染料的光敏化化学漂白的制作方法
本发明涉及生物样品中生物标志物的检测。更具体地，本发明涉及在检测生物样品中的多靶标的方法中采用光敏化化学漂白，包括任选采用添加剂，因而防止光敏化化学漂白过程期间的靶标修饰。还提供用于进行该新方法的试剂盒和系统，以及采用该新方法生成的生物样品的图像。
背景
多种方法可用于生物学和医学中，以检测生物样品中的不同靶标。例如，组织切片和其它细胞学制品中的蛋白质分析可使用组织化学、免疫组织化学(IHC)或免疫荧光的技术进行。生物样品的蛋白质分析还可使用固态免疫测定法例如使用蛋白质印迹技术或使用可例如通过使用流式细胞术进行的基于细胞的测定法进行。
许多现有技术一次仅可检测单一样品中的几个靶标(例如IHC或基于荧光的蛋白质印迹，其中可检测的靶标数量受到基于荧光的检测系统的限制)。靶标的进一步分析可需要使用来自所述来源的额外生物样品，这限制了测定靶标的相对特征(例如生物样品中多个生物靶标的存在、不存在、浓度和/或空间分布)的能力。此外，在某些情况下，可能可获得有限量的样品以供分析之用或所述单个样品可能需要进一步的分析。
重复分析单个样品的方法描述于美国专利号7,629,125和美国专利号7,741,046中。特别地，美国专利号7,741,046提供检测生物样品中的多靶标的方法，其包括使用氧化以灭活信号发生器(例如，漂白荧光染料)。氧化反应通过使用氧化剂例如过氧化氢完成。
此外，通过使信号发生器连续曝光于照射，即通过光漂白，可灭活信号。类似于通过氧化的信号灭活，这个过程可能是漫长的，并且可能不进行至完成，导致信噪比减少。此外，使样品连续曝光于照射可损害生物样品。
然而，这些现有方法有时确实影响蛋白表位，在此情况下，这些表位必须在第一轮中被检测，或者必须采用替代表位或下游途径蛋白的抗体来研究其对疾病的作用。在一些情况下，对于后续数轮测试的靶标，抗原性进一步增强，防止有意义的表达比较。
采用清除剂清除自由基、单线态氧的概念是已知的。然而，该概念并未用于针对生物样品的信号循环。Free radicals and singlet oxygen scavengers: Reaction of a peroxy-radical with β-carotene, diphenyl furan and 1,4-diazobicyclo(2,2,2)-octane (自由基和单线态氧清除剂：过氧自由基与β-胡萝卜素、联苯呋喃和1,4-重氮二环(2,2,2)辛烷的反应), Biochemical and Biophysical Research Communication,Volume 98, Issue 4, 1981年2月27日, 901–906页。Oxygen Scavengers and Sensitizers for Reduced Oxygen Inhibition in Radical Photopolymerization(用于在自由基光聚合中减少氧抑制的氧清除剂和敏化剂) Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, Volume 46, Issue 20, 6916。Reduced Photobleaching of Conjugated Polymer Films through Small Molecule Additives (通过小分子添加剂减少共轭聚合物膜的光漂白), Macromolecules 2008, 41, 8306-8308。
因此，仍存在用于连续分析生物学靶标的快速、更温和且更灵敏的方法的需求。
简述
本文公开新的用于高通量多路复用样品分析的方法。所述方法采用，例如信号循环过程，其中在各个循环中，光反应步骤允许相同的信号发生器例如荧光团重复用于随后的循环中以检测另外的标记物，例如蛋白质。可采用这些方法，例如用于连续地分析生物样品，以尤其辨别生物样品中多个生物靶标的存在、不存在、浓度和/或空间分布。光反应步骤可包括应用电子转移试剂，例如硼酸盐，并启动光反应，例如，通过用可见光照射样品，以灭活信号发生器，例如，荧光染料。光反应步骤可进一步包括防止由光反应副产物，例如自由基和单线态氧引起的靶标修饰的添加剂。
