤一得到的LB液体培养基，向其中加入步骤二得到的平台期菌液，得到稀释平台期菌液；其中，加入的步骤二的平台期菌液与称取的步骤一得到的LB液体培养基的体积比为1: (10 1000);四、称取步骤三得到的稀释平台期菌液，向其中加入Mn2+，配制成Mn2+的质量一体积浓度为0.lmg/L 10mg/L的菌液，然后，将菌液震荡培养后，得到培养后的菌液I ;其中，震荡培养的条件为在36°C 38°C的温度下，在50r/mirT70r/min的条件下震荡培养4tT6h ；
五、对步骤四得到的培养后的菌液I进行荧光强度检测，得到荧光强度；六、重复步骤四和步骤五，得到不同Mn2+含量的培养后的菌液的荧光强度；七、根据步骤六得到的数据，建立以Mn2+的质量一体积浓度为横坐标，以相对应的荧光强度为纵坐标的直角坐标系，并计算得到二元一次线性回归方程；八、称取步骤三得到的稀释平台期菌液，向其中加入待测污水样品，与步骤四相同的条件进行震荡培养，得到培养后的菌液II ;其中，加入的待测污水样品与称取的步骤三得到的稀释平台期菌液的体积比为(f2):1000 ；九、对步骤八得到的培养后的菌液II进行荧光强度检测，得到荧光强度；十、将步骤九得到的荧光强度通过步骤七得到的二元一次线性回归方程，计算得到污水样品的锰离子的质量一体积浓度，即完成了利用荧光细菌对污水的锰含量的检测。本发明具有以下优点:一、本发明采用带有荧光蛋白的大肠杆菌做标定物，其实验方法规范，菌的生长培养操作简易，使得检测方法的成本低；二、本发明采用荧光检测的方法，其敏感度强于传统的测试方法，使得检测方法更加快捷，采用LB液体培养菌株，观察菌标的生长状况，使得检测方法更直观，易操作，同时，也比传统的琼脂扩散法更准确。
图1为试验一中不同锰含量的菌液与荧光强度的关系图。
具体实施例方式具体实施方式
一:本实施方式提供了一种利用突光细菌检测污水的猛含量的方法，具体是按以下步骤完成的:一、配置为LB液体培养基:将酵母膏、蛋白胨和NaCl加入水中混合，在IlO0C 130°C灭菌10mirT30min，得到LB液体培养基；其中，所述的蛋白胨与酵母膏的质量比为(1.5 2.5):1，所述的NaCl与酵母膏的质量比为(1.5 2.5): 1，所述的水的体积与酵母膏的质量的比为(0.8L 1.2L):1g ；二、称取步骤一得到的LB液体培养基，向其中加入荧光细菌，在36°C 38°C的温度下,在50r/mirT70r/min的条件下震荡培养8h 12h,得到平台期菌液；其中，加入的突光细菌的体积与步骤一的酵母膏的质量比为(ImLlmL):1g ；三、称取步骤一得到的LB液体培养基，向其中加入步骤二得到的平台期菌液，得到稀释平台期菌液；其中，加入的步骤二的平台期菌液与称取的步骤一得到的LB液体培养基的体积比为1: (10 1000);四、称取步骤三得到的稀释平台期菌液，向其中加入Mn2+，配制成Mn2+的质量一体积浓度为0.lmg/L 10mg/L的菌液，然后，将菌液震荡培养后，得到培养后的菌液I ;其中，震荡培养的条件为在36°C 38°C的温度下，在50r/mirT70r/min的条件下震荡培养4tT6h ；五、对步骤四得到的培养后的菌液I进行荧光强度检测，得到荧光强度；六、重复步骤四和步骤五，得到不同Mn2+含量的培养后的菌液的荧光强度；七、根据步骤六得到的数据，建立以Mn2+的质量一体积浓度为横坐标，以相对应的荧光强度为纵坐标的直角坐标系，并计算得到二元一次线性回归方程；八、称取步骤三得到的稀释平台期菌液，向其中加入待测污水样品，与步骤四相同的条件进行震荡培养，得到培养后的菌液II ;其中，加入的待测污水样品与称取的步骤三得到的稀释平台期菌液的体积比为(f2):1000 ；九、对步骤八得到的培养后的菌液II进行荧光强度检测，得到荧光强度；十、将步骤九得到的荧光强度通过步骤七得到的二元一次线性回归方程，计算得到污水样品的锰离子的质量一体积浓度，即完成了利用荧光细菌对污水的锰含量的检测。本实施方式通过检测荧光强度反映菌株的生长情况。本实施方式提供的一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法，具有以下优点:用带有荧光蛋白的大肠杆菌做标定物，其实验方法规范，菌的生长培养操作简易，使得检测方法的成本低；发明采用荧光检测的方法，其敏感度强于传统的测试方法，使得检测方法更加快捷，采用LB液体培养菌株，观察菌标的生长状况，使得检测方法更直观，易操作，同时，也比传统的琼脂扩散法更准确。
具体实施方式
二:本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于:所述步骤一中的蛋白胨与酵母膏的质量比为2:l，NaCl与酵母膏的质量比为2:1，水的体积与酵母膏的质量的比为lL:lg。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三:本实施方式与具体实施方式
一或二的不同点在于:所述步骤一中为在120°C灭菌20min。其它与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四:本实施方式与具体实施方式
