血液相关脂肪酸谱的建立方法

血液相关脂肪酸谱的建立方法
【专利摘要】本发明公开了一种血液相关脂肪酸谱的建立方法，包括以下步骤：1）选择研究对象，并将已脱离研究对象身体的血浆、血清或血小板中的总脂肪酸成分进行提取、分离、浓缩，从而得到总脂；2）、将总脂用薄层层析法分离磷脂、甘油三酯；3）、将分离得到的磷脂、甘油三酯进行甲酯化；4）、将甲酯化脂肪酸采用气相色谱分离法测定脂肪酸成分；5）、将脂肪酸进行图谱分析、SPSS数据统计分析；6）、将分析所得的数据进行整理、总结。本发明创立了一种简单有效且实用的脂肪酸谱的建立方法；建立了健康人与目前流行的慢性疾病的脂肪酸谱，对人类健康和脂肪摄入提供了强有力的指导作用。
【专利说明】血液相关脂肪酸谱的建立方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学、流行病学领域，具体的说，涉及采用气相色谱建立一种测定血液相关(血浆，血清，血小板，红细胞等)的总酯、磷脂膜、或甘油三酯的脂肪酸谱，并对与脂代谢相关的慢性疾病(糖尿病、代谢综合症、高脂血症、非酒精性脂肪肝、高血压等)人群的脂肪酸谱进行了分析，从而建立相关的脂肪酸谱。即，本发明涉及健康人群和慢性病患者血液脂肪酸谱的建立方法。
【背景技术】
[0002]随着中国经济的快速发展，人们的日常饮食结构逐渐西方化，上个世纪中叶营养不良型疾病为主的形势已经转变到现在营养过剩型慢性疾病的盛行和快速增长，与膳食相关的疾病已经跃居为居民死亡的主要原因。膳食的要求也从满足温饱过渡到各种营养素合理摄入的健康饮食，通过合理的膳食指导来防治非传染性慢性疾病，显得越来越重要。饮食和生活方式在慢性病的病情演化中起到很重要的作用，营养调节可以改变慢性病的病情发展。
[0003]目前还没有中国人饮食中的脂肪酸类型的数据，因为人们在家中并不能准备所有的食物，而且食物中摄入的脂肪数量高度可变，所以还没有一个精确的方法去评价饮食中的各个脂肪酸摄入情况，因此这就需要采用生物标记物来提高评估的准确性。今年来，在长期的脂肪酸摄入量的模式中，组织脂肪酸(血清/血浆、动物脂肪、血小板和红细胞)被用来作为合适的生物标记物。
[0004]血浆或血清磷脂脂肪酸水平主要受到饮食因素的影响，尤其是n-3多不饱和脂肪酸(n_3polyunsaturated fatty acids, n_3PUFA)。研究表明，补充 n_3PUFA 能够增加组织磷脂多不饱和脂肪酸的含量，但是不同人群膳食脂肪酸摄入量不一样，而且膳食脂肪酸需要在体内进行一系列的生理反应才能进入细胞膜。
[0005]研究表明，增加n-3PUFA摄取量可阻止心率不齐的发生，降低血栓的发生概率，降低血清甘油三酯水平，舒缓动脉粥样硬化斑的生长，增强血管内皮细胞功能，降低血压，减少炎症的发生。
[0006]多不饱和脂肪酸(PUFA)在血多细胞生理功能中起着重要作用，例如PUFA是细胞膜的组成成分，同时也是许多重要的炎症调节因子，如花生四烯酸等的前体。PUFA能够影响细胞膜的流动性和和胆固醇含量以及影响细胞信号分子的生成，大量的研究表明多不饱和脂肪酸与众多复杂的疾病有关。磷脂多不饱和脂肪酸组成与心血管疾病、代谢综合症、2型糖尿病、血型同型半胱氨酸等相关。
[0007]因此，建立一种简单易行且有效的脂肪酸谱的方法势在必行，而且通过建立慢性病相关的脂肪酸谱，对膳食脂肪的摄入进行指导，从而减少相关慢性病的发生，为人们的健康生活多一层保障是有着重大意义的。

【发明内容】
