专利名称：一种测定虎杖中白藜芦醇含量的高效液相色谱方法
技术领域：
本发明涉及一种虎杖中白藜芦醇含量的高效液相色谱测定方法。
背景技术：
白藜芦醇(Resveratrol)是植物体内产生的天然二苯乙烯类多酚物质(结构式见附图1)，分子式为C14H12O3，化学名为3，4'，5_三羟基芪，白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物质，又称为芪三酚。白藜芦醇存在于虎杖、葡萄等植物中，虎杖中白藜芦醇的含量远远高于葡萄等其他植物。随着对白藜芦醇研究的深入，其广泛的药理作用逐渐被发现，如抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗衰老及免疫调节等，他还能减轻多种因素造成的组织器官损伤及保护肝细胞的作用。白藜芦醇在心血管系统方面的作用包括抗氧化、清除自由基作用、抑制血小板聚集、抗细胞凋亡、调节血脂、防止动脉粥样硬化及预防癌症等多种药理作用。美国农业部的研究结果表明，白藜芦醇对激素依赖性肿瘤有明显的预防作用，还可对骨质疏松、痤疮及老年痴呆症有预防作用，对人体内部一种单体抗衰老酶起作用，进而发挥预防各种年龄相关疾病、延长预期寿命的潜在作用。
20世纪90年代以来，国外对葡萄酒中白藜芦醇的保健作用、检测方法进行了大量研究，国内尚未见到对虎杖中白藜芦醇含量测定的报道，而在本发明的样品浓度与峰面积线性关系中，白藜芦醇的浓度范围最小可至IOii g/ml，最大可达IOOOii g/ml，线性关系中浓度范围较大；本发明还具有分离效果好，测定准确，灵敏度高，分析简便快速等技术特点，可见，目前建立稳定的HPLC检测虎杖中白藜芦醇含量的方法非常关键，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、分离效果好、灵敏度高、精密度和准确性更高的白藜芦醇含量检测方法。为达上述目的，本发明采用了如下技术方案:本发明选用流动相中甲醇的体积百分比由80%递减至50%，优选甲醇体积分数为55% ;超纯水的体积百分比由20%递增至50%，优选超纯水的体积分数为45%。本发明HPLC方法中，其特点在于选用上述的流动相，按上述流动相所得白藜芦醇样品图谱有较好的峰形(图谱见附图2)和分离效果。本发明HPLC分析方法进样量为5 yl，利用标准品溶液多次进样来进行进样精密度试验，进样次数为6次，RSD值为0.02%，进样精密度非常好。
图1为白藜芦醇结构式图2为本发明白藜芦醇HPLC检测图谱图3为白藜芦醇标样浓度与峰面积线性关系图4为白藜芦醇室内放置不同时间吸光度的变化
图5为白藜芦醇在不同温度下吸光度变化
具体实施例方式在下面的实施例中进一步说明本发明的详细分析方法，但本发明并不局限于下述详细分析方法。实施例1白藜芦醇含量测定的高效液相色谱方法-1色谱条件:采用美国Agilent-1260高效液相色谱仪，Chemstation Edition色谱
工作站色谱柱:ThermoBDS-C18 (250mmX 4.6mm, 5 u m)流动相:甲醇:水=55: 45 (体积比)
检测温度:30°C检测器:紫外检测器检测波长:306nm真空泵:SHB_m循环水式真空泵电子天平:梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司提供，规格为十万分之一流动相的制备:流动相按照甲醇:水=55: 45 (体积比)混合，0.2 U m孔径过滤器过滤，SCQ-250W超声波超声脱气。采用外标法，需要分别对标准品和待测样品溶液进行测定。标准品溶液制备:精密称取50mg白藜芦醇标准品，置于50ml棕色容量瓶中，加少量流动相超声5seC0nds使样品完全溶解后再用流动相稀释定容至刻度线，作为储备液，再精密量取储备液1ml，置于IOml的棕色容量瓶中，加流动相定容至刻度。待测样品制备:精密称取与标准品同等重量的待测样品，置于50ml棕色容量瓶中，加少量流动相超声5seC0nds使样品完全溶解后再用流动相稀释定容至刻度线。再精密量取1ml，溶液置于IOml的棕色容量瓶中，加流动相定容至刻度。根据含量计算公式:
内藜芦醇含量(％、=待测!样品峰面f只X彳寺测样品'浓度 ° ~标准品峰面积X标准品浓度带入数据即可得到白藜芦醇含量。以上标准品与待测样品均配制3份，绝对误差不超过0.2%。实施例2白藜芦醇含量测定的高效液相色谱方法-2色谱条件:采用美国LabAlliance高效液相色谱仪，EZChrom Elite Client色谱工作站色谱柱:SMT-SAM-C18(250mm X 4.6mm，5 y m)流动相:甲醇:水=55: 45 (体积比)检测温度:30°C检测器:SPECTRASTSTEM, UV6000LP 紫外检测器
