细胞阻抗分析的芯片及仪器的制造方法
【专利摘要】本发明提供了一种细胞阻抗分析的芯片及仪器。该芯片包括：绝缘基片，其中央位置定义为阻抗分析区域；微型金属电极阵列，形成于绝缘基片上，包括彼此绝缘的N个微型金属电极，该N个微型金属电极呈辐射状均匀分布在阻抗分析区域的圆周上，每一微型金属电极内侧的敏感部伸入阻抗分析区域内，其中N≥4；绝缘保护层，覆盖于除阻抗分析区域及微型金属电极上内侧敏感部和外侧引线部之外的其他区域；以及测量阱，形成于阻抗分析区域的四周绝缘保护层上，在该阻抗分析区域的上方形成容置待分析样品的容置区，该容置区的内半径等于或略大于阻抗分析区域半径。本发明提供的细胞阻抗分析的芯片及仪器可以对单细胞进行阻抗测量分析。
【专利说明】细胞阻抗分析的芯片及仪器
【技术领域】
[0001]本发明属于微型传感器芯片【技术领域】，尤其涉及一种可以进行生物细胞阻抗检测与分析的细胞阻抗分析芯片及仪器。
【背景技术】
[0002]随着社会对环境、健康等的关注，人们对生物医学检测的要求越来越高。细胞水平的研究，可以获得反映生物生理状态和过程的更准确、更全面的信息，还可以使人们能更好地了解细胞群体中某些特殊的细胞功能，更深入地认识细胞个体差异、细胞间相互作用和信息传递以及神经递质、药物或毒物刺激的生理影响等更深层次的信息。细胞水平的分析具有重大而深远的意义。
[0003]由于受技术限制，生物的常规分析方法一般以大量细胞为研究对象，用平均结果反映细胞的生理信息。由于生物组织中各种化学成分分布及细胞本身的高度不均匀性，大量细胞分析常常得出不准确甚至错误的结论。因此直接分析细胞及亚细胞水平的特性十分重要。根据不同生理状态下细胞表现出不同的阻抗特性，利用MEMS工艺制作出微型多电极阻抗分析芯片，多电极采集数据，丰富了采样信息，提高了分析精度与分辨率。
[0004]参考文献I (中国专利，专利申请号:98813315)提出了一种细胞阻抗分析芯片。图1A为现有技术细胞阻抗分析芯片的示意图。图1B为图1A所示细胞阻抗分析芯片中央阻抗分析区域的放大图。请参照图1A和图1B，该细胞阻抗分析芯片包括绝缘基底、参考电极、与参考电极相连的导电布线、设置在绝缘基底上的测量微电极阵列、用于所述测量微电极布线的导电图形、连接到所述导电图形的端部的电触点、覆盖所述导电图形表面和参考电极布线的绝缘膜、和包围包含所述绝缘膜的表面上的测量微电极的区域的壁，该细胞电位测量电极在由所述壁包围的区域内培养细胞或细胞组织时用于测量电生理学活性，其中阻抗比所述测量微电极小的参考电极被分别布置在由所述壁包围的区域中的多个位置上，并位于所述测量微电极阵列之外，在所述测量区域互相绝缘，用于参考电极的电触点连接到与参考电极相连的导电图形的端部，并且其中各测量微电极之间、各参考电极之间、以及测量微电极和参考电极之间都相互绝缘。
[0005]在实现本发明的过程中，发明人发现上述的细胞阻抗分析芯片存在如下技术缺陷:(1)它是一种平面阵列排布的电极结构，只适合对具有较大尺寸的神经细胞的分析；
(2)它不能够对细胞的阻抗分布进行扫描成像，对细胞内的生命活动进行动态测量分析。
【发明内容】
[0006](一 )要解决的技术问题
[0007]为解决上述的一个或多个问题，本发明提供了一种细胞阻抗分析的芯片及仪器。
[0008]( 二 )技术方案
[0009]根据本发明的一个方面，提供了一种细胞阻抗分析芯片，该细胞阻抗分析芯片包括:绝缘基片，其中央位置定义为阻抗分析区域；微型金属电极阵列，形成于绝缘基片上，包括彼此绝缘的N个微型金属电极，该N个微型金属电极呈辐射状均匀分布在阻抗分析区域的圆周上，每一微型金属电极内侧的敏感部伸入阻抗分析区域内，其中N ^ 4 ;绝缘保护层，覆盖于除阻抗分析区域及微型金属电极上内侧敏感部和外侧引线部之外的其他区域；以及测量阱，形成于阻抗分析区域的四周绝缘保护层上，在该阻抗分析区域的上方形成容置待分析样品的容置区，该容置区的内半径等于或略大于阻抗分析区域半径。
