测量氨基酸-N-甲酸酐中氯离子含量的方法技术领域本发明涉及制备可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液，以及测量N-羧基酸酐中氯离子含量的方法。本发明还涉及制备具有高纯度N-羧基酸酐的方法，以及制备得到的具有高纯度N-羧基酸酐。此外，本发明还涉及制备具有高纯度多肽混合物的方法，以及由此制备得到的多肽混合物，尤其地，多肽混合物是醋酸格拉替雷。
背景技术：
氨基酸N-羧基酸酐（即，下文中表示为“N-羧基酸酐”或“氨基酸NCA”）是3-取代噁唑啉-2,5-二酮，如下所示：由于从α-、β-、γ-氨基酸中得到的N-羧基酸酐（缩写为NCA）的酸性功能基团的活化可使得其成为具有反应性的化合物。这是因为N-羧基酸酐使得该酸性功能性基团与任何亲核本体的反应成为可能。因此，使得通过与胺功能基团反应进行酰胺功能基团制备得到简化。由此，N-羧基酸酐通常用于合成多肽。此外，N-羧基酸酐与醇反应液容易形成酯键。有几个已知方法可用于制备N-羧基酸酐，例如US6656458，US4267344和US6479665。最普通和最直接的方法是将氨基酸或其盐酸盐与光气、双光气或三光气在溶剂介质中反应。与光气的反应如下图所示：其中，R表示α-、β-、γ-氨基酸的主要游离基，R’表示氢原子或氨基酸的仲氨基的游离基，R’可以与R形成环。已知，在合成N-羧基酸酐过程中除了N-羧基酸酐外，还形成了大量盐酸气，也就是说每摩尔的N-羧基酸酐生产2mol盐酸气。盐酸气是具有高反应性的，在介质中，盐酸气的存在将可能导致副反应和氯化副产物的出现。从质量和产量方面，残留在N-羧基酸酐中的氯化杂质是绝对不希望的。由于残留在N-羧基酸酐中盐酸气的存在，会严重干扰N-羧基酸酐的聚合反应。为了聚合能顺利进行，需要在N-羧基酸酐单体中存在的氯离子含量足够低。因此，可游离氯的含量通常需要小于0.05wt%。很多类型的多肽混合物，例如醋酸格拉替雷，是通过氨基酸的N-羧基酸酐进行聚合而制备得到。例如，醋酸格拉替雷(GA，也称为共聚物-1，Cop-1或，CASNo.147245-92-9)，它通过四种氨基酸（L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸-γ-苄酯、L-ε-三氟乙酰基-赖氨酸）的N-羧基酸酐（NCA）进行随机聚合而制备的多肽混合物，具有如下结构式：(Glu,Ala,Lys,Tyr)xXCH3COOH(C5H9NO4·C3H7MO2·C6H14N202·C9H11NO3)x'XC2H4O2醋酸格拉替雷是一种用于治疗多发性硬化症的人工合成多肽混合物（M.M.Mouradain,Pharmacology&Therapeutics,98,245-255,2003）。具体请参见physician′sDeskReference,ThomsonPDR,Montvale,NewJersey,第3297页(2007)。醋酸格拉替雷的氨基酸摩尔比大约是0.392-0.462:0.129-0.153:0.300-0.374:0.086-0.100，平均分子量大约5000-9000道尔顿。本发明发明人发现，由N-羧基酸酐制备多肽混合物（如，醋酸格拉替雷）时，N-羧基酸酐的品质，尤其是游离氯离子含量，对于聚合反应和产物的品质影响很大。特别地，如果N-羧基酸酐不能达到应有规格，醋酸格拉替雷的平均分子量和氨基酸组成都会达不到应有的范围：醋酸格拉替雷的氨基酸摩尔比大约是0.392-0.462:0.129-0.153:0.300-0.374:0.086-0.100，平均分子量大约5000-9000道尔顿。为了使制备的多肽混合物（如，醋酸格拉替雷）可以达到产品相应的要求，本发明发明人发现，N-羧基酸酐优选纯度≥99.5%，氯离子<0.01%，游离氨基酸含量<0.01%。由于N-羧基酸酐中的氯离子含量是一种重要因素，其影响氨基酸N-羧基酸酐质量，进而影响多肽混合物品质。但是，N-羧基酸酐对水和醇类非常不稳定，会聚合成不溶于水的聚合物。而由于聚合物的水溶性非常差，直接影响了对氯离子定量检测的准确性。本领域需要获得关于N-羧基酸酐的氯离子含量的有效且精确的检测方法以及可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液。