一至三之一的不同点在于:所述步骤二中的荧光细菌为大肠杆菌0P50-GFP菌株。其它与具体实施方式
一至三相同。本实施方式所述的大肠杆菌0P50-GFP菌株来自美国NIH资助的国际线虫种质中心 CGC。
具体实施方式
五:本实施方式与具体实施方式
一至四之一的不同点在于:所述步骤二中的加入的荧光细菌的体积与步骤一的酵母膏的质量比为2mL:lg。其它与具体实施方式
一至四相同。
具体实施方式
六:本实施方式与具体实施方式
一至五之一的不同点在于:所述步骤二中为在37°C的温度下，在60r/min的条件下震荡培养10h。其它与具体实施方式
一至五相同。
具体实施方式
七:本实施方式与具体实施方式
一至六之一的不同点在于:所述步骤三中的加入的步骤二的平台期菌液与称取的步骤一得到的LB液体培养基的体积比为1:100。其它与具体实施方式
一至六相同。
具体实施方式
八:本实施方式与具体实施方式
一至七之一的不同点在于:所述步骤四中的配制的菌液中Mn2+的质量一体积浓度为0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、lmg/L、2mg/L、5mg/L或10mg/L。其它与具体实施方式
一至七相同。本实施方式所述的Mn2+的质量一体积浓度是参考生活饮用水水质标准和污水排放浓度进行定量的。
具体实施方式
九:本实施方式与具体实施方式
一至八之一的不同点在于:所述步骤四中的菌液在37°C的温度下，在60r/min的条件下震荡培养5h。其它与具体实施方式
一至八相同。
具体实施方式
十:本实施方式与具体实施方式
一至九之一的不同点在于:所述步骤八中的加入的待测污水样品与称取的步骤三得到的稀释平台期菌液的体积比为1:1000。其它与具体实施方式
一至九相同。采用以下试验验证本发明的效果:试验一:一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法，具体是按以下步骤完成的:一、配置为LB液体培养基:将酵母膏、蛋白胨和NaCl加入水中混合，在120°C灭菌20min，得到LB液体培养基；其中，所述的蛋白胨与酵母膏的质量比为2:1，所述的NaCl与酵母膏的质量比为2:1，所述的水的体积与酵母膏的质量的比为lL:lg;二、称取步骤一得到的LB液体培养基，向其中加入大肠杆菌0P50-GFP菌株，在37°C的温度下，在60r/min的条件下震荡培养10h，得到平台期菌液；其中，加入的大肠杆菌0P50-GFP菌株的体积与步骤一的酵母膏的质量比为ImL:1g ；三、称取步骤一得到的LB液体培养基，向其中加入步骤二得到的平台期菌液，得到稀释平台期菌液；其中，加入的步骤二的平台期菌液与称取的步骤一得到的LB液体培养基的体积比为1:100 ;四、称取步骤三得到的稀释平台期菌液，向其中加入MnCl2.4Η20，配制成Mn2+的质量一体积浓度为0.lmg/L的菌液，将菌液在37°C的温度下，在60r/min的条件下震荡培养5h，得到培养后的菌液I ;五、对步骤四得到的培养后的菌液I进行荧光强度检测，得到荧光强度；六、重复步骤四和步骤五,得到Mn2+的质量一体积浓度为0.3mg/L、0.5mg/L、lmg/L、2mg/L，5mg/L和10mg/L的培养后的菌液的荧光强度；七、根据步骤六得到的数据，建立以Mn2+的质量一体积浓度为横坐标，以相对应的荧光强度为纵坐标的直角坐标系，并计算得到二元一次线性回归方程；其中，所述的二元一次线性回归方程为Υ=_44.373Χ+991.45 ；八、称取步骤三得到的稀释平台期菌液，向其中加入待测污水样品，在37°C的温度下，在60r/min的条件下震荡培养5h，得到培养后的菌液II ;其中，加入的待测污水样品与称取的步骤三得到的稀释平台期菌液的体积比为1:1000 ；九、对步骤八得到的培养后的菌液II进行荧光强度检测，得到荧光强度为822.8AU ；十、将步骤九得到的荧光强度通过步骤七得到的二元一次线性回归方程，计算得到污水样品的锰离子的质量一体积浓度为3.8mg/L,即完成了利用荧光细菌对污水的锰含量的检测。对步骤七中的建立以Mn2+的质量一体积浓度为横坐标，以相对应的荧光强度为纵坐标的直角坐标系做图，得到图1。图1为试验一中不同锰含量的菌液与荧光强度的关系图。从图中，可以计算得到二元一次线性回归方程为Υ=_44.373Χ+991.45。
权利要求
1.一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法，其特征在于:利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法具体是按以下步骤完成的: 一、配置为LB液体培养基:将酵母膏、蛋白胨和NaCl加入水中混合，在110°C^130°C灭菌10mirT30min，得到LB液体培养基；其中，所述的蛋白胨与酵母膏的质量比为(1.5^2.5):1，所述的NaCl与酵母膏的质量比为(1.5^2.5): 1，所述的水的体积与酵母膏的质量的比为(0.8L L2L):lg ； 二、称取步骤一得到的LB液体培养基，向其中加入荧光细菌，在36°C 