用于晕厥的诊断、预后、评估和治疗分层的生物标志物的制作方法

用于晕厥的诊断、预后、评估和治疗分层的生物标志物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于患者的晕厥的诊断和/或预后和/或评估和/或治疗分层的方法，所述方法包括：测定所述患者的体液样品中至少一个生物标志物的水平，所述生物标志物选自proET-1、proADM、proANP、proBNP、proAVP和PCT或它们至少12个氨基酸的片段，使至少一个生物标志物或其片段的所述水平与晕厥的诊断和/或预后和/或评估和/或治疗分层相关联。
【专利说明】用于晕厥的诊断、预后、评估和治疗分层的生物标志物 发明领域
[0001] 本发明涉及临床诊断的领域。具体地本发明涉及晕厥的诊断和/或预后和/或评 估和/或治疗分层。
[0002] 发明背景
[0003] 在明显和明确的病因学不存在的情况下一过性意识丧失（TL0C)的评价是个复杂 问题。TL0C被分成创伤性和非创伤性形式，非创伤性TL0C被分类成癫痫性发作、精神性 假性晕厥、罕见的其它原因和晕厥。对于大部分具有不确定的诊断的情况，潜在原因是导 致脑血流灌注过少的临时循环障碍，常规地分类为晕厥发作(Blanc等人2002. Eur Heart .Τ· 23:815-820 :Bartoletti 等人 2006. Eur Heart T 27:83-88)。
[0004] 晕厥表征为通常无警告地发生的快速发作、短持续时间和自发完全恢复的TLOC。 具体地，晕厥可被分成神经介导的反射性晕厥（匪S)、直立性低血压（0H)和心源性晕 厥（心律不齐或结构性的），尽管可能会发生频率较低的状况(Moya等人2009. Heart T. 30:2631-2671)。
[0005] 匪S通常基于涉及最多的传出路径（即，交感神经或副交感神经路径）来进行分 类：如果归因于直立缩血管紧张丧失的低血压占优势，则使用术语血管减压性晕厥；如果 心动过缓或心搏停止占优势，则使用术语心动抑制性晕厥；如果两种机制存在，则诊断为 混合形式。此外，匪S还可基于其触发因素（即传入路径）被分类成血管迷走神经性晕厥 (VVS)、情境性晕厥（与一些特殊情境相关的NMS)、颈动脉窦过敏（CSH)和非典型形式（其 中匪S因未明确触发因素或甚至明显地在触发因素不存在的情况下发生）的触发剂（即传 入路径）。
[0006] 与匪S相反，在直立性低血压中，交感神经传出活性长期受损，这样血管收缩不充 分。当站立时，血压（BP)下降，从而晕厥或先兆晕厥发生。0H被定义为站立时BP的异常 降低。严格地从病理生理学观点来看，匪S与0H之间不存在重叠，但这两种病况的临床表 现经常重叠，有时#得鉴别诊断夺得闲难（Mova等人2009. Heart T. 30:2631-2671)。0H可 被分成典型0H (定义为在3分钟内的站立大于等于20mmHg的收缩BP的下降以及大于等于 lOmmHg的舒张 BP的下降(T Neurol Sci 1996 :144:218-219))、初始件0H(表征为刚站起 时大于40mmHg的BP下降和BP至正常的自发快速回复，导致短期的低血压和症状（Wieling 等人2007. Clin Sci (Lond) 112:157-165))、延迟的(进行性）OH(表征为在假定直立姿势 时收缩 BP 的缓慢进行性下降(Gibbons and Freeman 2006. Neurology67:28-32))，和体位 直立性心运过速综合征（POTS)(表征为每分钟大于30次搏动或每分钟大于120次搏动的 非常显著的心率增加以及BP的不稳定性(Grubb等人1997. Pacing Clin Electrophysiol 20:2205-2212))。
[0007] 心源性晕厥可由心律不齐（心动过缓、心动过速）或结构性疾病（例如，心血脏瓣 膜病、急性心肌梗塞/缺血、冠状动脉的先天异常、肺性高血压等）引起。
[0008] 晕厥分类的概述示于图1中。
[0009] 根据当前晕厥指导方针，推荐2个主要调查路线，基于长期ECG监控和自主测 试的先进心脏评估，其中直立倾斜试验（HUTT)具有中心作用(Mova等人2009. Heart T. 30:2631-2671)。路线的选择通常取决于患者的历史和晕厥情况。
[0010] ECG监控是用于诊断间歇性缓慢性和快速性心律失常的方法。晕厥诊断的金标准 是何时记录到症状与已记录的心律失常之间的关联。一般而言，仅当存在鉴定与晕厥相关 的心律失常的高验前概率时才显示需要ECG监控。
[0011] 在自主测试中，直立性挑战（orthostatic challenge)(从仰卧位变化至直立位） 产生血液从胸部至下肢的移位，这导致静脉回流和心输出量的减少。在代偿机制不存在的 情况下，BP的下降可导致晕厥。目前，存在两个不同的用于评估对从仰卧位至直立位的姿 势的改变的反应的方法：主动站立测试，其中患者主动从仰卧位至直立位站立，另一种是以 60或70°的头离位分倾斜。主动站立测试用于使用血压计诊断不同类型的直立耐受不能 (orthostatic intolerance)。倾斜测试使得能够在实验室情境中再现神经介导的反射。因 直立应激和制动（immobilization)引起的血液滞积和静脉回流的减少触发反射。然而，诊 断过程是非常耗时的并且并非总是成功的(Croci等人2002. Europace 4:351-355)。
[0012] 已在具有不同类型的具有异质结果的晕厥的患者中研究了血管活性激素的循环 水平。在具有VVS的患者中，未发现精氨酸-加压素（AVP)在基线（在HUT测试之前） 上的差异(Kaufmann 等人 199L Lancet 338:8782-8783 :Kaufmann 等人 1992. Neurology 42:590-593 :Tardine 等人 1997. Am T Cardiol 79:1302-1306:Roul 等人 1999.Pacing Clin Electrophvsiol 22:1020-1030 :The〇pistou等人 2001. Am T Cardiol. 88:376-381)。 已显示成熟AVP的增加在具有阳性HUT测试结果的组（被分类为具有VVS的患者） 中相较于阴性HUT测试组更明显(Tardine等人1997. Am T Cardiol 79:1302-1306 : Roul 等人 1999.Pacing Clin Electrophysiol 22:1020-1030 :Kaufmann 等人 1991. Lancet338:8782-8783 :Kaufmann 等人 1992. Neurology 42:590-593 :Theopistou 等人 2001. Am T Cardiol. 88:376-381)。此外，肽素（也称为 C_ 末端 proAVP (CT-proAVP)的 proAVP前体的稳定片段）的水平在具有心动抑制型晕厥与血管减压反射性晕厥的患者之 间没有差异(Holmegard等人2012. Scand T Clin Lab Invest,出版中）。类似地，在具 有VVS的患者中未发现心房或脑钠尿肽（ANP或BNP)的差异(Tardine等人1997. Am T Cardiol 79:1302-1306 :Roul 等人 1999.Pacing Clin Electrophvsiol 22:1020-1030 : Magerkurth 等人 2005. Cl in Autonom Res 15:299-301)。相反地，Holmegard 等人手艮导了当 与具有血管减压反射性晕厥的患者相比较时在具有心动抑制型晕厥的患者中存在更高水 平的中段心房钠尿肽原（MR-proANP)(前proANP的稳定片段），然而BNP的水平在组之间无 差异(Holmegard 等人 2012. Scand .T Clin Lab Invest,出版中）。类似地，Jardine 等人 显示在倾斜过程中正常受试者和VVS的ANP的减少，这在正常群体中更明显(Tardine等人 1997. Am T Cardiol 79:1302-1306)。与这些结果相反，Freitas等人报导BNP的仰卧位水 平在具有神经介导性晕厥的患者中相较于具有神经源性0H的患者显著更低，然而ANP的水 平不变(Freitas 等人 2007. Int T Cardiol 116:242-248)。此外，ANP 和 BNP 的差（Λ 倾斜 /基线）在具有神经介导性晕厥的患者之间相较于具有神经源性0Η的患者无差异。Gajek 等人报导了在自发性晕厥的患者与药物诱发晕厥的患者之间，心动抑制反射的患者的基线 肾上腺髓质素浓度无差异(Gaiek 等人 2004. Pol Merkur Lekarski 17:267-270)。