技术实现要素：
本发明一个目的是，提供可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液，以及测量N-羧基酸酐中氯离子含量的方法。本发明另一目的是，提供制备具有高纯度N-羧基酸酐的方法，以及制备得到的具有高纯度N-羧基酸酐。此外，本发明还有另一目的是，提供涉及制备具有高纯度多肽混合物的方法，以及由此制备得到的多肽混合物，尤其地，多肽混合物是醋酸格拉替雷。本发明可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液，其由包括下述步骤的方法制备：1.将N-羧基酸酐溶于一种或多种溶剂中，其中该溶剂为基本无水溶剂，2.使用水解试剂水解溶于溶剂中的N-羧基酸酐，得到可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液。本发明测量N-羧基酸酐中氯离子含量的方法，其包括下述步骤：1.制备可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液，其包括：（a）将N-羧基酸酐溶于一种或多种溶剂中，其中该溶剂为基本无水溶剂，（b）使用水解试剂水解溶于溶剂中的N-羧基酸酐，得到可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液。2.测量上述得到的N-羧基酸酐中氯离子含量。本发明制备具有高纯度N-羧基酸酐的方法，其包括常规本领域技术人员已知使用的制备具有高纯度N-羧基酸酐的方法，其进一步包括下述步骤：-如下检测得到的N-羧基酸酐中氯离子含量；(1).制备可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液，其包括：（a）将N-羧基酸酐溶于一种或多种溶剂中，（b）使用水解试剂水解溶于溶剂中的N-羧基酸酐，得到可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液。(2).测量上述得到的N-羧基酸酐中氯离子含量；当氯离子含量大于0.05wt%，优选大于0.01wt%时，则进行下一步纯化步骤。上述方法中溶剂为基本无水溶剂，而且不包含醇，例如：-与水混溶的溶剂，尤其是选自二甲基亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺和环丁砜、二氧六环、四氢呋喃(THF)、丙酮、乙腈以及羧酸如甲酸、乙酸等；-离子液体，例如烷基化咪唑的液体盐。由上述制备得到的具有高纯度N-羧基酸酐也属于本发明的发明范围。此外，本发明提供制备具有高纯度多肽混合物的方法，其包括常规本领域技术人员已知使用的制备多肽混合物的方法，其进一步包括下述步骤：-如下检测原料N-羧基酸酐中氯离子含量，当氯离子含量大于0.05wt%，优选大于0.01wt%时，则进行下一步纯化步骤；(1).制备可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液，其包括：（a）将N-羧基酸酐溶于一种或多种溶剂中，（b）使用水解试剂水解溶于溶剂中的N-羧基酸酐，得到可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液。