[0008]本发明要解决的技术问题是提供一种血液相关脂肪酸谱的建立方法。本发明的方法简单易行，有效可信；采用本发明的方法建立中国慢性病人群的血液相关脂肪酸谱，以便对人们的膳食脂肪摄入进行指导，从而减少慢性病的发生。
[0009]为了解决上述技术问题，本发明提供一种血液相关脂肪酸谱的建立方法，包括以下步骤:
[0010]I)选择研究对象，并将已脱离研究对象身体的血浆、血清或血小板中的总脂肪酸成分进行提取、分离、浓缩，从而得到总脂；
[0011]2)、将总脂用薄层层析法分离磷脂、甘油三酯；
[0012]3)、将分离得到的磷脂、甘油三酯进行甲酯化；
[0013]4)、将甲酯化脂肪酸采用气相色谱分离法测定脂肪酸成分；
[0014]5)、将脂肪酸进行图谱分析、SPSS数据统计分析；
[0015]6)、将分析所得的数据进行整理、总结。
[0016]作为本发明的血液相关脂肪酸谱的建立方法的改进:研究对象为哺乳动物，例如为人。
[0017]作为本发明的血液相关脂肪酸谱的建立方法的改进:该脂肪酸谱的建立方法适用于建立器官的脂肪酸谱；该器官包括心、肝、脾、肾、大脑、脂肪。
[0018]本发明在采用GC分析血液中脂肪酸的成分，建立相关的脂肪酸谱。
[0019]脂肪酸谱的建立方法是:获得血液——血液分离为血浆、血清或血小板——血液储存于_80°C——总脂肪成分的提取——总酯分离——总酯浓缩——(磷脂的分离)(如果测定总酯脂肪酸的话，此步骤可以省略，直接甲酯化)一脂肪酸甲酯化一甲酯物的提取、纯化一色谱纯正己烷，进GC——图谱分析——数据统计——脂肪酸谱完成。
[0020]首先声明，虽然本发明中涉及使用血液(新鲜血液)；但针对的只是已脱离人体的新鲜血液，其具体获取过程本身并不属于本发明的内容。本发明对其采集方法的详细描述只是为了更清楚地介绍生物材料的准备过程，但该描述并不意味着相关技术手段也属本发明要求保护的内容。
[0021]在本发明中，遵守以下规则:
[0022]I)研究得到伦理委员会的批准；
[0023]2 )严格按照标准选择受试对象；
[0024]3)受试对象签署书面同意书；
[0025]4)按照建立血液相关脂肪酸谱的方法进行分析；
[0026]5)分析相关脂肪酸与慢性病之间的关系；
[0027]6)作出结论。
[0028]本发明的立的相关慢性病脂肪酸谱的方法，并不局限于本发明中案例中的糖尿病、代谢综合症、高血压、高脂血症、非酒精性脂肪肝等慢性病，也包括目前临床上认定的其他慢性病。
[0029]具体如下:
[0030]一、血液采集及总酯提取
[0031]本发明中，血液采集的方法为常规体检的方法。即:受试对象近期内无急性病、夕卜伤、手术等意外情况，在采血前24h内不饮酒、不做剧烈运动，采血前一晚10点钟开始禁食，于次日早上9点至10点之间在医院有专业医师严格按照临床标准进行血液采集，采取肘正中静脉血。
[0032]本发明中，受试者血样取血为全血(静脉全血)5mL于抗凝管中，充分混匀，IOOOr/min离心5min,分离血衆，_80°C储存待用。
[0033]本发明中，血清的分离方法:取5mL静脉全血，静置2h，IOOOrpm离心IOmin分离血清，-20°C储存待用。
[0034]本发明中，血小板的分离方法:取全血(静脉全血)5mL于3.5%抗凝管(I:9)中，充分混勻，IOOOrpm离心5分钟,吸取血衆于另一试管中，3000rpm离心15min,弃去上层血衆，加3mL生理盐水,混勻，3000rpm离心15min,弃去上清液，_80°C待用。
[0035]本发明中，血液样本的储存温度可以是_80°C、也可以是_20°C、-30°C、-40°C或-70。。;即-20 °C~ -80 °C o
