一种氢溴酸高乌甲素质量鉴定hplc检测技术的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高乌头提取物氢溴酸高乌甲素原料药质量鉴定的HPLC检测技术。该方法包括了原料药氢溴酸高乌甲素含量的HPLC检测和有关物质的HPLC检测。HPLC色谱系统条件如下:色谱柱:C18(5μ)；流动相：甲醇：0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液（72：28）V/V。缓冲溶液用三乙胺调PH值至(7.2~7.5)；流?速：0.8mL/min.；含量检测波长:254nm.（有关物质检测波长选用214nm）；柱?温:30℃；进样量:20μl；检测时长:30min.在该色谱条件下,各杂质峰与主峰均能良好分离;氢溴酸高乌甲素的检出限为0.32μg;氢溴酸高乌甲素在进样量0.68~5.440μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=1.0000)。本发明建立了以HPLC外标法检测高乌头提取物氢溴酸高乌甲素含量测定和相关生物碱测定的原料药质量检测标准，标准合理，HPLC系统色谱条件选择恰当，能将其实相关生物碱与高乌甲素实现完全分离，基线分离效果好，该方法简便快捷,准确实用,适用于高乌头提取物氢溴酸高乌甲素的质量控制。己得到国外客户的广泛认同。
【专利说明】[0001] 一种氢溴酸高乌甲素质量鉴定HPLC检测技术
【技术领域】： 植物提取技术、质量检测技术。
[0002]
【背景技术】： 氢溴酸高乌甲素是从毛菌科植物高乌头（Acenitum Simon- tanum Nali)根中提取的 总碱，经化学分离获得的一种有效成分为二廠类单体生物碱刺乌头碱（Lappaconitine) 的氢溴酸盐，药理及临床表明具有较强的镇痛及消肿、解热、局麻作用。其镇痛作用为氨基 比林的七倍，对恶性肿瘤疼痛及其他顽固性疼痛的疗效尤为显著。用于病人自控镇痛效果 优良率明显高于曲马多，且恶心、呕吐发生率减少。为国内首创的非依赖性镇痛药，是卫生 部《癌症病人三阶梯止痛疗法指导原则》中规定的中度镇痛药。
[0003] 氢溴酸高乌甲素原料药的质量控制国际上尚没有统一的标准，特别是在质量检测 方法上。含量测定有采用分光光度法进行的，有采用非水滴定法进行的，有采用HPLC内标 法进行的，这些方法检测结果都会出现较大的差异性。分光光度法、非水滴定法，严格意 义上说是检测高乌头类生物总碱，专属性很差，滴定法测定结果总是偏高。也有文献采用 HPLC内标法，内标法不够简便。其它相关生物碱杂质的检测大多采用TLC法测定，TLC 法操作繁杂，人为操作误差大，稳定性和专属性都较差。目前各国药典上尚未收录氢溴酸 高乌甲素原料药这个产品。我国氢溴酸高乌甲素原料的部颁标准中含量测定方法为非水 滴定法，滴定法的原理是用高氯酸与生物碱进行碱酸中和反应，以消耗酸的量来计算生物 碱的含量，所以，该方法就存在如下问题，跟高氯酸反应的生物碱不只是高乌甲素，其它生 物碱一样要与高氯酸发生反应，消耗高氯酸，这样，计算出来的应该是总生物碱，所以经常 会出现纯度越低含量越高的现象，比如纯度只有50%的高乌甲素(假设其中N-脱乙酰基 高乌甲素<N-deacetyllappaconitine>含量约50%)，采用非水滴定法检测，理论上计算的 结果就是113%。原因是N-脱乙酰基高乌甲素同样要消耗高氯酸，且克分子量比高乌甲素 少，计算的结果更偏高。如按卫生部标准"【含量测定】取本品约〇.2g，精密称定，加冰醋 酸20ml溶解，加醋酸汞试液5ml，加结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液（0. 05mol/L)滴 定，至溶液显蓝色，将滴定结果用空白试验校正。每lml的高氯酸滴定液（0. 05mol/L)相 当于33. 28mg的C32H44N208 · HBr"进行检测。"检测的结果数值误差较大，而且还不能说 明其含量就是高乌甲素的含量，在国际贸易中，对高乌甲素质量的检测经常出现一些争议。 部颁标准中其他生物碱采用薄层色谱（TLC)法测定。方法规定为"【检查】其他生物 碱取本品，加甲醇制成每lml中含4mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加甲醇 稀释成每lml中含0. 25mg的溶液，做为对照溶液。照薄层色谱法（中国药典1995年版 二部附录V B)试验，吸取上述溶液各2μ1，分别点于同一硅胶Η薄层板上，以乙腈一 水一磷酸（90:10:1.5)为展开剂，展开后，立即置于254nm波长紫外灯下观察，供试品溶液 如显杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较，不得更深。"应该方法作为定性鉴别尚可，用为 定量检测确是十分的不靠谱。国外客户根本不认同。乌兹别克斯坦的部颁标准，方法规定 为" ΟοπγτοτΒγιοι--ΗΘΕ?ικΕ?ιοΗΑΜ. 