（2）检测原料N-羧基酸酐中氯离子含量。在上述方法中溶剂为基本无水溶剂，而且不包含醇，例如：-与水混溶的溶剂，尤其是选自二甲基亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺和环丁砜、二氧六环、四氢呋喃(THF)、丙酮、乙腈以及羧酸如甲酸、乙酸等；-离子液体，例如烷基化咪唑的液体盐。(2).测量上述得到的N-羧基酸酐中氯离子含量。本发明还涉及由此制备得到的多肽混合物，尤其地，醋酸格拉替雷也属于本发明的发明范围。为了使制备的多肽混合物（如，醋酸格拉替雷）可以达到产品相应的要求，本发明发明人发现，原料N-羧基酸酐优选纯度≥99.5%，氯离子<0.01%，游离氨基酸含量<0.01%。本发明中所使用的纯化步骤可以使用本领域公知的常规方法，如重结晶、活性炭吸附、通过填充柱等提纯方法。可用于本发明的测量氯离子含量的方法很多，本领域技术人员所知的方法均可以在本发明中使用，例如色谱法例如柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法等等；硝酸银比浊法；分光光度法；摩尔法-铬酸钾作指示剂；法扬司法-荧光黄作指示剂；佛尔加德法-间接滴定；电位滴定法等等。在上述方法中，优选，在惰性气体保护下，将N-羧基酸酐溶于一种或多种溶剂中。惰性气体可以是氮、氩、氦、氖、氩、氪、氙、氡等。在本发明中，基本无水溶剂是指溶剂中含的水量小于10wt%，特别地小于5wt%，优选小于3%，优选小于1%。在本发明中，使用可以使得N-羧基酸酐水解的物质进行水解。例如使用水解试剂如水或碱水溶液进行水解，优选水或氢氧化钠水溶液。其中，水不包含影响氯离子测量的水，即不含氯离子的水，优选去离子水。在本发明中，水解溶于溶剂中的N-羧基酸酐的过程中，水解试剂如水或碱水溶液的使用量是：0.1-50mL/mgN-羧基酸酐，优选1-30mL/mgN-羧基酸酐，尤其1-20mL/mgN-羧基酸酐，更优选1-10mL/mgN-羧基酸酐。根据本发明方法，可以将N-羧基酸酐破坏成水溶性好的水溶液，然后利用各种技术精确地测量N-羧基酸酐的氯离子含量。本发明精确检测N-羧基酸酐的氯离子含量的方法不会因为产生聚合物包裹问题造成氯离子检测结果不准。为了本发明的目的，表述“氨基酸”应理解为是指包含至少一个NR1R2基团以及至少一个羧基基团的任何化合物，其中R1和R2是任何可以形成氨基酸的基团，例如氢、烷基、芳基，或R1和R2形成环状基团。本发明的氨基酸可以是天然或合成来源的。除甘氨酸外，天然氨基酸都含有手性碳原子。使用天然或非天然的氨基酸都是有可能的。氨基酸可以具有D或L构型。本发明中，N-羧基酸酐例如为，肌氨酸N-羧基酸酐、苏氨酸N-羧基酸酐、丝氨酸N-羧基酸酐、缬氨酸N-羧基酸酐、正缬氨酸N-羧基酸酐、异亮氨酸N-羧基酸酐、亮氨酸N-羧基酸酐、正亮氨酸N-羧基酸酐、赖氨酸N-羧基酸酐、苯丙氨酸N-羧基酸酐、酪氨酸N-羧基酸酐、丙氨酸N-羧基酸酐、脯氨酸N-羧基酸酐、色氨酸N-羧基酸酐、蛋氨酸N-羧基酸酐、甘氨酸N-羧基酸酐、丝氨酸N-羧基酸酐、半胱氨酸N-羧基酸酐、精氨酸N-羧基酸酐、组氨酸N-羧基酸酐、色氨酸N-羧基酸酐、甲硫氨酸N-羧基酸酐、天冬氨酸N-羧基酸酐和谷氨酸N-羧基酸酐、谷氨酸-γ-苄酯N-羧基酸酐、ε-三氟乙酰基-赖氨酸N-羧基酸酐等等。可以使用的氨基酸的残基根据以下3个字母的代码缩写：丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)，具有亲核侧链的氨基酸有利的是在根据本发明的方法中使用它们之前在侧链上加以保护。