在一些实施方案中，所公开方法的优点可包括在各个循环中迅速破坏信号。例如，在一些例子中，与常规方法中超过15分钟相比，在约100毫秒内观测到猝灭。在一些实施方案中，所公开的方法还可表征为甚至在例如导致信噪比增加的高表达靶标中缺乏残留的荧光。此外，所公开的方法不损害生物样品或其成分，例如，抗原决定部位，以致相同的样品可以在许多循环中使用。同样，在一些实施方案中，当与荧光染料的直接光漂白作用比较时，所公开的方法是有利的，因为它们不需要可损害生物样品成分的高功率光。
在一些实施方案中，本发明是一种探测生物样品中的多靶标的方法，其包括：
(a) 使至少一个探针结合存在于包含多靶标的生物样品中的一个或多个靶标；
(b) 检测来自步骤(a)中结合的至少一个探针的信号；
(c) 使包含步骤(a)的结合探针的样品与电子转移试剂和防止步骤(d)期间靶标修饰的添加剂接触；
(d) 照射步骤(c)的样品；
(e) 使至少一个探针结合存在于步骤(d)的样品中的一个或多个靶标；和
(f) 检测来自步骤(e)中结合的探针的信号。
在一些实施方案中，步骤(a)中的探针包含光信号发生器，和步骤(b)中检测到的信号是光信号。在另外的实施方案中，光信号发生器是荧光信号发生器，和在步骤(b)中检测到的光信号是荧光信号。
在一些实施方案中，步骤(a)包括使一个以上的探针结合两个或更多个靶标。
在一些实施方案中，步骤(d)中照射样品在缓冲剂的存在下进行。在一些实施方案中，照射在pH 5-9下进行。在一些实施方案中，照射在pH 6-8下进行。
在一些实施方案中，步骤(d)中照射样品在4-50℃的温度下进行。在优选的实施方案中，照射样品在20-30℃的温度下进行。
在一些实施方案中，步骤(d)中照射样品通过使样品暴露于350 nm -1.3 μM波长的光来完成。在一些实施方案中，照射样品通过使样品暴露于400-700 nm波长的光来完成。
在一些实施方案中，电子转移试剂是硼酸盐。在一些实施方案中，硼酸盐由以下结构式表示：
,
其中：
R1、R2和R3各自独立地是烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)烷基氨基、氨基、羟基、氰基、卤素或硝基，
R4是烷基、烯基或炔基，其中烷基、烯基或炔基任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)烷基氨基、氨基、羟基、氰基、卤素或硝基，和
M+选自有机和无机阳离子。
在一些实施方案中，R1、R2和R3各自是芳基。在一些实施方案中，芳基是苯基。在一些实施方案中，苯基是未取代的苯基。
在一些实施方案中，R4是任选取代的烷基。在一些实施方案中，R4为未取代的丁基。
在一些实施方案中，R1、R2和R3各自是任选取代的芳基和R4是任选取代的烷基。在进一步的实施方案中，R1、R2和R3各自为未取代的苯基和R4为未取代的丁基，和硼酸盐为三苯基丁基硼酸盐。
在一些实施方案中，电子转移试剂是高水溶性硼酸盐。在一些实施方案中，高水溶性硼酸盐是聚乙二醇化硼酸盐。在其它实施方案中，高水溶性硼酸盐是四烷基硼酸盐。
在一些实施方案中，M+是无机阳离子。在一些实施方案中，无机阳离子是Li+、Na+或K+。
在一些实施方案中，探针包含结合剂和信号发生器。在一些实施方案中，信号发生器是荧光信号发生器。在一些实施方案中，荧光信号发生器包含花青染料。在一些实施方案中，花青染料是Cy3或Cy5。
在一些实施方案中，花青染料是Cy3；照射步骤(e)中的样品通过使用光学滤波器完成，包括使样品暴露于520-580 nm波长的光；并导致Cy3的选择性光激发。