[0013] 当与健康对照或具有不明原因晕厥的患者相比较时在具有CSH的患者中未发 现AVP基线水平的差异，然而具有CSH的患者和具有不明原因晕厥的患者的AVP在倾斜 过程中显示显著的增加，这在健康受试者中不明显(Kenny等人1987. Cardiovasc Res 21:545-550)。
[0014] 在无 VVS史但具有一定直立耐受不能的健康志愿者中，在基线水平上，血清内 皮缩血管肽水平在于HUTT过程中经历晕厥的受试者中相较于无晕厥的受试者显著更高 (Magerkurth等人2005. Clin Autonom Res 15:299-301)。此夕卜，作者声明这些结果意味着 具有血管迷走神经性晕厥倾向的受试者的永久性增强的内皮缩血管肽释放，以及将来的研 究必须调查内皮缩血管肽血清水平是否可增强诊断血管迷走神经性晕厥的特异度和灵敏 度。具有VVS的患者和正常受试者的ET-1在HUT测试过程中增加，然而该增加在具有VVS 的患者中更明显(Kaufmann等人1991. Lancet 338: 8782-8783)。相反地，Mehta等人报导 了当与具有阳性HUTT结果的患者相比较时，基线内皮缩血管肽水平在具有晕厥史和阴性 HUTT的患者中显著更高(Mehta等人1995. Am T Cardiol 76:86-88)。然而，在晕厥亚型心 动抑制型、血管减压性和混合型之间无差异，并且在时间样品（timed sample)之间无差异。
[0015] 研究健康志愿者的肾上腺髓质素（ADM)，根据下体负压试验（LBNP)将受试者分成 高（无晕厥）和低（晕厥症状）直立性挑战耐受性(Gasiorowska等人2005. T Phvsiol Pharmacol 56:179-193)。ADM的基线值在低耐受性受试者中相较于对于直立性挑战具有高 耐受性的受试者显著更高，然而ADM在测试过程中在两个组中类似地增加。
[0016] 然而，对于所有这些研究，重要地要指出，在2009年公布ESC指导方针之前(Moya 等人2009. Heart T. 30:2631-2671),不存在对于晕厥患者的金标准诊断,因而关于不同形 式的直立性不稳定性不存在一致意见，它们与晕厥发作的关系是不可获得的。此外，对少数 选择患者系列（主要地与健康个体相比较）进行上述生物标志物研究，所述研究不包括全 谱的基本机制。因此，特定类型的晕厥的诊断具有挑战性并且不太可靠。
[0017] 此外，可靠的诊断是适当疗法的选择的重要前提。疗法的目的主要是预防复发 和相关损伤，以及提高生活质量。用于神经介导性晕厥的疗法选择是例如身体抗压动作 (physical counterpressure manoeuvre)(例如腿或臂的等长PCM，如腿交叉或手紧握和手 臂绷紧）和倾斜训练以及药物治疗（例如米多君，α-拮抗剂）以及心脏起搏法。Brignole 已报导主动起搏器治疗显著减少具有严重神经介导性晕厥的患者，特别地具有心动抑制 的 CSH 的晕厥复发(oral presentation. American College of Cardiology. Chicago USA. 24-27 of March 2012) 〇实际上，在严重心动抑制不存在的情况下忌用起搏。因此，晕 厥的准确诊断和严重度的评估是强制性的。
[0018] 关于与晕厥相关的预后（即风险分层），应当考虑两个重要因素：（i)死亡和威胁 生命的事件的风险；和（ii)晕厥和身体伤害复发的风险。
[0019] 因此，本发明的目的是提供允许晕厥的诊断和/或预后和/或评估和/或治疗分 层的方法。
[0020] 发明概述
[0021] 本发明的主题是用于患者的晕厥的诊断和/或预后和/或评估和/或治疗分层的 方法，所述方法包括：
[0022] -测定所述患者的体液样品中至少一个生物标志物的水平，所述生物标志物选自 proADM、proANP、proBNP、proAVP、proET-Ι和PCT或者它们至少12个氨基酸的片段，
[0023] -使至少一个生物标志物的所述水平与晕厥的诊断和/或预后和/或评估和/或 治疗分层相关联。
[0024] 优选方法变型描述于从属权利要求中。

【专利附图】

【附图说明】
[0025] 图1 :晕厥亚型的分类
[0026] 图2 :用于晕厥的诊断的MR-proANP值的盒须图
[0027] 图3 :用于晕厥的诊断的MR-proADM值的盒须图
[0028] 图4 :用于晕厥的诊断的CT-proET-Ι值的盒须图
[0029] 图5 :用于晕厥的诊断的CT-proAVP值的盒须图
[0030] 图6 :用于晕厥的诊断的PCT诊断的盒须图
[0031] 图7 :MR-proANP与VVS之间的线性关系
[0032] 图8 :CT-proET-l与VVS之间的线性关系
[0033] 图9 :CT-proET-l与0H之间的线性关系
[0034] 图10 :MR-proANP与CSH之间的线性关系和阈值样作用
[0035] 图11 :CT-proET-l与心动抵制反射之间的线性关系
[0036] 图12 :CT-proAVP与初始性0H之间的阈效应
[0037] 发明详述
[0038] 本发明的主题是提供用于患者的诊断和/或预后和/或评估和/或治疗分层的方 法，所述方法包括：
[0039] 测定所述患者的体液样品中至少一个生物标志物的水平，所述生物标志物选自 proADM、proANP、proBNP、proAVP、proET-Ι和PCT或者它们至少12个氨基酸的片段，
[0040] 使至少一个生物标志物的所述水平与晕厥的诊断和/或预后和/或评估和/或治 疗分层相关联。
[0041] 晕厥被定义为因一过性全脑低灌注引起的一过性意识丧失，其表征为快速发作、 短持续时间和自发完全恢复(Mova等人2009. Heart T. 30:2631-2671)。
[0042] VVS被定义为与明显的低血压和/或心动过缓/心搏停止的特征模式相关的晕厥 的再现。
[0043] CSH被定义为大于等于50mmHg的SBP的下降和/或超过3秒的心搏停止。
[0044] 0H被定义为大于等于20mmHg的收缩BP (SBP)的持续下降和/或大于等于lOmmHg 的舒张 BP (DBP)的下降，或小于90mmHg的收缩BP (典型0H，在3min的倾斜期内；和延迟0H， 在3至20min内），然而POTS具有在站立姿势时大于30/min的心率增加或大于120/min的 心动过速的直立耐受不能的特征症状。当短暂BP在站立后15秒内下降超过40mmHg SBP 和/或超过20mmHg DBP时，初始性0H存在，脑低灌注的症状发生并且患者报告了典型的晕 厥情况(Wieling 等人 2007. Clin Sci(Lond)。112:157-165)。
[0045] 心动抑制性晕厥被定义为至超过10秒的低于40bpm的心室率的心率下降，或超过 3秒的心搏停止，然而，血管减压反射被定义为在晕厥时与其峰值相比小于等于10 %的心 率下降(Brignole 等人 2000. Europace 2:66-76)。
[0046] 如本文中所述，"测定"或"诊断测定"可以是用于诊断领域的任何类型的测定。这 样的测定可基于待检测的分析物以一定亲和力与一种或多种捕获探针的结合。关于捕获分 子与靶分子或目标分子之间的相互作用，亲和常数优选大于io8m'
[0047] 在本发明的上下文中，"捕获分子"是可用于结合靶分子或目标分子即来自样品的 分析物（例如在本发明上下文中的肽）的分子。捕获分子因此必须在空间上和表面特征 (例如表面电荷、疏水性、亲水性、路易斯供体和/或受体的存在或不存在）方面被充分地塑 造来特异性结合靶分子或目标分子。因此，结合可以例如通过捕获分子与靶分子或目标分 子之间的离子、范德瓦尔斯、π-π、σ-Ji、疏水或氢键相互作用或上述相互作用的两个或 更多个的组合介导。在本发明的上下文中，捕获分子可以例如选自核酸分子、碳水化合物分 子、PNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白。优选，捕获分子是具有足够的对于靶或目标分子 的亲和力的抗体，包括其片段，以及包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体的化学和 /或生物化学修饰衍生物或其源自可变链的至少12个氨基酸的长度的片段。