表述“保护基”应理解为是指任何类型的基团，它阻止与其相连的原子或基团(例如氧原子或氮原子)在合成过程中参与所不希望的反应。这些保护基包括侧链保护基以及保护C-或N-末端的基团，统称为胺保护基和酸保护基。作为胺保护基的非穷尽的例子，可以提及特别是苯甲酰基(Bz)、乙酰基(Ac)、三氟乙酰基(Tfa)、苄氧羰基(Z)、对氯苄氧羰基(2ClZ)、对溴苄氧羰基(2BrZ)、对硝基苄氧羰基、二苯甲氧基苄氧羰基、二苯甲氧羰基、9-芴甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苯磺酰基、对甲苯磺酰基或2-硝基苯磺酰基。作为酸保护基的非穷尽的例子，可以提及烷基、芳基、芳烷基、甲硅烷基类型，如甲氧基甲基、甲基硫代甲基、2，2，2-三氯乙基、2-卤代乙基、2-(三甲基硅烷基)-乙基、叔丁基、芳基、烷基、芳烷基、烯丙基、苯基、三苯甲基(trityl)、二苯甲基、对硝基苄基、对甲氧苄基以及三烷基甲硅烷基的基团，如三甲基硅醚类、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、或异丙基二甲基甲硅烷基。为了本发明的目的，术语“肽”指一种聚合物，在该聚合物中的单体是通过酰胺类型的共价键连接在一起的氨基酸。肽包含至少两个氨基酸。优选地，肽链中的氨基酸的数目大于或等于3。肽链经常包含最多100个氨基酸。优选地，肽链中氨基酸的数目少于或等于20。特别优选地，肽链中氨基酸的数目少于或等于15。为了本发明的目的，术语“多肽”指α－氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由10-100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽。为了本发明的目的，术语“高纯度N-羧基酸酐”是指N-羧基酸酐纯度≥99.5%，氯离子<0.01%，游离氨基酸含量<0.01%。为了本发明的目的，术语“高纯度多肽混合物”是指由原料高纯度N-羧基酸酐（纯度≥99.5%，氯离子<0.01%，游离氨基酸含量<0.01%）制备得到的多肽混合物。在本发明中，缩写“NCA”表示氨基酸N-羧酸酐。本发明还涉及下述技术方案：1.测量N-羧基酸酐中氯离子含量的方法，其包括下述步骤：（1）.制备可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液，其包括：（a）将N-羧基酸酐溶于一种或多种基本无水溶剂中，（b）使用水解试剂水解溶于溶剂中的N-羧基酸酐，（c）得到可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液，（2）.测量上述得到的N-羧基酸酐中氯离子含量。2.根据技术方案1的方法，其中基本无水溶剂选自如下：-与水混溶的溶剂，其中，溶剂优选选自二甲基亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺和环丁砜、二氧六环、四氢呋喃(THF)、丙酮、乙腈以及羧酸如甲酸、乙酸；和/或-离子液体，例如烷基化咪唑的液体盐。3.根据上述技术方案任一项的方法，其中,在惰性气体保护下，将N-羧基酸酐溶于一种或多种基本无水溶剂中。4.根据上述技术方案任一项的方法，其中,使用水解试剂如水或碱水溶液进行水解，优选水或氢氧化钠水溶液，尤其地，去离子水。5.根据上述技术方案任一项的方法，其中，水解溶于溶剂中的N-羧基酸酐的过程中，水解试剂如水或碱水溶液的使用量是0.1-10mL/mgN-羧基酸酐。6.