在一些实施方案中，花青染料是Cy5；照射步骤(e)中的样品通过使用光学滤波器完成；包括使样品暴露于620-680 nm波长的光；并导致Cy5的选择性光激发。
在一些实施方案中，步骤(a)中的生物样品包括细胞器、全细胞或组织切片。在一些实施方案中，样品包括蛋白质、碳水化合物或核酸。
在一些实施方案中，步骤(c)-(f)重复一次或多次。在一些实施方案中，步骤(c)-(f)重复至少5、至少15、至少30、至少60、至少100或至少150次。在一些实施方案中，步骤(c)-(f)重复25-30次。在其它实施方案中，步骤(c)-(f)重复2-10次。
在一些实施方案中，步骤(c)和(d)进行约1毫秒至约60分钟。在一些实施方案中，步骤(c)和(d)进行约100毫秒至约15分钟。在一些实施方案中，步骤(c)和(d)进行约1秒至约5分钟。
在一些实施方案中，步骤(c)和(d)在4-50℃的温度下进行。在优选的实施方案中，步骤(c)和(d)在20-30℃的温度下进行。
在一些实施方案中，方法还包括测量在检测步骤(b)、步骤(f)或步骤(b)和(f)中检测到的信号的一个或多个强度值。在一些实施方案中，该方法进一步包括使强度值与存在于样品中的靶标的数量相关。
在一些实施方案中，步骤(a)的探针和步骤(e)的探针各自包含信号发生器。在一些实施方案中，步骤(a)中的信号发生器与步骤(e)中的信号发生器相同。在其它实施方案中，步骤(a)中的信号发生器不同于步骤(e)中的信号发生器。
在一些实施方案中，在步骤(b)和步骤(f)中检测的信号两者在单一检测通道中是可检测的。在其它实施方案中，步骤(b)或步骤(f)中检测的信号在不同的检测通道中是独立地可检测的。
在一些实施方案中，不同于探针的生物样品成分没有明显变化。
在一些实施方案中，在步骤(d)之后未检测到可检测的信号。
在一些实施方案中，信号发生器包含发色团或拉曼活性标签(Raman- active tag)。
在一些实施方案中，防止靶标修饰的添加剂是自由基清除剂。在优选的实施方案中，自由基清除剂选自抗坏血酸、没食子酸正丙酯、巯基乙醇、盐酸半胱氨酸、叔丁基羟基甲苯、环庚三烯、邻苯二甲酸二辛酯、1,4-二氢-o-甲苯酰胺、α-生育酚和trolox。
在其它实施方案中，防止靶标修饰的添加剂是单线态氧的淬灭剂。在优选的实施方案中，单线态氧的淬灭剂选自抗坏血酸、α-生育酚、姜黄素(curcurmin)和DABCO。
在一些实施方案中，探测生物样品中的多靶标的方法还包括在步骤(d)之后，用有效从样品中去除残余电子转移试剂的洗涤溶液洗涤样品。在一些实施方案中，可向洗涤溶液中添加一种或多种促成剂(enabler)，其可通过增加残余电子转移试剂在洗涤溶液中的溶解性而促进残余电子转移试剂的去除。在一些实施方案中，这些促成剂包括有机溶剂、阳离子试剂、离液剂、去污剂或其组合。在优选的实施方案中，促成剂是乙醇。在最优选的实施方案中，促成剂是70%乙醇。
在一些实施方案中，本发明是一种探测生物样品中的多靶标的方法，其包括：
(a) 使多个探针结合包含多靶标的生物样品中存在的多靶标；
(b) 检测来自步骤(a)中结合的第一组探针的第一组信号；
(c) 使包含步骤(a)的结合探针的样品与电子转移试剂和防止步骤(d)中靶标修饰的添加剂接触；
(d) 照射步骤(c)的样品；
(e) 自步骤(a)中结合的第二组探针生成第二组信号；
(f) 检测第二组信号。
在一些实施方案中，步骤(d)中样品的照射启动通过光敏化化学漂白基本上灭活信号发生器的光反应。在一些实施方案中，光反应包含分子间的电子转移。在其它实施方案中，光反应包含分子内的电子转移。
在一些实施方案中，信号发生器被不可逆地改变。在一些实施方案中，信号发生器通过由光敏化化学漂白灭活信号发生器的光反应而不可逆地改变。
在一些实施方案中，探测生物样品中的多靶标的方法还包括在步骤(d)之后，用有效从样品中去除残余电子转移试剂的洗涤溶液洗涤样品。在一些实施方案中，洗涤溶液包含乙醇。