[0048] 优选检测法包括以各种形式存在的免疫测定，例如放射免疫测定（RIA)、化学发光 和荧光免疫测定、酶联免疫测定（ELISA)、基于Luminex的珠粒阵列、蛋白质微阵列测定和 快速测试形式例如免疫层析试条测试色谱试条测试。
[0049] 测定可以是均相测试或异相测定，竞争性和非竞争性测定。在特别优选实施方案 中，测定以夹心测定的形式存在，其为非竞争性免疫测定，其中待检测和/或定量的分子结 合于第一抗体和第二抗体。第一抗体可结合于固相，例如珠粒、孔或其它容器、芯片或试 条的表面，第二抗体是例如利用染料、放射性同位素或反应性部分或催化活性部分标记的 抗体。随后通过适当的方法测量结合于分析物的标记抗体的量。与"夹心测定"有关的一 般组合物和方法已被良好建立并且对于本领域技术人员来说是已知的(The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild,Elsevier LTD, Oxford ： 第 3 版(May 2005), ISBN-13 ： 978-0080445267 :Hultschig C 等人，Curr (bin Chem Biol. 2006 Feb :10(1) :4-10. PMID : 16376134,通过此用并入本文）。
[0050] 在特别优选实施方案中，测定包括两种捕获分子，优选作为分散体均存在于液体 反应混合物中的抗体，其中第一标记组分连接于第一捕获分子，其中所述第一标记组分为 基于荧光-或化学发光-淬灭或放大的标记系统的部分，并且所述标记系统的第二标记组 分连接于第二捕获分子，以便在两种捕获分子结合分析物后，产生允许检测在包含样品的 溶液中形成的夹心复合物的可测量信号。
[0051] 甚至更优选，所述标记系统包含与荧光染料或化学发光染料，特别地花青类型的 染料组合的稀土穴状化合物或稀土螯合剂。
[0052] 甚至更优选，所述标记系统包含与荧光染料或化学发光染料，特别地花青类型的 染料组合的稀土穴状化合物或稀土螯合剂。在本发明的说明书中，基于荧光的测定包括 染料的使用，所述染料可以例如选自FAM(5-或6-羧基荧光素）、VIC、NED、荧光素、异硫 氰酸荧光素（FITC)、IRD-700/800、花青染料例如 CY3、CY5、CY3. 5、CY5. 5、CY7、咕吨、6-羧 基-2'，4'，7'，4,7_ 六氯荧光素（HEX)、TET、6-羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲氧基 荧光素（J0E)、Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基-6-羧基罗丹明（TAMRA)、6_羧基-X-罗丹明（R0X)、 5_羧基罗丹明-6G (R6G5)、6_羧基罗丹明-6G (RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明 110、B0DIPY染料例如B0DIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素类例如伞形酮、苯甲亚胺例如Hoechst 33258 ;菲啶类例如德克萨斯红、Yakima黄、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭、吖啶酯染料、咔唑 染料、吩噁嗪染料、紫菜碱染料、聚甲炔染料等。
[0053] 在本发明的说明书中，基于化学发光的测定包括基于在 Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology,第 4 版·，执 斗丁 编辑，.L I. Kroschwitz :编辑，Μ· Howe-Grant, .Tohn Wiley&Sons, 1993,第 15 卷，d. 518-562 (通过引 用并入本文，包括第551-562页上的引用）中针对化学发光材料描述的物理原理的染料的 使用。优选化学发光染料为吖啶酯。
[0054] "诊断"在本发明的说明书中涉及受试者的疾病或临床病况的识别和（早期）检 测，并且还可包括鉴别诊断。
[0055] 术语"评估"涉及患者的疾病的严重度的评价。
[0056] 在本发明中，术语"预后"是指受试者（例如患者）的医学状况将如何进展的预测。 这可包括所述受试者的恢复可能性或不良后果（例如晕厥发作的复发或死亡）的可能性的 评价。
[0057] 如本文中所用，术语"患者"是指正在接受医疗护理或因疾病而应当接受医疗护理 的活着的人或非人生物体。这包括正被调查病理学体征的无明确疾病的人。因此，本文中 描述的方法和测定适用于人和兽医学疾病。
[0058] 如本文中所用，术语"样品"是指为了目标受试者例如患者的诊断、预后或评价而 获得的体液的样品。优选测试样品包括血液、血清、血浆、脑脊髓液、尿、唾液、痰和胸腔积 液。此外，本领域技术人员可认识到一些测试样品在分级分离或纯化步骤例如全血至血清 或血浆组分的分离后可更容易分析。
[0059] 因此，在本发明的优选实施方案中，样品选自血液样品、血清样品、血浆样品、脑脊 髓液样品、唾液样品和尿样品或上述样品的任何样品的提取物。优选，样品为血液样品，最 优选血清样品或血浆样品。
[0060] 如本文中针对诊断和预后标志物的用途所用的，术语"使......相关联"是指将 标志物在患者中的存在或水平与其在已知患有给定的病况或处于发生所述病况的风险中 的人中的存在或量相比较。可将患者样品的标志物水平与已知与特定诊断相关的水平相比 较。样品的标志物水平被认为与诊断相关；即，本领域技术人员可使用标志物水平来确定患 者是否患有特定类型的疾病和相应地作出反应。或者，可将样品的标志物水平与已知与良 好结果（例如疾病的不存在等）相关的标志物水平相比较。在优选实施方案中，使一小组 标志物水平与总概率或特定结果相关联。
[0061] 诊断和/或预后测试的灵敏度和特异度不仅取决于测试的分析"质量"，它们还取 决于构成异常结果的事物的定义。实际上，接收器操作特征曲线（R0C曲线）通常通过将为 量的值针对其在"正常"（即表面上健康）与"患病"群体（即患有糖尿病、胰岛素抗药性和 /或代谢综合征的患者）中的相对频率作图来计算。对于任何特定标志物，具有疾病和不具 有疾病的受试者的标志物水平的分布将可能重叠。在这样的条件下，测试不能以100%的 准确性将正常与疾病绝对区分开，重叠的面积表示其中测试不能区分正常与疾病。选择阈 值，高于其（或低于其，取决于标志物如何随疾病变化），则测试被认为是异常的，低于其， 则测试被认为是正常的。R0C曲线下面积是察觉测量将允许修正病况的鉴定的概率的量度。 甚至当测试结果不一定给出准确数值时，亦可使用R0C曲线。只要可将结果分级，就可产生 R0C曲线。例如，对"疾病"样品的测试的结果可能按照程度（例如，1 =低，2 =正常以及 3=高）来进行分级。可使该分级与"正常"群体中的结果相关联，并且ROC曲线产生。这 些方法在本领域是公知的（参见，例如，Hanley等人1982. Radiology 143 :29-36)。优选， R0C曲线导致大于约0. 5,更优选大于约0. 7,更优选大于约0. 8,更优选大于约085,最优选 大于约0. 9的AUC。在本说明书中，术语"约"是指给定测量的+/-5%。
[0062] R0C曲线的水平轴代表（1-特异性），其随假阳性的比率增加而增加。曲线的垂 直轴代表灵敏度，其随真阳性的比率增加而增加。因此，对于选择的具体截断值，可测定 (1-特异度）的值，并且可获得对应的灵敏度。R0C曲线下面积是测量的标志物水平将允许 修正疾病或病况的鉴定的概率的量度。因此，R0C曲线下面积可用于测定测试的有效性。
[0063] 在某些实施方案中，标志物和/或标志物小组被选择来显示至少约70 %的特异 度，更优选至少约80%的特异度，更优选至少约85 %的特异度，更优选至少约90 %的特异 度，最优选至少约95%的特异度组合的至少约70 %的灵敏度，更优选至少约80%的灵敏 度，更优选至少约85 %的灵敏度，更优选至少约90 %的灵敏度，最优选至少约95 %的灵敏 度。在特别优选实施方案中，灵敏度和特异度为至少约75 %，更优选至少约80 %，更优选至 少约85%，更优选至少约90%，最优选至少约95%。在本说明书中，术语"约"是指给定的 测量的+/-5%。