[0010]根据本发明的另一个方面，还提供了一种包括上述细胞阻抗分析芯片的细胞阻抗分析仪器。该仪器还包括:驱动电流模块、测量电压模块及阻抗图像重构模块；其中，驱动电流模块具有两电极，该两电极按照预设的电流驱动模块连接至N个微型金属电极中的两个微型金属电极上，用于向测量阱内的样品输入驱动电流；测量电压模块具有两电极，该两电极按照预设的电压测量模式连接至除上述两个微型金属电极之外的另两个微型金属电极上，用于测量测量阱内的样品在上述驱动电流的激励下，在该两个微型金属电极所产生的电压；阻抗图像重构模块，用于根据由多个电流驱动模式与电压测量模式的组合而获得的微型金属电极的电压，对阻抗分析区域内的样品进行阻抗图像重构。
[0011](三)有益效果
[0012]从上述技术方案可以看出，本发明细胞阻抗分析芯片及仪器具有以下有益效果:
[0013](I)采用环形分布的微电极，布置在略大于细胞尺寸的测量阱周边，可以对单细胞进行阻抗测量分析。具体来讲:根据细胞的不同生理状态具有不同的电阻抗特性这一物理现象，通过对样品施加一个安全恒定的电压或电流，通过测量电极测量样品表面的电流或电压，得到内部的电阻抗分布。可以对小尺寸的单细胞进行阻抗测量分析，特别是球形或类似形状的细胞，且电极是布置在细胞的周围，对细胞分析测试干扰较小；
[0014](2)可以对细胞进行阻抗扫描成像，用电学特性反映细胞活动组织的解剖学及结构。采用电流驱动电压测量的驱动测量方式，电流驱动模式有相邻、交叉、相对驱动模式，采用的电压测量模式为测量除激励电极之外的其他相邻电极的电压，通过采用适当的电流驱动模式和电压测量模式采集数据，对阻抗分析区域的样品进行阻抗图像重构，从而通过图像直观全面的反应出细胞活动的生物信息。
[0015](3)该芯片提取的微纳米尺度细胞样品的生理、病理状态相关的电特性信息，既可以反映其解剖学结构，还可以给出功能性图像结果。该仪器具有结构微型化、测量灵敏化、样品无创化、信息多样化等特点，可实现细胞及亚细胞水平的阻抗测量与分析，为研究细胞的生理变化提供有力依据，对疾病的预测、诊断、治疗有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1A为现有技术细胞阻抗分析芯片的示意图；
[0017]图1B为图1A所示细胞阻抗分析芯片中央阻抗分析区域的放大图
[0018]图2A为根据本发明实施例细胞阻抗分析芯片的俯视示意图；
[0019]图2B为图2A所示细胞阻抗分析芯片沿A-A方向的剖面图；
[0020]图3为根据本发明实施例细胞阻抗分析仪器的结构示意图。
[0021]【本发明主要元件符号说明】
[0022]1-绝缘基片； 2-微型金属电极阵列
[0023]3-绝缘保护层；4-测量阱；[0024]5-样品盖。
【具体实施方式】
[0025]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。需要说明的是，在附图或说明书描述中，相似或相同的部分都使用相同的图号。附图中未绘示或描述的实现方式，为所属【技术领域】中普通技术人员所知的形式。另外，虽然本文可提供包含特定值的参数的示范，但应了解，参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应的值。
[0026]本发明融合细胞阻抗特性原理及电阻抗成像技术，提供一种细胞阻抗分析的芯片及仪器，以实现生物细胞的阻抗分析。
[0027]在本发明的一个示例性实施例中，提供了一种细胞阻抗分析芯片。图2A为根据本发明实施例细胞阻抗分析芯片的俯视示意图。图2B为图2A所示细胞阻抗分析芯片沿A-A方向的剖面图。请参照图2A和图2B，本实施例细胞阻抗分析芯片包括:绝缘基片1，其中央位置定义为阻抗分析区域；微型金属电极阵列2，包括彼此绝缘的N个微型金属电极，该N个微型金属电极呈辐射状均匀分布在所述阻抗分析区域的圆周上，每一微型金属电极内侧的敏感部伸入所述阻抗分析区域内，其中N > 4 ;绝缘保护层3，覆盖于所述微型金属电极上除所述内侧敏感部及外侧引线部之外的区域；测量阱4，位于所述阻抗分析区域的四周，其高度高于该阻抗分析区域的高度，从而在该阻抗分析区域的上方形成容置待分析样品的容置区，该容置区的内半径等于或略大于该阻抗分析区域半径；样品盖5，固定于所述测量阱外侧的绝缘保护层上，其高度高于该测量阱的高度，以将所述阻挡分析区域与外界环境隔离。
[0028]以下分别对本发明实施例细胞阻抗分析芯片的各个组成部分的技术细节进行详细说明。
[0029]在本实施例中，绝缘基片为1.5X1.5cm2的玻璃片，但本发明并不以此为限。本领域技术人员还可以根据需要来选择其他类型和尺寸的绝缘基片，例如表面沉积氮化硅的硅片或ITO玻璃。