在一些实施方案中，本发明是高通量多路复用(high throughput multiplexing)生物样品分析方法，该方法包括：
信号循环过程，其中在各个循环中，染色和成像之后是应用电子转移试剂和防止靶标修饰的添加剂和照射生物样品。
在一些实施方案中，所述高通量多路复用生物样品分析方法在每一个循环中包括用有效从样品中去除残余电子转移试剂的洗涤溶液洗涤样品。在一些实施方案中，洗涤溶液包含乙醇。
在一些实施方案中，所述方法允许快速信号循环而不显著改变不同于探针的生物样品的成分。
在一些实施方案中，本发明是用于漂白探测生物样品中多靶标的信号的试剂盒，其包含：
电子转移试剂，当其与信号发生器接触时，能够在照射时漂白信号发生器；和
在信号发生器的光敏化化学漂白期间防止靶标修饰的添加剂。
在某些实施方案中，用于漂白信号的试剂盒可进一步包括用于探测生物样品中多靶标的另外组分。例如，试剂盒可包括抗原修复溶液。试剂盒还可包括阻断探针与生物样品非特异性结合的溶液。在其它实施方案中，试剂盒还可包括促成剂，当将该试剂加入洗涤溶液时有助于去除在信号去除后的残余硼酸盐。
在一些实施方案中，本发明是采用所述试剂盒漂白信号的方法，其目的是实现探测生物样品中多靶标的信号循环过程，所述方法包括：在检测来自结合存在于生物样品中的一个或多个靶标的至少一个探针的信号后，使样品与电子转移试剂和防止靶标修饰的添加剂接触；和照射样品。
在一些实施方案中，本发明是探测生物样品中的多靶标的试剂盒，其包含：
包含与信号发生器偶联的结合剂的多个探针；
电子转移试剂，当其与信号发生器接触时，能够在照射时漂白信号发生器；和
在信号发生器的光敏化化学漂白期间防止靶标修饰的添加剂。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包括试剂盒使用说明。
在一些实施方案中，本发明是一系列描绘光学标记的生物靶标的至少两个图像，其中：
在探测生物样品的多靶标的过程中获得图像，其中所述过程包括：
(a) 使至少一个光学探针结合存在于包含多靶标的生物样品中的一个或多个靶标；
(b) 检测来自步骤(a)中结合的光学探针的信号；
(c) 使包含步骤(a)的结合的光学探针的样品与电子转移试剂和防止步骤(d)中靶标修饰的添加剂接触；
(d) 照射步骤(c)的样品；
(e) 使至少一个光学探针结合存在于步骤(d)的样品中的一个或多个靶标；和
(f) 检测来自步骤(e)中结合的光学探针的信号。
在一些实施方案中，本发明是探测生物样品中的靶标的方法，其包括：
(a) 使至少一个探针结合存在于包含多靶标的生物样品中的一个或多个靶标；
(b) 检测来自步骤(a)中结合的探针的信号；
(c) 使包含步骤(a)的结合探针的样品与电子转移试剂和防止步骤(d)中靶标修饰的添加剂接触；和
(d) 照射步骤(c)的样品。
在一些实施方案中，本发明是一种探测生物样品中的多靶标的方法，其包括：
(a) 使至少一个探针结合存在于包含多靶标的生物样品中的一个或多个靶标；
(b) 使至少一个对照探针与存在于样品中的一个或多个靶标结合；
(c) 检测来自步骤(a)中结合的探针的信号和来自步骤(b)中的结合的对照探针的对照信号；
(d) 使步骤(c)中的样品与电子转移试剂和防止步骤(e)中靶标修饰的添加剂接触，所述电子转移试剂能够选择性地与探针反应而不与对照探针反应；
(e) 照射步骤(d)的样品；
(f) 使至少一个探针结合存在于步骤(e)的样品中的一个或多个靶标；和
(g) 检测来自步骤(f)中中结合的探针的信号。
在一些实施方案中，步骤(a)和(b)同时地进行。在一些实施方案中，步骤(g)还包含检测来自步骤(b)中的结合的对照探针的信号。
在一些实施方案中，探测生物样品中的多靶标的方法还包括在步骤(e)之后，用有效从样品中去除残余电子转移试剂的洗涤溶液洗涤样品。在一些实施方案中，洗涤溶液包含乙醇。
在一些实施方案中，本发明是用于光敏化化学漂白在流动池装置中装载/捕获的生物样品的自动化方法，包括以下自动化步骤：