[0064] 阈值水平可以例如从Kaplan-Meier分析获得，其中疾病的发生与群体中心血管 标志物的四分位数相关。根据该分析，具有高于第75百分位数的心血管标志物水平的受试 者具有显著增加的患根据本发明的疾病的风险。该结果进一步得到具有对典型风险因素的 全面调整的Cox回归分析的支持：最高百分位相对所有其它受试者与增加的患根据本发明 的疾病的风险高度显著相关。
[0065] 其它优选截断值例如为正常群体的第90、95或99百分位。通过使用比第75百分 位更高的百分位，可减少鉴定的假阳性受试者的数目，但可能错过鉴定处于中等（虽然仍 然增加的）风险中的受试者。因此，可能采用取决于其是否被认为更适合于以也鉴定"假阳 性"为代价鉴定大多数处于风险中的受试者，或其是否被认为更适合于以错过处于中等风 险的若干受试者为代价主要鉴定处于高风险中的受试者的截断值。
[0066] 通过使用个体的心血管标志物水平值以及其它预后实验室和临床参数来计算 个体的风险的其它数学可能性是例如NRI (净新分类指数）或IDI (综合判别指数）。可 根据 Pencina(Pencina MT.等人：Evaluating the added predictive ability of a new marker :from area under the ROC curve to reclassification and beyond. Stat Med. 2008 ：27:157-172)计算指标。
[0067] 在本发明的说明书中，术语"水平"涉及获自患者样品的标志多肽的浓度（优选地 表达为重量/体积；w/v)。
[0068] 如本文中在蛋白质和其它肽的背景中提及的，术语"片段"是指来源于更大的蛋 白质或肽的更小的蛋白质或肽，其因而包含更大的蛋白质或肽的部分序列。所述片段可通 过一个或多个其肽键的皂化从更大的蛋白质或肽衍生而来。标志物PCT、proANP、proBNP、 pr〇ET-l、proADM和proAVP的"片段"优选涉及在长度上具有至少6个氨基酸，最优选在长 度上具有至少12个氨基酸残基的片段。这样的片段优选可利用本文中描述的免疫测定法 来检测。
[0069] 钠尿肽原选自心房钠尿肽原（proANP)和脑钠尿肽原（proBNP)或在长度上具有至 少12个氨基酸的其片段。
[0070] 153个氨基酸的前proANP的序列示于SEQ ID N0:1中。在切割N末端信号肽 (25个氨基酸）和2个C末端氨基酸后，释放pr〇ANP(SEQ ID N0:2)。该激素原被切割成 28个氨基酸的成熟肽ANP，也称为ANP (1-28)或α -ANP，和氨基末端proANP片段（1-98) (NT-proANP，SEQ ID N0:3)。中段 proANP(MR-proANP)被定义为 NT-proANP 或包含 proANP 的至少氨基酸残基53-90 (SEQ ID NO: 4)的其任意片段。
[0071] 在根据本发明的方法的优选实施方案中，测定proANP前体片段MR-proANP的水 平。
[0072] 肾上腺髓质素的前体肽（pre-pro-肾上腺髓质素）的氨基酸序列示于SEQ ID N0:5中。肾上腺髓质素原涉及肾上腺髓质素原前体的氨基酸残基22至185。肾上腺髓质 素原（proADM)的氨基酸序列示于SEQ ID N0:6中。MR-肾上腺髓质素原（MR-proADM)涉及 proADM前体的氨基酸残基45-92。MR-proADM的氨基酸序列示于SEQ ID N0:7中。
[0073] 在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，测定proADM前体片段MR-proADM 的水平。
[0074] 加压素的164个氨基酸的前体肽（前加压素原）的序列示于SEQ ID N0:8中。加 压素涉及加压素原前体的序列的氨基酸残基19至164。加压素原的氨基酸序列示于SEQ ID N0:9中。加压素原被切割成成熟加压素、后叶激素运载蛋白II和C-末端加压素原 (CT-proAVP或肽素）。肽素涉及加压素原前体的氨基酸残基126至164。肽素的氨基酸序 列提供于SEQ ID N0:10中。后叶激素运载蛋白II包含加压素原体前体的氨基酸残基32 至124并且其序列示于SEQ ID N0:11中。
[0075] 在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，测定proAVP前体片段肽素的水 平。
[0076] 原降钙素是降钙素和抗钙素的前体。PCT 1-116的氨基酸序列示于SEQ ID N0:12 中。
[0077] 134个氨基酸的脑钠尿肽的前体肽（前proBNP)的序列示于SEQ ID NO: 13中。 proBNP涉及前proBNP的氨基酸残基27至134。proBNP的序列示于SEQIDN0:14中。 proBNP被切割成N末端proBNP (NT-pro-BNP)和成熟BNP。NT-proBNP包含氨基酸残基27 至102并且其序列示于SEQ ID NO: 15中。SEQ ID NO: 16显示包含前BNP肽原的氨基酸残 基103至134的BNP的序列。
[0078] 212个氨基酸的内皮缩血管肽-1的前体肽（前内皮缩血管肽-1原）的序列示 于SEQIDN0 :17中。ET-l原涉及前proET-l的序列的氨基酸残基18至212。ET-l原 的氨基酸序列示于SEQIDN0 :18中。ET-l原被切割成成熟ET-l、大-ET-l和C-末端 proET-1 (CT-proET-Ι)。ET-1涉及前proET-Ι的氨基酸残基53至73。ET-1的氨基酸序列 示于SEQIDN0:19中。CT-proET-l涉及前proET-l的氨基酸残基168至212。CT-proET-l 的氨基酸序列提供于SEQ ID N0:20中。大-ET-1包含前proET-Ι的氨基酸残基53至90 并且其序列示于SEQ ID N0:21中。
[0079] 在根据本发明的方法的优选实施方案中，测定前proBNP片段NT-proBNP或BNP的 水平。
[0080] 在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，测定由氨基酸1至116或2至116 或3至116组成的PCT的水平。
[0081] 在本发明的优选实施方案中，当所述测定的基线CT-proET-Ι水平高于预定阈值 水平时，患者被诊断为患有直立性低血压（全部）。优选地，预定阈值水平为30至70pmol/ L，更优选45至70pmol/L，更优选55至70pmol/L，最优选60至（高于）70pmol/L。在优选 实施方案中，当所述测定的基线CT-proET-Ι水平高于30pmol/L，优选高于40pmol/L，更优 选高于45pmol/L，更优选高于55pmol/L，更优选高于60pmol/L，最优选高于70pmol/L时，患 者被诊断为患有0H。
[0082] 更优选，当所述测定的基线CT-proET-Ι水平低于预定阈值水平时，患者被诊断为 不具有直立性低血压（全部）。优选，预定阈值水平为30至70pmol/L，更优选30至60pmol/ L，更优选30至55pmol/L，最优选30至45pmol/L。在优选实施方案中，当所述测定的基 线CT-proET-Ι水平低于70pmol/L，优选低于60pmol/L，更优选低于55pmol/L，更优选低于 45pmol/L，最优选低于30pmol/L时，患者被诊断为不患有0H。
[0083] 在本发明的另一个优选实施方案中，当所述测定的基线MR-proANP水平低于预定 阈值水平时，患者被诊断为患有CSH。优选，预定阈值水平为50至200pmol/L，更优选50至 150pmol/L，更优选50至100pmol/L，最优选50至85pmol/L。在优选实施方案中，当所述测 定的基线MR-proANP水平低于200pmol/L，优选低于150pmol/L，更优选低于100pmol/L，更 优选低于85pmol/L，最优选低于50pmol/L时，患者被诊断为不患有CSH。