可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液，其由包括下述步骤的方法制备：（a）将N-羧基酸酐溶于一种或多种基本无水溶剂中，（b）使用水解试剂水解溶于溶剂中的N-羧基酸酐。7.根据技术方案6的方法，其中基本无水溶剂选自如下：-与水混溶的溶剂，其中，溶剂优选选自二甲基亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺和环丁砜、二氧六环、四氢呋喃(THF)、丙酮、乙腈以及羧酸如甲酸、乙酸；和/或-离子液体，例如烷基化咪唑的液体盐。8.根据上述技术方案6-7任一项的方法，其中,在惰性气体保护下，将N-羧基酸酐溶于一种或多种基本无水溶剂中。9.根据上述技术方案6-8任一项的方法，其中,使用水解试剂如水或碱水溶液进行水解，优选水或氢氧化钠水溶液，尤其地，去离子水。10.根据上述技术方案6-9任一项的方法，其中,水解溶于溶剂中的N-羧基酸酐的过程中，水解试剂如水或碱水溶液的使用量是0.1-10mL/mgN-羧基酸酐。11.制备N-羧基酸酐的方法，其包括下述步骤：A.如下选择N-羧基酸酐，其中氯离子含量大于0.05wt%，优选大于0.01wt%：-检测得到的N-羧基酸酐中氯离子含量；(1).制备可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液，其包括：（a）将N-羧基酸酐溶于一种或多种溶剂中，（b）使用水解试剂水解溶于溶剂中的N-羧基酸酐，得到可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液；(2).测量上述得到的N-羧基酸酐中氯离子含量；当氯离子含量大于0.05wt%，优选大于0.01wt%时，则进行纯化步骤使得其氯离子含量小于0.05wt%，优选小于0.01wt%。12.根据技术方案11的方法，其中基本无水溶剂选自如下：-与水混溶的溶剂，其中，溶剂优选选自二甲基亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺和环丁砜、二氧六环、四氢呋喃(THF)、丙酮、乙腈以及羧酸如甲酸、乙酸；和/或-离子液体，例如烷基化咪唑的液体盐。13.根据上述技术方案11-12任一项的方法，其中,在惰性气体保护下，将N-羧基酸酐溶于一种或多种基本无水溶剂中。14.根据上述技术方案11-13任一项的方法，其中,使用水解试剂如水或碱水溶液进行水解，优选水或氢氧化钠水溶液，尤其地，去离子水。15.根据上述技术方案11-14任一项的方法，其中，水解溶于溶剂中的N-羧基酸酐的过程中，所述水解试剂如水或碱水溶液的使用量是：0.1-50mL/mgN-羧基酸酐，优选1-30mL/mgN-羧基酸酐，尤其1-20mL/mgN-羧基酸酐，更优选1-10mL/mgN-羧基酸酐。16.制备多肽的方法，其包括下述步骤：A.如下选择N-羧基酸酐，其中氯离子含量大于0.05wt%，优选大于0.01wt%：-检测得到的N-羧基酸酐中氯离子含量；(1).制备可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液，其包括：（a）将N-羧基酸酐溶于一种或多种溶剂中，（b）使用水解试剂水解溶于溶剂中的N-羧基酸酐，得到可用于测量N-羧基酸酐中氯离子含量的溶液；(2).测量上述得到的N-羧基酸酐中氯离子含量；当氯离子含量大于0.05wt%，优选大于0.01wt%时，则进行纯化步骤使得其氯离子含量小于0.05wt%，优选小于0.01wt%。17.根据技术方案16的方法，其中多肽是醋酸格拉替雷。18.根据技术方案16-17任一项的方法，其中基本无水溶剂选自如下：-与水混溶的溶剂，其中，溶剂优选选自二甲基亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺和环丁砜、二氧六环、四氢呋喃(THF)、丙酮、乙腈以及羧酸如甲酸、乙酸；和/或-离子液体，例如烷基化咪唑的液体盐。