(a) 使至少一个探针结合存在于生物样品中的一个或多个靶标；
(b) 检测来自步骤(a)中结合的至少一个探针的信号；
(c) 用电子转移试剂和任选防止后续样品照射期间的靶标修饰的添加剂填充流动池；
(d) 通过暴露于光而照射样品，以灭活来自探针的信号；
(e) 用至少一个其它探针重复步骤(a)和(b)，用于另一轮成像。
在某些实施方案中，在样品照射后，所述自动化方法还包括任选洗涤步骤以洗出电子转移试剂和添加剂。在其它实施方案中，电子转移试剂和添加剂可在后续探针结合步骤a)期间被洗出。在其它实施方案中，电子转移试剂和添加剂可在任选步骤期间被洗出，所述任选步骤去除后续信号检测步骤b)之前的过量探针。这些后面的实施方案特别适于高溶解性硼酸盐电子转移试剂。
在某些用于光敏化化学漂白的自动化方法的实施方案中，样品照射通过采用光学滤波器、显微镜物镜和平移台而将样品特定区域暴露于光来实现。在其它实施方案中，样品照射通过将整个样品同时暴露于光来实现。
附图描述
图1是显示Cy3染料与不同浓度的三苯基丁基硼酸锂盐温育并照射4或10分钟后，于550 nm处吸光度的曲线图的灰度图像(grayscale image)。
图2显示在光敏化化学漂白之前和之后，用Cy3-缀合的细胞角蛋白染色的样品的灰度图像。
图3显示在光敏化化学漂白之前和之后，用Cy5-缀合的泛钙粘蛋白(pan cadherin)染色的样品的灰度图像。
图4显示在光敏化化学漂白之前和之后BODIPY染料的荧光光谱的灰度图像。
图5显示在光敏化化学漂白之前和之后罗丹明染料的荧光光谱的灰度图像。
图6显示光敏化化学漂白之前和之后，1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(DDAO)染料的荧光光谱的灰度图像。
图7显示如实施例部分所述，在所列各种条件下对TMA进行光诱导电子转移漂白后用荧光标记的TRIM29抗体染色的样品的组织微阵列图像。显示淬灭剂防止由通过光诱导电子转移过程漂白引起的TRIM29表位损坏。
图8显示如实施例部分所述，用荧光标记的MUC1抗体染色的样品的组织微阵列图像。显示淬灭剂防止由通过光诱导电子转移过程漂白引起的MUC1表位损坏。
图9显示如实施例部分所述，用荧光标记的Napsin A抗体染色的样品的组织微阵列图像。显示淬灭剂防止由通过光诱导电子转移过程漂白引起的Napsin A表位损坏。
图10：残余硼酸盐对来自后续染色和成像的信号的影响以及用乙醇洗液去除残余硼酸盐。
图11(a)：评价去除残余硼酸盐的不同试剂/缓冲剂，这通过对来自下一轮染色和延长光暴露的信号的后续影响而测量。
图11(b)：评价去除残余硼酸盐的不同试剂/缓冲剂：试剂浓度的影响。
图12：在(a)肺鳞状细胞癌组织样品；(b)肝细胞癌组织样品；(c)侵袭性乳腺导管癌组织样品中不同洗涤后的残余硼酸盐(通过硼含量测量)。
图13：增加的水溶性减少硼酸盐保留，这通过其对来自后续用抗-NaKATP酶-Cy5染色和光暴露的信号的影响而测量。a)用碱性过氧化物处理的对照载玻片，b)用单苄基三苯基硼酸盐通过PICB漂白的载玻片，c)用较高水溶性硼酸盐漂白的载玻片。
图14：通过采用较高水溶性(四丁基硼酸盐)硼酸盐消除额外洗涤步骤。a & b)用单苄基三苯基硼酸盐漂白并用70%乙醇(3x1 min)和PBS (3x5 min)洗涤的样品；c & d)用四丁基硼酸盐漂白并用PBS (3x5 min)单独洗涤的样品。
图15：用于多路复用生物样品分析的光敏化化学漂白的自动化方法的示例性步骤的流程图。
详细描述
定义
单数形式"a"、"an"和"the"包括复数指代，除非上下文中另外清楚地指明。如在此贯穿说明书和权利要求书所用的近似估算语言，可应用于修饰任何数量表示，这些数量表示在不导致对其涉及的基本功能改变的情况下可允许变化。因此，由术语例如"约"修饰的值并不限于所指定的精确值。除非另外指明，在说明书和权利要求书中所用的表示成分、特性例如分子量、反应条件等等的量的所有数字应理解为在所有的情况下由术语"约"修饰。因此，除非有相反的说明，在以下说明书和所附权利要求书中提及的数字参数是近似值，其可根据本发明试图获得的所需特性而变化。至少各个数字参数应至少根据所报告的有效数字的位数并通过应用普通的四舍五入技术来解释。