检测波长:306nm真空泵:SHB_m循环水式真空泵电子天平:梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司提供，规格为十万分之一流动相的制备:流动相按照甲醇:水=60: 40 (体积比)混合，0.2um孔径过滤器过滤，SCQ-250W超声波超声脱气。采用外标法，需要分别对标准品和待测样品溶液进行测定。标准品溶液制备:精密称取50mg标准品，置于50ml棕色容量瓶中，加少量甲醇超声5seC0nds使样品完全溶解后再用流动相稀释定容至刻度线，作为储备液，再精密量取储备液1ml，置于IOml的棕色容量瓶中，加流动相定容至刻度。待测样品制备:精密称取与标准品同等重量的待测样品，置于50ml棕色容量瓶中，加少量甲醇超声5seC0nds使样品完全溶解后再用流动相稀释定容至刻度线。再精密量取1ml，溶液置于IOml棕色的容量瓶中，加流动相定容至刻度。根据含量计算公式:
白薬芦醇含量=待测样品峰面积X待测样品浓度 ° 标准品峰面积X标准品浓度带入数据即可得到白藜芦醇含量。以上标准品与待测样 品均配制3份，绝对误差不超过0.2%。实施例3白藜芦醇含量测定的高效液相色谱方法-3色谱条件:采用美国Agilent-1260高效液相色谱仪，Chemstation Edition色谱
工作站色谱柱:ThermoBDS-C18 (250mmX 4.6mm, 5 u m)流动相:甲醇:水=55: 45 (体积比)检测温度:30°C检测器:紫外检测器检测波长:306nm真空泵:SHB_m循环水式真空泵电子天平:梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司提供，规格为十万分之一流动相的制备:流动相按照乙腈:水=52: 48 (体积比)混合，0.2um孔径过滤器过滤，SCQ-250W超声波超声脱气。采用外标法，需要分别对标准品和待测样品溶液进行测定。标准品溶液制备:精密称取50mg标准品，置于50ml棕色容量瓶中，加少量甲醇超声5seC0nds使样品完全溶解后再用流动相稀释定容至刻度线，作为储备液，再精密量取储备液1ml，置于IOml棕色的容量瓶中，加流动相定容至刻度。待测样品制备:精密称取与标准品同等重量的待测样品，置于50ml棕色容量瓶中，加少量甲醇超声5seC0nds使样品完全溶解后再用流动相稀释定容至刻度线。再精密量取1ml，溶液置于IOml棕色的容量瓶中，加流动相定容至刻度。根据含量计算公式:
权利要求
1.一种虎杖中白藜芦醇含量测定的高效液相色谱(HPLC)方法，其特征在于流动相为甲醇与水的混合溶液，其中选择甲醇的体积分数分别为80^^65%和50%，水的体积分数分别为20^^35%和50%，最后优选出峰时间和峰型最好的甲醇体积分数55%，水体积分数45%作为系统检测的流动相。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充物的反相色谱柱。
3.如权利要求1所述的方法，使用紫外检测器，检测波长为306nm，柱温30°C，流速为0.8ml/min,进样体积为5 y I。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于配制的样品溶液浓度为lmg/ml。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于本HPLC法采用外标法进行白藜芦醇的含量测定，浓度与峰面 积线性关系中浓度范围为6 ii g 200ii g/ml。
全文摘要
本发明公开了一种虎杖中自藜芦醇含量的高效液相色谱测定方法，色谱柱Thermo BDS-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相甲醇∶水＝55∶45(体积比)；检测温度30℃；进样量5μl；流速0.8ml/min；检测器紫外检测器；检测波长306nm。白藜芦醇在10μg/ml～200μg/ml浓度范围内与峰面积呈良好线性关系，线性相关系数r＝1。高效液相色谱法检测白藜芦醇含量的方法，具有分离效果好，精确度好，灵敏度高，分析简便快速等技术特点。
文档编号G01N30/26GK103235070SQ20131017597
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月14日 优先权日2013年5月14日
发明者彭学东, 张梅, 赵金召, 杨艳丽 申请人:张家港威胜生物医药有限公司