[0084] 更优选，当所述测定的基线MR-proANP水平高于预定阈值水平时，患者被诊断为 患有CSH。优选，预定阈值水平为50至200pmol/L，更优选85至200pmol/L，更优选100至 200pmol/L，最优选150至200pmol/L。在优选实施方案中，当所述测定的基线MR-proANP水 平高于50pmol/L，优选高于85pmol/L，更优选高于100pmol/L，更优选高于150pmol/L，最优 选高于200pmol/L时，患者被诊断为不患有CSH。
[0085] 在本发明的另一个优选实施方案中，当所述测定的基线CT-proET-Ι水平低于预 定阈值水平时，患者被诊断为患有心动抑制反射。优选，预定阈值水平为30至70pmol/L，更 优选30至60pmol/L，更优选30至55pmol/L，最优选30至45pmol/L。在优选实施方案中，当 所述测定的基线CT-proET-Ι水平低于70pmol/L，优选低于60pmol/L，更优选低于55pmol/ L，更优选低于45pmol/L，最优选低于30pmol/L时，患者被诊断为患有心动抑制反射。
[0086] 更优选，当所述测定的基线CT-proET-Ι水平高于预定阈值水平时，患者被诊断 为未患有心动抑制反射。优选，预定阈值水平为30至70pmol/L，更优选45至70pmol/L， 更优选55至70pmol/L，最优选60至70pmol/L。在优选实施方案中，当所述测定的基线 CT-proET-Ι水平高于30pmol/L，优选高于45pmol/L，更优选高于55pmol/L，更优选高于 60pmol/L，最优选高于70pmol/L时，患者被诊断为未患有心动抑制反射。
[0087] 在本发明的另一个优选实施方案中，当所述测定的基线CT-proAVP水平低于预定 阈值水平时，患者被诊断为患有初始性0H。优选，预定阈值水平为2. 5至20pmol/L，更优选 2. 5 至 10pmol/L，更优选 2. 5 至 8pmol/L，更优选 2. 5 至 6pmol/L，最优选 2. 5 至 4pmol/L。 在优选实施方案中，当所述测定的基线CT-proAVP水平低于20pmol/L，优选低于10pmol/L， 更优选低于8pmol/L，更优选低于6pmol/L，更优选低于4pmol/L，最优选低于2. 5pmol/L时， 患者被诊断为未患有初始性0H。
[0088] 更优选，当所述测定的基线CT-proAVP水平高于预定阈值水平时，患者被诊断为 未患有初始性OH。优选，预定阈值水平为2· 5至20pmol/L，更优选4至20pmol/L，更优选6 至20pmol/L，更优选8至20pmol/L，最优选10至20pmol/L。在优选实施方案中，当所述测 定的CT-proAVP水平高于2. 5pmol/L，优选高于4pmol/L，更优选高于6pmol/L，更优选高于 8pmol/L，更优选高于10pmol/L，最优选高于20pmol/L时，患者被诊断为未患有初始性0H。
[0089] 在本发明的另一个优选实施方案中，当所述测定的基线MR-proANP水平低于预 定阈值水平时，患者被诊断为患有血管迷走神经性晕厥。优选，预定阈值水平为50至 200pmol/L，更优选 50 至 150pmol/L，更优选 50 至 100pmol/L，更优选 50 至 85pmol/L。在优 选实施方案中，当所述测定的MR-proANP水平低于200pmol/L，优选低于150pmol/L，更优选 低于l〇〇pmol/L，更优选低于85pmol/L，最优选低于50pmol/L时，患者被诊断为患有血管迷 走神经性晕厥。
[0090] 更优选，当所述测定的基线MR-proANP水平高于预定阈值水平时，患者被诊断 为未患有血管迷走神经性晕厥。优选，预定阈值水平为50至200pmol/L，更优选85至 200pmol/L，更优选100至200pmol/L，最优选150至200pmol/L。在优选实施方案中，当所 述测定的MR-proANP水平高于50pmol/L，优选高于85pmol/L，更优选高于100pmol/L，更优 选高于150pmol/L，最优选高于250pmol/L时，患者被诊断为未患有血管迷走神经性晕厥。
[0091] 上述截断值在其它测定中可能不同，如果已根据本发明中使用的测定系统对这些 截断值不同地进行了校准的话。因此，考虑到校准的差异，上述截断值可相应地用于这样不 同地校准的测定。校准中定量差异的一个可能是所述测定（例如，PCT测定）与本发明中 使用的各自生物标志物测定（例如，BRAHMS KRYPT0R PCT测定）的比较分析（使相关联） 法（通过使用两种方法测量样品中各自生物标志物（例如，PCT))。另一个可能性是利用 所述测定法测定（条件是该测试具有足够的分析灵敏度）代表性正常群体的中位生物标志 物水平，将结果与（例如在 PCT 的 EP 09011073. 5- "Procalcitonin for the prognosis of adverse events in the asymptomatic population" 中）所述的中位生物标志物水平 相比较，并基于通过该比较获得的差异重新计算校准。通过本发明中使用的校准，已测量来 自正常（健康）受试者的样品：中位（四分位距）血浆原降钙素为0.018(0. 015 - 0.022) ng/ml (在男人中）和 0.014(0. 012-0. 017)ng/ml (在妇女中）(Abbasi 等人 2010. TCEM 95:E26~E31).中位（范围）血浆 MR-proADM 为 0· 41 (0. 23-0. 64) nmol/L (Smith 等人 2009. Clin Chem 55:1593-1595)、中位(四分位距）肽素浓度为 4· 7 (2· 9 - 7· 5)pmol/L，浓度 在男人（6· 2(4. 1 - 9. 5)pmol/L)中显著高于在妇女（3· 6(2. 4 - 5. 5)pmol/l)中(Mei ier 等人 2010. Kidnev Int 77:29-36)，中位（四分位距）MR-proANP 浓度为 66 (51 _ 86) pmol/L (Melander 等人 2009. ΤΑΜΑ 302:49-57)，平均（范围）血浆 CT-proET-1 浓度为 44. 3(10. 5 - 77. 4)pmol/L(Papassotiriou 等人 2006. Clin Chem 52:1144-1151)。
[0092] 用于检测MR-proADM的自动夹心荧光测定使用针对包含人ADM原前体序列 的氨基酸68至86(SEQ ID N0:5)的肽的绵羊多克隆抗体和针对包含人ADM原前体序 列的氨基酸83至94(SEQ ID N0:5)的狀的绵羊多克降抗体（Caruhel等人2009. Clin Biochem42:725-8)。
[0093] 用于检测CT-proET-1的自动夹心荧光测定使用针对包含人pr〇ET-l序列的 氨基酸167至183(SEQ ID N0:18)的肽的小鼠单克隆抗体和针对包含人proET-Ι序列 的氨基酸183至195 (SEQ ID NO : 18)的肽的绵羊多克降抗体（Caruhel等人2008. Clin Chem54:A119)。
[0094] 在本发明的优选实施方案中，可组合至少两个生物标志物的水平。
[0095] 在本发明的一个实施方案中，例如在基线上（在立位耐力测试[例如HUT测试或 主动站立测试]开始之前）和在这样的测试的过程中或之后进行生物标志物的系列测量。 换句话，测定在立位耐力测试开始前的基线上和所述测试的过程中或之后获取的所述患者 的体液的至少两个样品的至少一种生物标志物的水平。
[0096] 在本发明的另一个优选实施方案中，可在数学算法中组合所述至少一个生物标志 物的至少两个水平。
[0097] 在其它优选实施方案中，肽素从基线至站立的增加与心动抑制反射相关。
[0098] 在另一个优选实施方案中，CT-proET-Ι从基线至站立的增加不包括直立性低血 压。
[0099] 在另一个优选实施方案中，PCT从基线至站立的增加与POTS相关。