本文所用术语“添加剂”或“防止靶标修饰的添加剂”是指自由基清除剂或单线态氧淬灭剂。自由基清除剂是指与各种自由基直接反应的任何添加剂，包括过氧自由基(ROO.)、CCl3.和HO.以及超氧化物自由基(O2.-)。所述添加剂实例不限于抗坏血酸、没食子酸正丙酯、巯基乙醇、盐酸半胱氨酸、叔丁基羟基甲苯(BHT)、环庚三烯(CHT)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、1,4-二氢-o-甲苯酰胺(TA)、α-生育酚和trolox。单线态氧淬灭剂包括例如姜黄素和DABCO。一些自由基清除剂例如α-生育酚和抗坏血酸还可充当单线态氧清除剂。
如本文所用的，术语“烷基”指饱和的脂族基团，包括直链烷基(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)、支链烷基(异丙基、叔-丁基、异丁基等)。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其主链上具有6个或更少的碳原子(例如，对于直链为C1-C6、对于支链为C3-C6)或在其主链上具有4个或更少的碳原子(例如，对于直链为C1-C4、对于支链为C3-C4)。术语“C1-C6”烷基指含有1-6个碳原子的烷基。术语“C1-C4”烷基指含有1-4个碳原子的烷基。此外，术语烷基包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”两者，其后者指具有替代烃主链的一个或多个碳上的氢的取代基的烷基部分。这样的取代基可包括，例如，(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、氨基(包括(C1-C4)烷基氨基和(C1-C4)二烷基氨基)、羟基、氰基、卤素或硝基。环烷基可被例如以上所述的取代基进一步取代。
如本文所用的，术语“烯基”指在长度和可能的取代上与上述烷基类似但含有至少一个双键的不饱和脂族基团。例如，术语“烯基”包括直链烯基(例如，乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基等)、支链烯基。此外，术语“烯基”包括“未取代的烯基”和“取代的烯基”两者，其后者指具有替代烃主链的一个或多个碳上的氢的取代基的烯基部分。这样的取代基可包括，例如，(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、氨基(包括(C1-C4)烷基氨基和(C1-C4)二烷基氨基)、羟基、氰基、卤素，或硝基。
如本文所用的，术语“炔基”指在长度和可能的取代上类似于上述烷基但含有至少一个三键的不饱和脂族基团。例如，术语“炔基”包括直链炔基(例如，乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等)或支链炔基。此外，术语“炔基”包括“未取代的炔基”和“取代的炔基”两者，其后者指具有替代烃主链的一个或多个碳上的氢的取代基的炔基部分。这样的取代基可包括，例如，(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、氨基(包括(C1-C4)烷基氨基和(C1-C4)二烷基氨基)、羟基、氰基、卤素，或硝基。
如本文所用的，术语“烷氧基”指与氧原子共价连接的取代和未取代的烷基、烯基和炔基。烷氧基的实例包括，但不限于，甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基。在某些实施方案中，直链或支链烷氧基在其主链上具有4个或更少的碳原子(例如，对于直链为C1-C4，对于支链为C3-C4)。术语“C1-C4”烷基指含有1-4 碳原子的烷基。