[0036]本发明中，血液相关总脂肪成分提取的方法为:将血液样本(血浆、血清或血小板)从_80°C超低温冰箱中取出，放置常温下解冻。解冻后，取血浆、血清或血小板0.5mL至20mL具塞试管中，加入IOml氯仿-甲醇混合液(氯仿:甲醇=l:lv/v)。充分摇匀样品提取液，放A 4°C冰箱中静置，充分浸提24小时后，进行总酯分离(如果样本较少的话，可以按照样本:液体=1:20的比例进行稀释)。
[0037]本发明中，总酯分离的方法为:将样品提取液过滤至IOOmL分液漏斗中(放置滤纸)，原萃取试管(即，20mL具塞试管)再用5mL氯仿-甲醇混合液(氯仿:甲醇=2:1的体积t匕)清洗，转入分液漏斗；原萃取试管再用5mL氯仿清洗，转入分液漏斗。除去滤纸后，再加入4mL生理盐水至分液漏斗中。轻摇分液漏斗，并打开塞子放气，重复，直到里外气压平衡。然后剧烈震荡分液漏斗。分液漏斗静置约4小时，两个液面完全分开。然后收集下层有机相(氯仿层)至圆底蒸发瓶中，该下层有机相(氯仿层)中含有总酯。
[0038]总酯浓缩的方法为:将圆底蒸发瓶接取分液漏斗的下层有机相，于38°C水浴中抽真空旋转蒸发，用2mL含BHA的氯仿(BHA的浓度为50mg/mL，BHA为丁基羟基茴香醚)洗涤三次后旋干至得数滴清亮透明油状提取物，即为总酯。最后用5mL含BHA的氯仿(BHA的浓度为50mg/mL)溶解油状提取物，并转移至具塞试管(薄层层析)或总酯(直接甲酯化)特福伦试管中(按实验目的而定)，涡旋振荡器混匀待用(如不能及时测定，可以充氮后保存在-20°C环境中待测，二周内测完)。N2吹干具塞试管中的有机试剂，即得总酯浓缩物。
[0039]备注说明:
[0040]因为分液漏斗的特殊性，人工剧烈震荡，以每分钟120次的频率，震荡20s。(视液体融合的程度而决定力度大小，以将分液漏斗中的液体最大速度到达分液漏斗顶端和底端为准)。
[0041]轻轻震荡是指将分液漏斗中的液体慢摇，分别缓慢到达分液漏斗的顶端和底端，每分钟20?30次为宜。
[0042]本发明中，血液相关总脂肪成分提取的方法中，血液的解冻方法可以是常温下解冻，也可以是流水解冻，也可以是冰浴下摇床震荡解冻。
[0043]本发明中，血液相关总脂肪成分提取的试管可以是20mL，也可以是IOmL或者是其他规格。
[0044]本发明中，原萃取试管清洗时，氯仿-甲醇混合液、氯仿以及生理盐水的体积比例为5:5:4。也可以是其他比例，但以该比例总酯浸提效果最好。
[0045]二、将总脂采用薄层层析法分离磷脂或甘油三酯:
[0046]将总酯浓缩物溶于IOOuL氯仿中，充分混匀，用毛细管点样于20cm*20cm的硅胶板中。点样点据底部边缘2cm处作为基线，进行点样。点样完毕后，将硅胶板置于含展开液(石油醚:乙醚:乙酸=85:15:2，v/v/v)的层析缸中，以展开液扩展至距离层析板顶端2cm出结束，于通风橱中晾干。然后将晾干后的层析板置于三外分析仪中观察，具体条带位置如示意图1所示。刮板。按照试验要求，刮取甘油三酯或磷脂条带硅胶，置于IOmL特福伦试管中。
[0047]本发明中,娃胶板的制备方法:将7g娃胶快速溶于17?20g蒸懼水中，快速搅拌均匀，均匀涂抹于规格为20cm*20cm的玻璃板上(玻璃板要清洗干净，蒸馏水润洗，烘干，做板时不能有水溃存在。)水平放置(否则会导致玻璃板上硅胶厚度不一，影响分离效果)，室温下凝结。待硅胶干后，样品点样前，将其放入100°C烘箱中活化90min，冷却至常温，待用。