[0030]在玻璃片中心区域设置圆形的阻抗分析区域，为了便于测量细胞或亚细胞的阻抗特性，该圆形阻抗分析区域的尺度为50 ym。本领域技术人员应当清楚，该圆形阻抗分析区域的尺度取决于样品中细胞的大小，一般情况下为微米尺度，可根据测量要求具体确定。
[0031]在图2和图3所示的细胞阻抗分析芯片中，在玻璃片的上表面，围绕阻抗分析区域上分布16个微型金属电极。其中，微型金属电极的大小、形状均相同，且电极间距相同，电极顶端线宽与电极间距线宽相同。当然，微型金属电极的数目也不限于为16个，其可以为(但不仅限于)8个、16个或32个。
[0032]每一微型金属电极均可作为激励电极输入信号，也可以作为响应电极输出信号。微型金属电极阵列的材料可以为(但不仅限于)金或钼金，其为利用溅射和剥离工艺制作。
[0033]微型金属电极内侧敏感部的顶端形状呈线形或者弧线形，均匀分布于中心圆形阻抗分析区域上，其伸入阻抗分析区域内的长度约为2-10 y m，用于给阻抗分析区域的样品加测量电流或采集由待分析样品阻抗产生的电压信号；其外侧引线部呈长方形，可通过引线与外电路相连，用于接收测量电流或将由敏感部采集的电压信号向外传输。[0034]在本实施例中，绝缘保护层3为氮化硅层，其厚度为8000A。在制备该氮化硅层时，首先利用等离子增强化学气相淀积(PECVD)工艺在整个基片，包括位于其上的微型金属电极阵列的上方制作氮化硅绝缘层，而后使用离子刻蚀工艺去除阻抗分析区域和微型金属电极外侧引线部的氮化硅层，中心区域氮化硅的半径略大于阻抗分析区域的半径，约为55 u m。需要特别强调的是，伸入阻抗分析区域的微型金属电极的敏感部是裸露的，并没有被氮化硅层所覆盖。此外，该绝缘保护层3的材料还可以为具有绝缘性质的有机聚合物，例如:聚酰亚、聚二甲基硅氧烷或具有绝缘性质的光刻胶等。
[0035]请参照图2和图3，在中心圆形阻抗分析区域正上方，以聚合物构筑测量阱，用于容置待测样品。电极在测量阱内微露，与样品接触。该测量阱成圆柱形，其材料为SU_8，高度为30 u m,讲里半径为60 u m,讲外半径为600 u m。
[0036]当然，本领域技术人员应当清楚，该测量阱的尺寸、阱里半径和阱外半径均可以根据需要灵活调整。而制备聚合物阱的材料除SU-8光刻胶之外，还可以为聚酰亚胺、聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其他生物兼容聚合物等材料。
[0037]该细胞阻抗分析信号还包括一用于存储缓冲液的样品盖5。该样品盖的内圆柱形槽的内径大于测量阱的外径，该样品盖固定在测量阱外侧的绝缘保护层上。在本实施例中，该样品盖的材料为聚酰亚胺、PDMS，其形状可以是是圆形、方形或长方形。其圆柱形槽的半径为2mm,壁厚2mm。
[0038]在进行测量时，通过注射样品的针头刺穿样品盖，将样品注入测量阱内，而后拔出针头。由于缓冲液的表面张力作用，缓冲液并不会随针孔流出。通过该样品盖，减少样品蒸发，减小环境对实验的影响。对于固定样品盖的芯片来讲，其是一次性使用的。当不包含样品盖时，可以重复使用，但不推荐如此使用。
[0039]至此，本实施例细胞阻抗分析芯片介绍完毕。依照本实施例的说明，结合自身的专业知识，本领域技术人员应当能够对本发明细胞阻抗分析芯片具有清楚的认识。
[0040]在本发明的另一个示例性实施例中，还提供了一种细胞阻抗分析仪器。如图3所示，该仪器包括:上述的细胞阻抗分析芯片、驱动电流模块、测量电压模块及阻抗图像重构模块。其中，驱动电流模块具有两电极，该两电极按照预设的电流驱动模块连接至N个微型金属电极中的两个微型金属电极上，用于向测量阱内的样品输入驱动电流。测量电压模块具有两电极，该两电极按照预设的电压测量模式连接至除上述两个微型金属电极之外的另两个微型金属电极上，用于测量所述测量阱内的样品在上述驱动电流的激励下，在该两个微型金属电极所产生的电压。阻抗图像重构模块，用于根据由多个电流驱动模式与电压测量模式的组合而获得的微型金属电极的电压，对阻抗分析区域内的样品进行阻抗图像重构。电流驱动模式有相邻、交叉、相对驱动模式，采用的电压测量模式为测量除激励电极之外的其他相邻电极的电压。