如本文所用的，术语“胺”或“氨基”指化合物或取代基，其中氮原子与至少一个碳或杂原子共价连接。该术语包括“烷基氨基”，其包含其中氮与至少一个另外的烷基结合的基团和化合物。术语“二烷基氨基”包括其中氮原子与至少两个另外的烷基结合的基团。在某些实施方案中，这些烷基在其主链上具有4个或更少的碳原子(例如，对于直链为C1-C4，对于支链为C3-C4)。术语(C1-C4)烷基氨基指其中氮与至少一个另外的C1-C4烷基结合的基团和化合物。术语(C1-C4)二烷基氨基指其中氮与至少两个另外的C1-C4烷基结合的基团和化合物。
如本文所用的，术语“芳基”指例如5-和6-元单环芳族基团的基团，其可包括从零至4个杂原子，例如，苯、苯基、吡咯、呋喃、噻吩、噻唑、异噻唑、咪唑、三唑、四唑、吡唑、噁唑、异噁唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。此外，术语“芳基”包括多环芳基，例如，三环、二环，例如，萘、苯并噁唑、苯并二噁唑、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并噻吩、亚甲二氧基苯基、喹啉、异喹啉、萘啶(napthridine)、吲哚、苯并呋喃、嘌呤、苯并呋喃、脱氮嘌呤或中氮茚。这些在环结构中具有杂原子的芳基也可称为“芳基杂环”、“杂芳基”或“杂芳族”。芳族环可在一个或多个环位置被如上所述的取代基取代，这样的取代基有例如(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、氨基(包括(C1-C4)烷基氨基和(C1-C4)二烷基氨基)、羟基、氰基、卤素或硝基。芳基也可与脂环族或不是芳族的杂环稠合或桥接，以便形成多环(例如，四氢化萘)。术语杂芳基包括不饱和的环状化合物，例如吖丙啶、环氧乙烯、二硫环丁烯、吡咯啉、吡咯、呋喃、二氢呋喃、二氢噻吩、噻吩、吡唑、咪唑、噁唑、噻唑、异噻唑、12,2,3-三唑、1,2,4-三唑、二噻唑、四唑、吡啶、吡喃、嘧啶、吡喃、噻喃、二嗪、噻嗪、二氧杂环己烯、三嗪和四氮烯。
如本文所用的，术语"抗体"指特异性与另一个分子的特定空间和极性结构结合并由此定义为与其互补的免疫球蛋白。抗体可以是单克隆或多克隆的并可通过本领域熟知的技术制备，所述技术为例如使宿主免疫并收集血清(多克隆)，或通过制备连续杂交细胞系并收集分泌的蛋白质(单克隆)，或通过克隆和表达编码至少天然抗体的特异性结合所需的氨基酸序列的核苷酸序列或其突变形式。抗体可包括完全的免疫球蛋白或其片段，免疫球蛋白包括各种类型和同种型，例如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM。功能性抗体片段可包括能够保持以类似于全长抗体的亲和力结合的抗体部分(例如，Fab、Fv和F(ab')2或Fab')。此外，在合适时，可以使用免疫球蛋白或其片段的集合物、聚合物和缀合物，只要能基本上维持对特定分子的结合亲和力。
如本文所用的，术语"结合剂"指可结合生物样品中的一个或多个靶标的分子。结合剂可特异性地结合靶标。合适的结合剂可包括一个或多个天然的或修饰的肽、蛋白质(例如，抗体、亲和体(affibodies)或适体)、核酸(例如，聚核苷酸、DNA、RNA或适体)；多糖(例如，凝集素、糖)、脂质、酶、酶底物或抑制剂、配体、受体、抗原或半抗原。合适的结合剂可根据待分析的样品和可供检测之用的靶标进行选择。例如，样品中的靶标可包括配体且结合剂可包括受体，或者靶标可包括受体且结合剂可包括配体。类似地，靶标可包括抗原并且结合剂可包括抗体或抗体片段，或者反之亦然。在一些实施方案中，靶标可包括核酸并且结合剂可包括互补的核酸。在一些实施方案中，靶标和结合剂两者可包括能够彼此结合的蛋白质。