〇,〇2 r npenapaTa paCTBOpHIOT B 2 M J1 MeTHJTOBOrO C Π H p T a (pacTBop A). K 1 m jt pacTBopa A npH6aBJiiii〇T 9 m jt MeTHJioBoro c π η p τ a (pacTBop B ). K 1 m jt pacTBopa B npH6aBJiiii〇T 9 m jt μθτηιιοβογο c π h p t a (pacTBop B ) . K 1 m jt pacTBopa B npH6aBJiiii〇T 9 m jt μθτηιιοβογο c π h p t a (pacTBop Γ ) . H a jtmhmio c t a p t a njracTHHKH ?Merck? c cHJTHKarejreM 60 F254 h a ajrioMHHHeBOH h a η o c η τ μηκροπηπθτκοη h jt h MHKp〇ninpHIJ；OM B π e p B y ?ο τ ο Μ κ y 0，01 M JT (100 μ κ r ) pacTBopa A， bo b t o p y io _0,01mjt (10 μ k r ) pacTBopa B， B τ p e τ t ?ο 〇,〇3 m jt (3 μ κ r ) pacTBopa B η b MeTBepTyio -0,05 mjt (0，5 μ κ r ) pacTBopa Γ. njiacTHHKy BticyniMBaioT h a b o 3 a y x e b t e m e η h e 10 mmh， 3 a t e m n〇Mem：ai〇T B κ a m e p y c o cBe5KenpHr〇T〇BJTeHH〇H c m e c L· io pacTBopHTejreH χποροφορΜ - 6 e h 3 o jt - (10:40:3). Φ p ο η τ pacTBopHTejreH π p ο η τ h A〇 κ ο h u; a njracTHHKH. njiacTHHKy c y m a τ h a B〇3Ayxe b t e m e η h e 10 mmh， a 3 a τ e m b ογπ?Η--ΒΗΟΜ in κ a φ y π p h t01100 C b τ e m e η h e 15 mmh. njiacTHHKy npocMaTpHBaioT b ΥΦ-οβθτθ π p h A jt η h e b o jt h t,i 254 η m . H a xp〇MaT〇rpaMMe h 3 Τ Ο M e K 1， 2， 3， 4 ^ 0 JT )K Η Ο ΠρΟΗΒΗΤΒΟ?Ι OCHOBHOe πητηο Φηοιιθτοβογο u; b e t a (jt a nna kohhthh, Rf =0，38 Ha xp〇MaT〇rpaMMe h 3 τ ο μ κ η 1 πομμμο ochobhoto π η τ h a ( c Rf =0, 38) npoHBJiiieTCii c jt a 6 0 OKpanieHHoe πητηο Φηοιιθτοβογο u; b e t a (jreHKOHHH, Rf =0, 45), π η τ h 0 rojiydoro cBeHenMH (N- AesaiieTHJTJiannaKOHHTHH, Rf = 0, 32. η π η τ h 0 Φηοιιθτοβογο u; b e t a (N~ aiieTHJicenaKOHHTHH, Rf =0, 27)， AonycKaeTCH πητηο Φηοιιθτοβογο u; b e t a (paHaKOHHTHH, Rf =0, 23). H a c τ a p τ e AonycKaeTCH c jt a 6 0 OKpanieHHoe πητηο Φηοιιθτοβογο u; b e t a . Ha xp〇MaT〇rpaMMe h 3 τ ο μ κ h 2 πομμμο ochobhoto π η τ h a ( c Rf =0, 38) npoHBJiiiiOTCii c jt a 6 0 OKpanieHHoe π η τ h 0 r〇jry6oro cBeMeHHii (N- AesaiieTHJTJiannaKOHHTHH, Rf =0，32) η π η τ h 0 Φηοιιθτοβογο u; b e t a (N~ aiieTHJicenaKOHHTHH, Rf =0, 27). flonycKaeTCH c jt a 6 o oKpanieHHoe πητηο Φηοιιθτοβογο u; b e t a (paHaKOHHTHH, Rf =0, 23). H a xp〇MaT〇rpaMMe h 3 τ ο μ κ h 3 πομμμο ochobhoto π η t h a ( c Rf =0, 38) μ ο )k e τ προ--Β----ΤΒΟ-- c jt a 6 ο OKpanieHHoe π η τ η o r〇jry6oro cBeMeHHii (N- Ae 3 aiieTHJTJiannaKOHHTHH, Rf = 〇, 3 2). H a Xp〇MaT〇rpaMMe H 3 ΤΟΠΙΚΗ 4 Α0·Π^ΚΗ0 ΠρΟΗΒΗΤΒΟ?