[0048]本发明中，硅胶板可以自制，也可以购置。
[0049]本发明中，如需测定血液磷脂脂肪酸，则刮取磷脂带硅胶，其位置为点样处上下Icm0
[0050]本发明中，如果仅需测定总酯脂肪酸的含量，则不需要采用薄层层析，直接进入下一步-甲酯化。
[0051]三、将分离得到的磷脂或甘油三酯进行甲酯化:
[0052]在本发明中，包括甲酯化、甲酯物的提取、纯化:
[0053]具体如下:
[0054]I)甲酯化:在含有刮板硅胶或总酯的IOmL特福伦试管中加入ImL甲苯和3mL的硫酸一甲醇溶液(硫酸浓度为0.9mol/L)，拧紧盖子，震荡摇匀，在70°C水浴条件下，甲酯化2个小时，每隔30min进行震荡摇匀，加速甲酯化。
[0055]2)甲酯物的提取:甲酯化完后，加入2mL正己烷，再加入生理盐水至管口处，拧紧盖子，剧烈震荡Imin (采用振动器)，2000rpm离心lOmin。将上层正己烷相用玻璃吸管小心吸出至一事先放有2mL蒸馏水的圆底试管中，振荡混匀，静置分层再将上层有机相转移至事先装有少量(约100?200mg)无水Na2SO4的尖头离心管中。将上层有机相移入后，轻轻振荡，若发现其中的无水似2504可以跳动，证明没有水分吸过来。再将上层石油醚相转移至一具塞试管中。
[0056]备注说明:如果无水Na2SO4F能跳动，且溶解，说明有水分吸过来，这需要重新静置分层，吸取上层有机相，直至无水Na2SO4可以跳动。
[0057]上述为:用特福伦试管(是IOmL的试管)进行甲酯化。
[0058]3)甲酯物的纯化:用正己烷?2mL快速过(2?5s过完)SPE固相萃取小柱，再将样品快速过柱(2?5s过完)。用正己烷清洗具塞试管两次(每次的用量分别为2mL，ImL)后，快速过柱。然后，用3mL5%乙醚-正己烷溶液缓慢清洗聚酰胺柱(即，SPE固相萃取小柱)，液体成滴收集到具塞试管。先用3mL氯仿:甲醇为2:1 (V:V)的溶液，再用3mL正己烷慢速清洗柱子，冲洗速度为成滴滴下。然后在38°C水浴下N2吹干；得到相应的脂肪酸甲酯。
[0059]本发明中，脂肪酸的甲酯化可以使不同比例的甲苯:硫酸甲醇的组合，本发明中的硫酸可以是硫酸，也可以是盐酸。甲酯物的纯化中的正己烷可以是石油醚。
[0060]四、将甲酯化脂肪酸采用气相色谱分离法测定脂肪酸成分:[0061]在本发明中，脂肪酸的测定方法为:用100 正己烷重新融解氮吹干的脂肪酸甲酯至样品瓶中，进样L由岛津气相色谱仪(GC - 2010型)测定样品的脂肪酸成分。
[0062]本发明中，采用的仪器可以是岛津的气相色谱仪，也可以是其他品牌或型号的气相色谱仪。
[0063]本发明中，GC - 2010型气相色谱的分析条件为:调节空气到50，调节氢气到75。调节Col (柱温)到160°C，调节Det (监测器温度)到260°C，调节Aux (进样口温度)到2700C o 柱温升温程序:160°C (Omin) ;20°C/min、180°C (IOmin) ；20°C /min,220°C (5min)；20°C /min,230°C (16.5min)。
[0064]本发明中，气相色谱的分析条件可以根据仪器不同而选择不同的气相分析条件，或者在原有条件的基础上进行修改。原则为能够将31种脂肪酸甲酯混合标样(sigma)的图谱清晰与完整的表现。本发明中，所用的脂肪酸混合标样为31种脂肪酸甲酯标准品(sigma)，但该标准品也可以是37种脂肪酸甲酯混合标样(sigma)，也可以是其他品牌或种类的脂肪酸混合标样。