[0100] 在其它优选实施方案中，将至少一个生物标志物的至少一个水平与一个或多个临 床参数组合，所述临床参数选自年龄、性别、体质指数（BMI)、收缩血压、舒张血压、心率、肾 小球滤过率（GFR)、总胆固醇、HDL-胆固醇、晕厥发作的次数和距离首次晕厥发作的时间。 [0101] 术语"组合"被定义为一定数目的参数的可能选择以及使用数学算法（例如，偏差 或比率）进行的这些参数至指定组的安排。例如，可计算在立位耐力测试过程中或之后采 自患者的样品的生物标志物的水平与在基线时（在立位耐力测试开始之前）采自患者的样 品的相同生物标志物的水平之间的比率。此外，可计算在立位耐力测试过程中或之后采自 患者的样品的生物标志物的水平与在基线时（在立位耐力测试开始之前）采自患者的样品 的相同生物标志物的水平之间的偏差。本文中还包括，可计算不同生物标志物之间的比率。 例如，可计算在相同时间点（例如，在基线时[在立位耐力测试开始之前]采自患者的样品 的MR-proADM与CT-proET-Ι之间的比率）或在不同时间点（例如，在基线时采自患者的样 品的MR-proADM与在立位耐力测试过程中或之后采自患者的样品的CT-proET-Ι之间的比 率）从患者采集的样品的测量的生物标志物水平之间的比率。
[0102] 在另一个优选实施方案中，可将所述至少一个生物标志物的水平组合为连续或分 类变量。
[0103] 在优选实施方案中，组合生物标志物MR-proADM和CT-proET-Ι的水平。
[0104] 在另一个优选实施方案中，组合生物标志物MR-proADM和MR-proANP的水平。
[0105] 在另一个优选实施方案中，组合生物标志物MR-proADM和肽素的水平。
[0106] 在另一个优选实施方案中，组合生物标志物CT-proET-Ι和MR-proANP的水平。
[0107] 在另一个优选实施方案中，组合生物标志物CT-proET-Ι和肽素的水平。
[0108] 在另一个优选实施方案中，组合生物标志物MR-proADM、CT-proET-Ι和MR-proANP 的水平。
[0109] 在另一个优选实施方案中，组合生物标志物MR-proADM、CT-proET-Ι和肽素的水 平。
[0110] 在另一个优选实施方案中，组合生物标志物MR-proADM、MR-proANP和肽素的水 平。
[0111] 在另一个优选实施方案中，组合生物标志物CT-proET-1、MR-proANP和肽素的水 平。
[0112] 在另一个优选实施方案中，组合生物标志物MR-proADM、CT-proET-1、MR-proANP 和肽素的水平。
[0113] 在本发明的说明书中，术语"分数"是指基于某些质量或状况（例如，生物标志物 的水平）在所述患者中存在所达到的特定成就或程度，数字表达的评级。
[0114] 在本发明的说明书中，术语"治疗分层"是指所述患者的治疗性治疗的选择和/或 调整。在本发明的优选实施方案中，就治疗性治疗对患者进行分层，例如就身体抗压动作 (例如，腿或手臂的等长PCM，如腿交叉或手紧握和手臂绷紧）、倾斜训练以及药物治疗（例 如米多君，α-拮抗剂）和心脏起搏法对患者进行分层，包括：测定所述患者的体液样品的 至少一个选自proADM、proANP、proBNP、proAVP、proET-l和PCT或它们具至少12个氨基酸 的片段的生物标志物的水平，和使所述水平与治疗性治疗相关联。
[0115] 在特别优选实施方案中，根据他们对心脏起搏器的需要对患者进行分层。最优选 地，根据他们对心脏起搏器的需要，通过测定至少CT-proET-Ι的水平来对患者进行分层， 其中低于预定阈值水平的水平表示不需要心脏起搏器的患有直立性低血压的患者，以及其 中高于预定阈值水平的水平表示需要心脏起搏器的患有心动抑制反射的患者。
[0116] 利用心脏起搏器进行心脏起搏法，所述心脏起搏器是使用通过接触心肌的电极传 递来调节心脏的搏动的电脉冲的医疗器械。由于心脏的天然起搏器不足够快，或由于心脏 的电兴奋传导系统存在堵塞，因而起搏器的主要目的是维持足够的心率。现代起搏器是可 在外部通过程序控制的，并且允许心脏病学家选择个体患者的最佳起搏模式。可暂时或永 久性地进行心脏起搏法。利用可编程起搏器的永久性起搏包括将一个或多个起搏电极经静 脉放置于心脏的室内。存在3个根据牵涉的室的数目和它们的基本操作机制分类的基本类 型的永久性起搏器：单室、双室和频率反应性起搏器。 实施例
[0117] 研究装置、检查方案和诊断指标
[0118] 在 2008 年 9 月与 2011 年 4 月之间，在Malmd的Sk^ne University Hospital 的晕厥单元（地区三级医疗中心）调查总共255位具有病因学不明的怀疑晕厥发作的患者 (119个男人，平均年龄60±21赚钱，范围15至93岁）。前101个患者直接在引入期中从 急诊科招募而来，如先前描述(Fedorowski等人2010. Europace 12:1322-1328)。当晕厥单 元正式建立时，患者的招募通过从Malmd地区的初级保健医生、急症科和门诊病人或医 院门诊部引荐来确定。通常地，在调查之前已进行了一组额外检查，例如Holter-ECG、脑成 像、起声心动描记术和运动试验-ECG或在一些情况下EEG。作为这些检查是阴性或无确定 结果的结果，患者被进一步移交至晕厥单元。具有确认心脏（即心律失常或结构性心脏和 血管疾病）、神经学、代谢、中毒和TL0C的其它明确病因学的临床体征和测试结果的患者被 先验地排除，正如那些具有晚期痴呆和身体残疾的患者一样。研究参与者被要求定期服药， 并且在测试前禁食2小时，虽然允许他们随意饮水。他们还被要求填写问卷，所述问卷调查 患者的医疗史，包括晕厥-相关症状的持续时间和频率，以及目前的药物治疗。由于物流原 因，在早晨（8至10a. m.)和下午（13至15p. m.)进行测试。
[0119] 检查基于扩展的直立倾斜试验（HUTT)方案，包括外周静脉插管、15分钟的仰 卧静息、血液取样、根据新城疫苗方案的颈动脉窦按摩（CSM) (Parry等人2009. Heart 95:416-420)、头朝上倾斜和3分钟后重复的血液取样以及根据Italian方案的可选的硝酸 甘油激发(Bartoletti等人2000. Europace 2:339-342)、由Goldstein提议的堵鼻鼓气法 (Goldstein and Sharabi 2009. Circulation 119:139-146)和最后根据 Wieling 的主动 站立测试（Wieling 等人 2007. Clin Sci (Lond) 112:157-165)。使用验证的 Nexfin 监护仪 (BMEYE，The Netherlands)连续跟踪血压（BP)和其它血液动力学参数以及ECG(Eeftinck 等人2009. Hvpertens 22:378-383)。如果在测试的特定部分过程中血液动力反应是诊断性 的，尽管如此，我们仍然继续进行至下一部分以调查诊断之间的可能重叠。如果结果是非诊 断性的或非结论性的，则主要研究人员与可能对延长的ECG监控和额外的心脏测试作决定 的心律失常专家讨论其它方法。
[0120] 当a)患者显示典型的前驱症状（眩晕、轻度头痛、晕厥前期）和/或再现的晕 厥，和b)血液动力反应满足血管迷走反射（神经介导的）晕厥（VVS、匪S)、颈动脉窦过敏 (CSH)、体位直立性心动过速综合征（POTS)和直立性低血压（0H)的诊断标准(Mova等人 2009. Eur Heart T 30:2631-2671 :Parrv 等人 2009. Heart95:416-420)，则测试是诊断性 的。简而言之，VVS被定义为与明显的低血液和/或心动过缓/心搏停止的特征模式相关 的晕厥的再现，CSH被定义为大于等于50mm Hg的SBP的下降和/或大于3秒的心搏停止， 0H被定义为大于等于20mm Hg的收缩BP(SBP)的持续下降和/或大于等于10mm Hg的舒张 BP (DBP)的下降，或小于90mmHg的收缩BP (典型0H，在3min的倾斜期内；和延迟0H，在3至 20min之间），而POTS具有大于30/min的心率增加或在站立位时大于120/min的心运过速 的直立耐受不能的特征症状。心动抑制性晕厥被定义为达到少于40bpm(超过10秒）的心 室率的心率下降或大于3秒的心搏停止，然而血管减压反射被定义为在晕厥时与其峰值相 差小于等于10%的心率下降(Brignole等人2000. Europace2:66-76)。当在站立后15秒 内瞬间BP下降大于40mmHg (对于SBP)和/或大于20mmHg (对于DBP)，伴随脑低灌注的症 状发生并且患者报告典型的晕厥情况(Wieling等人2007. Clin Sci (Lond)。112:157-165) 时，呈现初始性〇H。