Ι τ o jt L· κ ο ο a η ο c jt a 6 ο OKpanieHHoe π η τ η ο Φηοιιθτοβογο u; β e τ a (jrannaKOHHTHH c Rf =0, 38) · Xp〇MaT〇rpaMMa cMHTaeTCii AOCTOBepHOH， e c jt h BtinojiHiiiOTCii Tpe6〇BaHHii τ e c τ a ?IIpoBepKa πρηγοαηοοτη xpoMaTorpat^MHecicoH c h c τ e m h IIpHMeMaHHe： 1. Ha xp〇MaT〇rpaMMe h 3 τ ο μ κ η 1 AonycKaeTCH π η τ η ο h a c τ a p τ e , κ ο τ ο p o e cBMAeTejitcTByeT o neperpy3Ke njracTHHKH π p h HaHeceHHH 100 μ κ r npenapaTa. 2. IIpoBepKanpMroAHOCTMxpoMaTorpacfcMHecK OHCHCTeML·!. Xp〇MaT〇rpa(i)MHecKaii c h c τ e m a cMHTaeTCii πρΜΓΟΑΗΟΗ， e c jt h Ha6jii〇AaeTCii M e τ κ o e A e jt e η h e π η τ e h conyTCTByiomHx ajiKanoM^oB; 3 ο h a JiannaKOHHTHHa h a xp〇MaT〇rpaMMe η m e e τ Rf H e M e H e e 0.3"。检测过程十分繁杂，且人为操作误差很大，检测结果会因人而 异，稳定性、试验重现性较差，而且是一种较落后的检测技术。国内有许多文献报道了采用 HPLC法测定氢溴酸高乌甲素含量，各家采用的色谱系统条件五花八门，特别是在流动相的 选择上或不尽合理，或基于保密而未完全公示。大多情况都是分离效果较差，不能将所有生 物碱做基线分离，特别是不能将高乌甲素和脱乙酰基高乌甲素分离开，使这两种成分的检 测峰重叠在一起而误认为是高乌甲素一种成分，致使检测结果与非水滴定法检测结果出现 较大的误差。
[0004] 本发明的目的是建立一种高效液相色谱（HPLC)法快捷、高效测定高乌甲素原料 药中高乌甲素含量和有关物质，以便更好地对氢溴酸高乌甲素原料生产进行质量控制。
[0005] 本发明建立了以HPLC外标法检测的氢嗅酸高乌甲素含量测定和相关生物碱测定 的原料药质量检测标准，标准合理，HPLC系统色谱条件选择恰当，能将其实相关生物碱与高 乌甲素实现完全分离，基线分离效果好，检测方法快捷、稳定而准确，己得到国外客户的广 泛认同。
[0006] 本发明的主要内容： 1、选择一特定的HPLC色谱系统条件(特别是流动相)，能对氢溴酸高乌甲素原料药中的 所有生物碱作基线分离，采用HPLC外标法计算，能快捷、稳定、准确的测定原料药高乌甲素 含量。
[0007] 色谱系统条件（Chromatographic System): 色谱柱（Column) : C18 (5μ). 流动相（Mobile phase):甲醇：0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液（72 :28)V/V。缓冲溶 液用三乙胺调PH值至（7. 2?7. 5)。
[0008] 流速：Flow rate: 0. 8mL/min. 波长（Wave length) : 2δ4 nm. 柱温（Column temperature) : room temperature. 进样量（Injection volume) : 20 μ1· 检测时长（Time of analysis) : 30 min. 2、建立相关生物碱的质量控制标准及HPLC检测方法。 「00091 纯度为99%的产品，相关牛物碱杂质的捽制标准事下表。
【权利要求】
1. 一种氢溴酸高乌甲素质量鉴定HPLC检测技术，其特征在于：HPLC检测色谱系统 条件的选择，该方法适用于高乌头提取物氢溴酸高乌甲素原料药氢溴酸高乌甲素含量的 HPLC测定和有关物质的HPLC检测分析，HPLC色谱系统条件如下：色谱柱：C18 (5μ);流 动相：甲醇：〇.〇5mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液（72 :28)V/V，缓冲溶液用三乙胺调ΡΗ值至 (7. 2?7· 5);流速：0· 8mL/min.;含量检测波长：254 nm.(有关物质检测波长选用214nm) 柱温：30°C;进样量：20 μ?;检测时长：30 min.(有关物质检测时长3倍主峰时间）。
2. 根据权利要求1所述的方法，流动相的PH值范围为6. (Γ8. 0,优选7. 2~7. 5。
3. 纯度99%规格的氧漠酸1?乌甲素原料药有关有物(相关生物喊)的质量控制标准，按 HPLC外标法检测，知名杂质N-脱乙酰基高乌甲素含量不得高于0. 2%，7-羟基高乌甲素含量 不得高于〇. 4%，未知名杂质单个杂质峰含量不高于0. 2%，总杂质不得高1. 0%。
4. 纯度98%规格的氧漠酸1?乌甲素原料药有关有物(相关生物喊）的质量控制标准， 按HPLC外标法检测，以知名杂质N-脱乙酰基高乌甲素作分离度鉴定，N-脱乙酰基高乌甲 素与氢溴酸高乌甲素能达到有效分离，原料中单个杂质含量不得高于1. 〇%，总杂质不得高 2. 0%。
【文档编号】G01N30/88GK104111299SQ201310133585
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年4月17日 优先权日:2013年4月17日
【发明者】欧阳水, 刘毛东, 南田田 申请人:长沙富能生物技术有限公司