[0065]备注说明:上述脂肪酸甲酯混合标样为直接进样，是为鉴定与分析样品中的峰的位置时用到的。
[0066]37种脂肪酸甲酯混合标样(sigma)为新推出的为含37种脂肪酸甲酯的混合标准品，是非等体积混合的标准品，含有反式脂肪酸的成分。
[0067]五、将脂肪酸进行图谱分析、SPSS数据统计分析；
[0068]本发明中，脂肪酸的成分分析方法为:采用GC - 2010型气相色谱仪测定脂肪酸，用杭州英谱科技开发有限公司HS色谱数据工作站V4.0采集谱图，并处理分析所采集的谱图数据。色谱峰采用混合的脂肪酸甲酯标样(Sigma)来进行鉴定。定量方式采用面积法，定量方法为归一法。
[0069]本发明中，谱图采集处理采用采用与标准品保留时间对照的方法定性，即根据相对保留值定性；采用面积法定量，即运用面积归一法求各色谱峰面积，并计算血浆中脂肪酸含量。
[0070]本发明中，数据统计分析采用SPSS进行分析，数据采用独立样本t检验，结果表示为MeaniSD值。P〈0.05确认为有显著性差异。
[0071]在本发明中，数据统计分析的方法可以是SPSS，也可以是SAS、DPS, STATA, Excel等具有分析统计作用的软件。
[0072]六、将分析所得的数据进行整理，总结。
[0073]为了建立中国慢性病人群的血液相关脂肪酸谱，首先在每个研究进行前需经过伦理委员会的批准。
[0074]本发明中，受试者均来自浙江地区，但是受试人群可以是全国范围内。
[0075]为了建立中国人群慢性病人群的血液相关脂肪酸谱，该研究所有的受试者在实验前均给予书面同意。
[0076]为了建立中国人群慢性病人群的血液相关脂肪酸谱，每一种慢性病人群及健康对照均按照标准严格筛选。
[0077]为了建立中国人群慢性病人群的血液相关脂肪酸谱，需要对样本的生理参数进行检测。[0078]本发明中，总样本数为3764例，其中病例1444例，健康对照2320例。涉及慢性病包括2型糖尿病(病例781例，健康对照322例)，代谢综合症(病例262例，健康对照868例)，高脂血症(病例86例，健康对照82例)，高血压(病例214例，健康对照940例)，非酒精性脂肪肝(病例101例，健康对照108例)
[0079]本发明具有如下技术优点:
[0080]1、本发明建立了一种系统、有效、可信的血液相关脂肪酸谱的建立方法；
[0081]2、本发明建立了人类血液相关脂肪酸谱与慢性病之间的关系的分析思路。
[0082]综上所述，本发明创立了一种系统研究不同脂肪酸的摄入与健康人及慢性疾病之间的相关性的方法；创立了一种简单有效且实用的脂肪酸谱的建立方法；建立了健康人与目前流行的慢性疾病的脂肪酸谱，对人类健康和脂肪摄入提供了强有力的指导作用。
【专利附图】

【附图说明】
[0083]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0084]图1是血液脂质提取物薄层层析示意图谱。
[0085]图2是31种脂肪酸混合标样图。
[0086]图3是糖尿病人血浆磷脂脂肪酸GC图。
[0087]图4是正常人血浆磷脂脂肪酸GC图。
【具体实施方式】
[0088]实施例1、2型糖尿病人群的血浆磷脂脂肪酸谱的建立方法
[0089]研究背景:
[0090]2型糖尿病(Type2Diabetes Mellitus, T2DM)是一种严重影响个人和社会的慢性疾病，其在全球急剧上升的发病率，使得人们对糖尿病的关注越来越多。据估计，到2030年全球将有近3.6亿糖尿病患者，糖尿病引起的健康问题会对生活质量带来巨大变化。体重增加，并伴随MS相关症状是2型糖尿病最明显最常见的临床症状。研究表明，膳食因素在T2DM的发生和发展中起了重要作用。增加饮食中n-3多不饱和脂肪酸(n_3PUFA)的摄入，可以改善体内脂质构成，改善胰岛素抵抗的状况对男性医疗专业人员12年的跟踪研究观察到脂肪种类和患2型糖尿病的风险由明显的联系。饮食中n-6和n-3多不饱和脂肪酸的不平衡是胰岛素抵抗、代谢综合症中血脂异常的一个重要因素。动物实验报道喂养n-3多不饱和脂肪酸可以提高胰岛素的敏感性，然而人类实验表明使用n-6多不饱和脂肪酸降低胰岛素的敏感性。2型糖尿病的前瞻性研究中报道总脂肪酸、或者特殊类型的脂肪酸和2型糖尿病发病风险没有关系。动物学研究表明H-3PUFA可以降低或阻止胰岛素抵抗，但是临床研究结果不一致。动物学研究表明H-3PUFA可以减低或阻止胰岛素抵抗，但是临床结果却不一致。因此，研究膳食成分中脂肪酸的摄入与T2DM之间的关系变得十分重要，，由于中国人饮食的复杂性和烹饪过程的随意性，使得通过分析膳食成分来研究脂肪酸摄入与T2DM之间的关系十分困难。因为饮食会影响血浆脂肪酸成分的种类和数量，因此我们选择血浆脂肪酸作为膳食脂肪酸摄入的生物标记物，以建立T2DM的脂肪酸谱，从而研究膳食脂肪酸与T2DM之间的关系，以便进一步从饮食上控制与预防T2DM的流行。
[0091]研究方法与结果分析[0092]1.研究经过浙江大学生物系统工程与食品科学学院伦理委员会的审核确认后，选择受试对象，所有受试对象给予书面同意书。
[0093]2.选择受试人群
[0094]研究对象:2型糖尿病病人:经严格筛选，选择浙江省内，血糖水平稳定在7.0~10.0mmol的不同年龄段(0-100yr)、不同性别(男、女)的2型糖尿病病人被纳入研究对象。I型糖尿病人、具有心血管疾病史或动脉粥样硬化史、脑血管疾病史，严重肝脏疾病和/或肾脏疾病以及血液疾病的人都被排除在外。所有的受试者均服用降糖药。
[0095]健康对照:通过健康检查、年龄和性别均匹配的健康对照受试者被纳入此研究。通过对高血压病、肾脏疾病、高脂蛋白血症、血液症、糖尿病、遗传性心血管疾病过量饮酒和吸毒的严格筛查，322例健康人被纳入研究对象。
[0096]3.样本量:总样本数为1103例，2型糖尿病患者为781例(其中男性为418例，女性为363例)，健康对照为322例(其中男性为161例，女性为161例)。
【权利要求】
1.血液相关脂肪酸谱的建立方法，其特征是包括以下步骤: 1)选择研究对象，并将已脱离研究对象身体的血浆、血清或血小板中的总脂肪酸成分进行提取、分离、浓缩，从而得到总脂； 2)、将总脂用薄层层析法分离磷脂、甘油三酯； 3)、将分离得到的磷脂、甘油三酯进行甲酯化； 4)、将甲酯化脂肪酸采用气相色谱分离法测定脂肪酸成分； 5)、将脂肪酸进行图谱分析、SPSS数据统计分析； 6)、将分析所得的数据进行整理、总结。
2.根据权利要求1所述的血液相关脂肪酸谱的建立方法，其特征在于:研究对象为哺乳动物。
3.根据权利要求2所述的血液相关脂肪酸谱的建立方法，其特征在于:哺乳动物为人。
4.根据权利要求3所述的血液相关脂肪酸谱的建立方法，其特征在于:该脂肪酸谱的建立方法适用于建立器官的脂肪酸谱；该器官包括心、肝、脾、肾、大脑、脂肪。
【文档编号】G01N30/88GK103616465SQ201310515767
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】李铎, 杨静, 黄涛 申请人:浙江大学