[0121] 如果在倾斜期中直立性挑战在常规0H标准（大于等于20mm Hg的持续SBP下 降）方面是阳性的，但患者未再现症状或结果是不确定的，如果站立SBP>90mmHg的话， 我们通常继续进行硝酸甘油激发。如果患者发生低血压和心动过速而无特征性血液动 力血管迷走神经模式和伴随症状，则硝酸甘油激发不是诊断性的(Moya等人2009. Eur Heart 了 30:2631-2671)。为了确定诊断的准确性，随后使用由Nexfin系统提供的NexfinO PC(BMEYE，The Netherlands)(被开发来显现、重演和再分析测试测量（incl. ECG)的软件 工具）离线检查数字测试记录。
[0122] 生物标志物测量
[0123] 在开始测试之前以仰卧位体积15分钟后收集血液样品。从收集后于_80°C冷冻 的血液样品（塑料热管中的16χ250μ 1的EDTA血浆等分）测量生物标志物。按照制造商 的说明书使用下列测定法测量肽素（C末端精氨酸加压素原；CT-proAVP)，精氨酸加压素前 体的稳定肤(Fenske 等人 2009. .T Clin Endocrinol Me tab 94 :123 - 129)、C 末端内皮缩 血管肽-1 前体片段（CT-proET-1) (Papassotiriou 等人 2006. Clin Chem 52:1144-1151)、 心房钠尿肤原中段（MR-proANP) (Morgenthaler 等人 2004. Clin Chem 50:234-236)、肾 上腺髓质素原中段（MR-proADM) (Caruhel等人2008. Clin Chem 54 :A119)和原降钙素 (Morgenthaler 等人 2002. Clin Chem 48 :788-790) ： Thermo Scientific B.R.A.H.M.S CT-proAVP LIA ；Thermo Scientific B · R · A · Η · M · S CT-proET-1 KRYPTOR ；Thermo Scientific B · R · A · Η · M · S MR-proANP KRYPTOR ;Thermo Scientific B · R · A · Η · M · S MR-proADM KRYPTOR ；Thermo Scientific B*R*A*H*M*S PCT sensitive LIA (BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Germany)〇
[0124] 统计分析
[0125] 我们使用逻辑回归模型来评估特定诊断与分析的生物标志物之间的关系。我 们进行多重变量调整后逻辑回归分析（multivariate adjusted logistic regression analysis)，将VVS、CSH、OH、POTS、初始性OH、心动抑制和血管减压反射作为应变量输入， 同时分别添加每一个生物标志物作为协变量。针对年龄、性别和BMI调整模型1，然而针对 SBP、DBP、心率和估计的GFR额外地调整更加综合的模型2。在下一阶段，同时在模型2中 输出与特定诊断显著相关的生物标志物，我们进行协变量的后退消去法以鉴定特定晕厥诊 断的独立预测因素。随后我们评估晕厥诊断在对应的显著相关的生物标志物的血浆浓度的 四分位数间的分布。我们应用逻辑回归模型1和2,输入四分位数（第一或第四），以特定 诊断的最低频率作为参照。CSH的分布限定于超过60岁的那些人，因为该状态在更年轻的 个体中极其罕见。未评估POTS的分布，因为仅有11个个体具有POTS诊断。使用IBM SPSS 统计软件19. 0版（SPSS Inc.，Chicago, IL)进行所有计算。所有检验是双侧的，p〈0. 05被 认为是统计上显著的。
[0126] 结果
[0127] 如可在表1中看到的，包括的患者报告在8年的时间中发生平均7次晕厥发作。 此外，10个患者中有4个报告他们因高血压而被治疗，最常见地利用β -阻断剂、RAAS抑 制剂和钙离子通道阻断剂进行治疗。估量的生物标志物的静息血浆浓度（Resting plasma concentrations)示于表2中。基于扩展HUTT的结果，总共142个（56% )患者被诊断为 患有VVS，85个（33% )被诊断为患有0H，47个（18% )被诊断为患有CSH，11个（4% )被 诊断为患有POTS。直立性低血压在典型（η = 42)与延迟形式（η = 43)之间等同地分布。 在30个患者（12% )中，未发现明确的晕厥病因学，但在它们的两个中长期ECG监控显示晕 厥过程中的缓慢心律失常，随后用起搏器治疗他们。诊断之间不存在重叠，因为0Η和POTS 频繁地促成VVS (分别地在31和6个患者中），18个具有VVS的患者也满足CSH标准。总 共35个患者（13. 7% )在测试过程中具有心动抑制性晕厥；在这些患者中，29个归因于血 管迷走反射，6个归因于颈动脉窦反射。平行地，32个患者（12.5% )在晕厥过程中显示血 管减压模式。在179个具有表明初始性0H的历史的患者中进行主动站立测试；在这些患者 中，40个（22. 3% )满足初始性直立性低血压的诊断标准。
[0128] 不同晕厥诊断的单标志物值的盒须图示于图2至6中。
[0129] 在单标志物多重变量调整后模型中，VVS与更低的MR-proANP、MR-proADM、 CT-pr〇ET-l、CT-pr〇AVP和原降钙素显著相关，然而0H与更高的肾素和CT-proET-1显著相 关（表出。此外，CSH与更低的MR-proANP、MR-proADM和CT-proET-Ι相关，对于心动抑制 反应亦如此。血管减压反射与更低的原降钙素和MR-proADM弱相关（p〈0. 10)。最后，POTS 与更低的原降钙素显著相关，初始性OH与更低的CT-proAVP相关（表$。在多重标志物 调整后模型2中，在协变量的后退消去后，VVS与更低的MR-pr〇ANP(比值比[OR]/ -个标 准差[SD] :0· 51，0· 34-0. 77 ;p = 0· 001)和 CT-proET-1 (OR :0· 38, 0· 23-0. 62 ;ρ〈0· 001)、 更高的静息38?((?/10臟取：1.17,95%的置信区间：1.03-1.32，？ = 0.015)以及更低的静 息心率（0R/10bpm :0· 76, (λ 61-0. 95, ρ = (λ 020)相关。平行地，更高的 CT-proET-1 和肾素 (分别地，OR/ 一个 SD :1. 94, 1. 27-2. 96 ;p = 0· 002,和 1. 34, 1. 01-1. 78 ;p = 0· 041)和增 龄（0R/10 岁：L 23, L 04-L 42，p = 0· 015)预示着 0H。此外，CSH 与更低的 MR-proANP(OR/ 一个 SD :0· 40, 0· 24-0. 66 ;ρ〈0· 001)和增龄（0R/10 岁：2. 38, 1. 86-2. 92 ;ρ〈0· 001)相关， 然而POTS与更低的原降钙素（OR/-个SD :0.21,0. 06-080 ;p = 0.023)和年龄（0R/10 岁：0· 46, 0· 44-0. 63 ;ρ = 0· 001)、女性（OR :10· 0, 1. 1-90. 9 ;ρ = 0· 043)和更高的静息心 率（0R/10bpm :1· 94, 1. 0-2. 19 ;ρ = 0· 037)相关。初始性 0Η 与更低的 CT-proAVP(OR/ - 个 SD :0· 57, 0· 36-0. 89，p = 0· 013)、更高的静息 DBP(0R/10mmHg :1· 11，1. 03-1. 18，p = 〇. 003)相关，并且相反地，与更低的静息 SBP(0R/10mmHg :0. 68, 0. 56-0. 85 ;p = 0. 002)和 估计的肾小球滤过率（eGFR) (0R/10ml/min :0.86,0. 78-0. 96 ;p = 0.012)相关。此外， 更低的CT-proET-1预示着测试期间的心动抑制性晕厥（OR/ -个SD :0. 34, 0. 22-0. 53 ; ρ〈0· 001)，对于更低的静息心率（0R/10bpm 减少：1. 45, 1. 04-1. 89 ;p = 0· 037)和男 性（OR :2. 70, 1. 17-6. 32 ;p = 0. 021)亦如此。血管减压反射与原降钙素（OR/-个SD : 0· 59, 0· 35-1. 00 ;p = 0· 050)反相关。