19.根据上述技术方案16-18任一项的方法，其中,在惰性气体保护下，将N-羧基酸酐溶于一种或多种基本无水溶剂中。20.根据上述技术方案16-19任一项的方法，其中,使用水解试剂如水或碱水溶液进行水解，优选水或氢氧化钠水溶液，尤其地，去离子水。21.根据上述技术方案16-20任一项的方法，其中，水解溶于溶剂中的N-羧基酸酐的过程中，所述水解试剂如水或碱水溶液的使用量是：0.1-50mL/mgN-羧基酸酐，优选1-30mL/mgN-羧基酸酐，尤其1-20mL/mgN-羧基酸酐，更优选1-10mL/mgN-羧基酸酐。以下实例旨在说明本发明而非限制本发明。具体实施方式实施例1.测试L-丙氨酸-NCA样品溶液的配制氮气保护下精确称取大约20mgL-丙氨酸-NCA待检样品，用1毫升无水1,4-二氧六环（含水量≤0.04%）溶解。将该溶液滴加到搅拌中的10毫升去离子水中，将该混合物用去离子水完全转移到20毫升容量瓶中，用去离子水定容。实施例2.测试L-酪氨酸-NCA样品溶液的配制氮气保护下精确称取大约20mgL-酪氨酸-NCA待检样品，用1毫升无水1,4-二氧六环（含水量≤0.04%）溶解。将该溶液滴加到搅拌中的10毫升0.01M氢氧化钠水溶液中，将该混合物用去离子水完全转移到20毫升容量瓶中，用去离子水定容。实施例3.测试L-谷氨酸-γ-苄酯-NCA样品溶液的配制氮气保护下精确称取大约20mgL-谷氨酸-γ-苄酯-NCA待检样品，用1毫升无水1,4-二氧六环（含水量≤0.04%）溶解。将该溶液滴加到搅拌中的10毫升去离子水中，将该混合物用去离子水完全转移到20毫升容量瓶中，用去离子水定容。实施例4.测试L-ε-三氟乙酰基-赖氨酸-NCA样品溶液的配制氮气保护下精确称取大约20mgL-ε-三氟乙酰基-赖氨酸-NCA待检样品，用1毫升无水1,4-二氧六环（含水量≤0.04%）溶解。将该溶液滴加到搅拌中的10毫升去离子水中，将该混合物用去离子水完全转移到20毫升容量瓶中，用去离子水定容。实施例5.空白溶液的配制将1毫升无水1,4-二氧六环（含水量≤0.04%）滴加到搅拌中的10毫升去离子水中，将该混合物用去离子水完全转移到20毫升容量瓶中，用去离子水定容。实施例6.样品检测将上述配制好的四个溶液用离子色谱进行检测，色谱柱为DionexIonPacTMAS19,4.0×250mm，流速1.0ml/min，10mM的KOH进行洗脱，采用电导检测器检测信号，氯离子出峰时间约为10.6min处。同时用氯化钠配制对照品，用外标法进行检测。氯离子检测结果如表1。表1：氯离子检测结果实施例7.制备共聚物-1（即，醋酸格拉替雷）三口瓶中加入经金属钠处理过的1,4-二氧六环200mL，室温下加入L-丙氨酸NCA2.590克，L-酪氨酸NCA1.036克，L-谷氨酸-γ-苄酯NCA1.974克，L-ε-三氟乙酰基-赖氨酸NCA4.693克。搅拌30分钟，至体系澄清，加入二乙胺33毫克。20-25摄氏度下机械搅拌24小时。将反应液缓慢倒入400mL水中，产生大量白色固体，抽滤后，真空干燥得7.424克，收率92.8%。三口瓶中加入上述受保护的格拉替雷7.0克，31%溴化氢/乙酸混合液140mL，在22-24摄氏度下搅拌22小时。将红棕色反应液倒入400mL水中，产生大量白色固体，抽滤，真空干燥得三氟乙酰基格拉替雷4.76克。三口瓶中加入上述三氟乙酰基格拉替雷0.76克，1M哌啶水溶液38mL，室温下搅拌24小时。用1KDa的滤膜进行透析，得到的溶液加冰乙酸至pH为5.5-5.8，搅拌1小时。冻干得白色粉末，平均分子量为7803。