[0041]至此，本实施例细胞阻抗分析仪器介绍完毕。依照本实施例的说明，结合自身的专业知识，本领域技术人员应当能够对本发明细胞阻抗分析仪器具有清楚的认识。
[0042]此外，需要说明的是，上述对各元件的定义并不仅限于实施方式中提到的各种具体结构或形状，本领域的普通技术人员可对其进行简单地熟知地替换，例如:对于特定形状的细胞可以设计相应的样品阱结构和电极排布的方式等。
[0043]综上所述，本发明根据细胞的不同生理状态具有不同的电阻抗特性这一物理现象，通过对样品施加一个安全恒定的电压或电流，通过测量电极测量样品表面的电流或电压的来重建内部的电阻抗分布图像，从而通过图像直观全面的反应出样品的生物信息。
[0044]以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种细胞阻抗分析芯片，其特征在于，包括: 绝缘基片，其中央位置定义为阻抗分析区域； 微型金属电极阵列，形成于所述绝缘基片上，包括彼此绝缘的N个微型金属电极，该N个微型金属电极呈辐射状均匀分布在所述阻抗分析区域的圆周上，每一微型金属电极内侧的敏感部伸入所述阻抗分析区域内，其中N≥4 ; 绝缘保护层，覆盖于除阻抗分析区域及所述微型金属电极上所述内侧敏感部和外侧引线部之外的其他区域；以及 测量阱，形成于所述阻抗分析区域的四周绝缘保护层上，在该阻抗分析区域的上方形成容置待分析样品的容置区，该容置区的内半径等于或略大于所述阻抗分析区域半径。
2.根据权利要求1所述的细胞阻抗分析芯片，其特征在于，还包括: 样品盖，固定于所述测量阱外侧的绝缘保护层上，其高度高于该测量阱的高度，以将所述待分析样品容置区与外界环境隔离。
3.根据权利要求2所述的细胞阻抗分析芯片，其特征在于，所述样品盖的材料为聚酰亚胺、PDMS，其为中空构造，内部存储缓冲液 。
4.根据权利要求1所述的细胞阻抗分析芯片，其特征在于，所述N个微型金属电极中，各微型金属电极的大小、形状相同，且微型电极之间的电极间距相同，电极顶端线宽与电极间距线宽相同。
5.根据权利要求4所述的细胞阻抗分析芯片，其特征在于，所述微型金属电极内侧敏感部的顶端形状呈线形或者弧线形，均匀、对称地分布于中心圆形阻抗分析区域上。
6.根据权利要求1所述的细胞阻抗分析芯片，其特征在于，所述阻抗分析区域为圆形，其半径为50 ii m ; 所述微型金属电极伸入阻抗分析区域内的长度约为2-10 y m ; 所述绝缘保护层在所述阻抗分析区域的外围形成圆环，其半径为55 y m ;所述测量阱的讲内半径为60 V- m,讲外半径为600 V- m。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞阻抗分析芯片，其特征在于，所述绝缘基片为玻璃片、ITO玻璃或表面沉积氮化硅的硅片。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞阻抗分析芯片，其特征在于，所述绝缘保护层的材料为氮化硅、聚酰亚或聚二甲基硅氧烷； 所述测量阱的材料为SU-8光刻胶、聚酰亚胺、聚二甲基硅氧烷。
9.一种包括权利要求1至8中任一项所述细胞阻抗分析芯片的细胞阻抗分析仪器，其特征在于，还包括:驱动电流模块、测量电压模块及阻抗图像重构模块；其中， 驱动电流模块具有两电极，该两电极按照预设的电流驱动模块连接至N个微型金属电极中的两个微型金属电极上，用于向测量阱内的样品输入驱动电流； 测量电压模块具有两电极，该两电极按照预设的电压测量模式连接至除上述两个微型金属电极之外的另两个微型金属电极上，用于测量所述测量阱内的样品在上述驱动电流的激励下，在该两个微型金属电极所产生的电压； 阻抗图像重构模块，用于根据由多个电流驱动模式与电压测量模式的组合而获得的微型金属电极的电压，对阻抗分析区域内的样品进行阻抗图像重构。
10.根据权利要求9所述的细胞阻抗分析仪器，其特征在于，所述电流驱动模式有相邻、交叉、相对驱动模式，所述电压测量模式为测量除激励电极之外的其他相邻电极的电压。`
【文档编号】G01N27/02GK103630579SQ201310061079
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年2月27日 优先权日:2013年2月27日
【发明者】赵湛, 谭静, 方震 申请人:中国科学院电子学研究所