38°C的温度下，在50r/mirT70r/min的条件下震荡培养8tTl2h，得到平台期菌液；其中，加入的荧光细菌的体积与步骤一的酵母膏的质量比为(ImLlmL):1g ； 三、称取步骤一得到的LB液体培养基，向其中加入步骤二得到的平台期菌液，得到稀释平台期菌液；其中，加入的步骤二的平台期菌液与称取的步骤一得到的LB液体培养基的体积比为1: (10 1000); 四、称取步骤三得到的稀释平台期菌液，向其中加入Mn2+，配制成Mn2+的质量一体积浓度为0.lmg/L^lOmg/L的菌液，然后，将菌液震荡培养后，得到培养后的菌液I ;其中，震荡培养的条件为在36°C 38°C的温度下，在50r/mirT70r/min的条件下震荡培养4tT6h ； 五、对步骤四得到的培养后的菌液I进行荧光强度检测，得到荧光强度； 六、重复步骤四和步骤五，得到不同Mn2+含量的培养后的菌液的荧光强度； 七、根据步骤六得到的数据，建立以Mn2+的质量一体积浓度为横坐标，以相对应的荧光强度为纵坐标的直角坐标系，并计算得到二元一次线性回归方程； 八、称取步骤三得到的稀释平台期菌液，向其中加入待测污水样品，与步骤四相同的条件进行震荡培养，得到培养后的菌液II ;其中，加入的待测污水样品与称取的步骤三得到的稀释平台期菌液的体积比为(广2):1000 ； 九、对步骤八得到的培养后的菌液II进行荧光强度检测，得到荧光强度； 十、将步骤九得到的荧光强度通过步骤七得到的二元一次线性回归方程，计算得到污水样品的锰离子的质量一体积浓度，即完成了利用荧光细菌对污水的锰含量的检测。
2.根据权利要求1所述的一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法，其特征在于:所述步骤一中的蛋白胨与酵母膏的质量比为2:l，NaCl与酵母膏的质量比为2:1，水的体积与酵母膏的质量的比为lL:lg。
3.根据权利要求1或2所述的一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法，其特征在于:所述步骤一中为在120°C灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法，其特征在于:所述步骤二中的荧光细菌为大肠杆菌0P50-GFP菌株。
5.根据权利要求1或4所述的一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法，其特征在于:所述步骤二中的加入的荧光细菌的体积与步骤一的酵母膏的质量比为2mL:lg。
6.根据权利要求1或4所述的一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法，其特征在于:所述步骤二中为在37°C的温度下 ，在60r/min的条件下震荡培养10h。
7.根据权利要求1所述的一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法，其特征在于:所述步骤三中的加入的步骤二的平台期菌液与称取的步骤一得到的LB液体培养基的体积比为1:100。
8.根据权利要求1所述的一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法，其特征在于:所述步骤四中的配制的菌液中Mn2+的质量一体积浓度为0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、lmg/L、2mg/L、5mg/L 或 10mg/Lo
9.根据权利要求1或8所述的一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法，其特征在于:所述步骤四中的震荡培养的条件为在37°C的温度下，在60r/min的条件下震荡培养5h。
10.根据权利要求1所述的一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法，其特征在于:所述步骤八中的加入的待测污水样品与称取的步骤三得到的稀释平台期菌液的体积比为1:10 00。
全文摘要
一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法，涉及检测污水的锰含量的方法的领域。本发明是要解决现有的检测污水的锰含量的方法，存在设备昂贵、处理复杂，成本高，工作量大及误差较大的问题。一种利用荧光细菌检测污水的锰含量的方法一、配置为LB液体培养基；二、培养荧光细菌；三、稀释菌液；四、配制不同锰含量的菌液并培养；五、进行荧光检测；六、建立直角坐标系，计算回归方程；七、检测含有待测污水的菌液的荧光强度；八、计算得出待测污水的锰含量。本发明应用于污水检测领域。
文档编号G01N21/64GK103091290SQ20131000097
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月4日 优先权日2013年1月4日
发明者王云彪, 侯晓丽, 张凤君 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所