[0130] 如图7-12中所示，晕厥诊断与鉴定的预测生物标志物的四分位数之间的关系 遵循两个不同的模式：线性和阈值样（threshold-like)模式。线性模式表征MR-proANP 与VVS(图7)之间以及CT-proET-1与VVS(图8)、0H(图9)和心动抑制反射（图11) 之间的关系，然而观察到CT-proAVP与初始性0H之间的阈效应（图12)。将MR-proANP 与CSH之间的关系（图10)与线性和阈值样效应组合。对于与血管迷走反射相关的 MR-proANP(〈51pmol/L)和CT-proET-1 (<46pmol/L)的最低四分位数，以及对于与初始性 0H相关的CT-pr〇AVP(〈3. lpmol/L)的最低四分位数观察到最强的阳性预测值。平行地， CT-proET-Ι的最低四分位数预示0H为阴性，然而CT-proET-Ι的最高四分位数（>69pmol/ L)通常排除心动抑制反射。在完全调整后模型2中每一对晕厥诊断和对应生物标志物的四 分位数的逻辑回归分析的概述示于表4中。
[0131] 单个标志物和不同晕厥诊断的接收者操作特征曲线（R0C)的曲线下面积（AUC)概 述于表5中。不同的截断值用于测定每一个标志物的对应灵敏度和特异度，以诊断晕厥的 各自形式(表6至12)。
[0132] 对于标志物组合，进行对数转换的生物标志物值的逻辑回归。用于的初始性0H 的诊断的 MR-proANP、MR-proADM、CT-proET-Ι 和肽素的组合表现好于（0R (λ 62[95% CI 0· 41 - 0· 91])单个标志物 MR_proANP(0R 0· 70[95 % Cl 0· 48 - 1· 00])、MR_proADM(0R 0· 72 [95 % Cl 0· 50 - 1· 02])、CT-proET-1 (OR 0· 70 [95 % Cl 0· 51-0. 98])或肽素 （OR 0.65[95% Cl 0.44 - 0. 96]。此外，用于血管迷走神经性晕厥的诊断的MR-proANP、 MR-proADM、CT-proET-1 和肽素的组合表现好于（OR 0· 29[95% CI 0· 20 - 0· 42])单个 标志物11?-?1'(^即（(《0.38[95%(：1 0.28 - 0.52])、]\?-?1'(^01((?0.35[95%(：10.25-0· 49])、CT-proET-1 (0R 0· 36 [95 % CI 0· 24-0. 52])或肽素（0R0. 51 [95 % CI 0· 38 - 0·68])。
[0133] 对于系列测量，使用δ对数转换的生物标志物值应用逻辑回归。肽素从基线 至站立的增加显示了与心动抑制反射的强相关性（OR 1.48[95%CI 1.11-1.98])。 CT-proET-1从基线至站立的增加排除了直立性低血压（OR 0.84[95% Cl 0.65 - 1.08])， 然而PCT从基线至站立的增加与POTS显著相关（OR 2. 42 [95% Cl 1. 04 - 5. 62])。
[0134] 此外，我们的结果显示肽素从基线至站立的增加与自发VVS(非由硝酸甘油应用 刺激的）密切相关（OR 2. 54[95% Cl 1. 47-4. 39])，然而MR-proANP从基线至站立的增加 与自发 VVS 反相关（0R 0· 79 [95 % CI 0· 57 - 1. 10])。
[0135] 表1 :研究参与者的临床特征（N = 255)
[0136]

【权利要求】
1. 一种用于患者的晕厥的诊断和/或预后和/或评估和/或治疗分层的方法，所述方 法包括： -测定所述患者的体液样品中至少一个生物标志物的水平，所述生物标志物选自 proET-1、proADM、proANP、proBNP、proAVP 和 PCT 或它们至少 12 个氨基酸的片段， -使至少一个生物标志物或其片段的所述水平与晕厥的诊断和/或预后和/或评估和 /或治疗分层相关联。
2. 权利要求1的方法，其中在立位耐力测试，优选HUT测试或主动站立测试开始之前的 基线时采集样品。
3. 权利要求1和2的方法，其中在立位耐力测试，优选HUT测试或主动站立测试过程中 或之后采集所述患者的体液的至少一个样品。
4. 权利要求1至3的方法，其中测试所述患者的至少两个体液样品中至少一个生物标 志物或其片段的水平，所述样品是在立位耐力测试，优选HUT测试或主动站立测试开始之 前的基线时和所述测试过程中或之后采集的。
5. 权利要求1至4的方法，其中在数学算法中组合至少一个生物标志物或其片段的水 平。
6. 前述权利要求的任一项的方法，其中将至少一个生物标志物的至少一个水平与至少 一个临床参数组合，所述参数选自年龄、性别、体质指数（BMI)、收缩血压、舒张血压、心率、 肾小球滤过率（GFR)、总胆固醇、HDL-胆固醇、年龄、性别、晕厥发作的次数和距离首次晕厥 发作的时间。
7. 前述权利要求的任一项的方法，其中进行选自神经介导性晕厥（匪S)、直立性低血 压和心源性晕厥的疾病的至少两种的鉴别诊断。
8. 权利要求7的方法，其中所述匪S选自VVS、CSH、血管减压反射、心动抑制反射和混 合反射。
9. 权利要求7或8的方法，其中所述直立性低血压选自初始性0H、典型0H、延迟（进行 性）0H 和 POTS。
10. 权利要求7至9的任一项的方法，其中所述心源性晕厥选自因心律失常引起的心源 性晕厥和因结构性疾病引起的心源性晕厥。
11. 前述权利要求的任一项的方法，其中所述样品选自血液样品、血清样品、血浆样品、 脑脊髓液样品、唾液样品和尿样品或前述样品任一种的提取物。
12. 前述权利要求的任一项的方法，其中测定选自MR-proADM、NT-proBNP、BNP、 MR-proANP、肽素、CT-proET-l、PCT 1-116、PCT 2-116 或 PCT 3-116 的前体片段的水平。
13. 前述权利要求的任一项的方法，其中当所述测定的基线CT-proET-1水平低于预定 阈值水平时，所述患者被诊断为未患有直立性低血压。
14. 前述权利要求的任一项的方法，其中当所述测定的基线MR-proANP水平高于预定 阈值水平时，所述患者被诊断为未患有CSH。
15. 前述权利要求的任一项的方法，其中当所述测定的基线CT-proET-Ι水平高于预定 阈值水平时，所述患者被诊断为未患有心动抑制反射。
16. 前述权利要求的任一项的方法，其中当所述测定的基线CT-proAVP水平高于预定 阈值水平时，所述患者被诊断为未患有初始性0H。
17. 前述权利要求的任一项的方法，其中当所述测定的基线MR-proANP水平高于预定 阈值水平时，所述患者被诊断为未患有血管迷走神经性晕厥。
18. 前述权利要求的任一项的方法，其中使用针对包含人pr印roADM序列（SEQ ID NO: 5)的氨基酸68至86的肽的第一抗体和针对包含人preproADM序列（SEQ ID N0:5)的氨 基酸83至94的肽的第二抗体，通过夹心免疫测定法来检测MR-proADM。
19. 前述权利要求的任一项的方法，其中使用针对包含人pr〇ET-l序列（SEQ ID NO: 18)的氨基酸167至183的肽的第一抗体和针对包含人proET-1序列（SEQ ID NO :18)的 氨基酸183至195的肽的第二抗体，通过夹心免疫测定法来检测CT-proET-1。
20. 前述权利要求的任一项的方法，其中就治疗性治疗，优选身体抗压动作，特别优 选腿或手臂的等长PCM，如腿交叉或手紧握和手臂绷紧，和倾斜训练以及药物治疗，优选 α -拮抗剂例如米多君的施用，和心脏起搏法对患者进行分层。
21. 权利要求20的方法，其中通过测定CT-proET-Ι的水平根据他们对心脏起搏器的需 要来对患者进行分层，其中低于预定阈值水平的水平表示不需要心脏起搏器的患有直立性 低血压的患者，以及其中高于预定阈值水平的水平表示需要心脏起搏器的患有心动抑制反 射的患者。
22. 选择自 proADM、proANP、proBNP、proAVP、proET-Ι 和 PCT 或其至少 12 个氨基酸的 片段的一个或多个生物标志物的用途，其用于晕厥的诊断和/或预后和/或评估和/或治 疗分层。
【文档编号】G01N33/68GK104115012SQ201380009967
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年4月12日 优先权日:2012年4月26日
【发明者】J·施特鲁克, O·梅兰德, A·费多罗夫斯基 申请人:B.R.A.H.M.S有限公司