如本文所用的，术语"生物样品"指得自生物受试者的样品，包括在体内或体外获得的生物组织或液体来源的样品。这样的样品可以是但不限于从哺乳动物(包括人)分离的体液(例如，血、血浆、血清或尿)、器官、组织、部分、细胞和细胞器。生物样品还可包括生物样品的切片，包括组织的切片(例如，器官或组织的切片部分)。生物样品还可包括来自生物样品的提取物，例如来自生物液体(例如，血或尿)的抗原或核酸。生物样品可包含蛋白质、碳水化合物或核酸。
生物样品可具有原核生物源、古细菌源(archaeal origin)或真核生物源(例如，昆虫、原生动物、鸟、鱼、爬行动物)。在一些实施方案中，生物样品是哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、牛、狗、驴、豚鼠或兔)。在某些实施方案中，生物样品具有灵长类动物源(例如，实例有黑猩猩或人)。
如本文所用的，术语"对照探针"指具有与信号发生器偶联的结合剂或能够直接染色的信号发生器的试剂，以致信号发生器在与电子转移试剂接触和随后的照射后保留至少80%的信号。对照探针中的合适的信号发生器当与电子转移试剂接触并被照射时，基本上不被光敏化化学漂白灭活，例如基本上不被漂白。信号发生器的合适的实例可包括在所采用的条件下不经历漂白的荧光团(例如，DAPI)。
本文所用术语“促成剂”是指加入洗涤溶液中而有助于在去除信号后从样品去除残余电子转移试剂的物质。合适的促成剂是增加电子转移试剂在水性缓冲剂中的溶解性的促成剂。促成剂可通过与电子转移试剂络合而起作用，例如当电子转移试剂是阴离子盐时，为阳离子盐；通过破坏非共价相互作用和聚集而起作用，例如离液剂和去污剂；或调节洗液的亲水性以使两亲电子转移试剂更可溶。合适促成剂的实例包括水溶性单-或多-阳离子、离液剂、去污剂和有机溶剂。
如本文所用的，术语"酶"指能催化底物的化学反应的蛋白质分子。在一些实施方案中，合适的酶催化底物的化学反应，形成能结合于存在于样品中的受体(例如，酚基)的反应产物。受体可以是外源性的(即，受体外来粘附于样品或固体-支持物)或内源性的(受体固有地存在于样品或固体-支持物中)。合适的酶的实例包括过氧化物酶、氧化酶、磷酸酯酶、酯酶和糖苷酶。合适的酶的具体实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、脂肪酶和葡糖氧化酶。
如本文所用的，术语"酶底物"指在化学上被酶催化以形成反应产物的化学化合物。在一些实施方案中，反应产物能够结合存在于样品中的受体。在一些实施方案中，本文方法中使用的酶底物可包括非-发色的或非-化学发光的底物。信号发生器可与酶底物连接作为标记。
如本文所用的，术语“电子转移试剂”指可与能够经历光激发的分子一起参与光反应的试剂。这个术语也指包含可与能够经历光激发的分子一起参与光反应的试剂的组合物。在一些实施方案中，能够经历光激发的分子可以是信号发生器。在一些实施方案中，电子转移试剂可在光反应的过程中将电子贡献给信号发生器。在备选的实施方案中，电子转移试剂可在光反应的过程中接受来自信号发生器的电子。
在一些实施方案中，在光反应的过程中将电子贡献给信号发生器的电子转移试剂可以是硼酸盐。在进一步的实施方案中, 硼酸盐为三苯基丁基硼酸盐。
在备选的实施方案中，接受来自光激发分子的电子的电子转移试剂可以是盐[例如，六氟磷酸二苯基碘(diphenyliodonium)(DPI)或四氟硼酸二甲基苯甲酰锍(phenacylsulfonium)(DMPS)]或丁基三苯基硼酸四丁基铵(TBAB)。
如本文所用的，术语"荧光团"或"荧光信号发生器"指当通过暴露于特定波长的光激发时，发射不同的波长的光的化学化合物。荧光团可根据其发射概况(profile)或"色彩"进行描述。绿色荧光团(例如Cy3、FITC和俄勒冈绿(Oregon Green))的特征可在于其以通常在515-540纳米范围内的波长发射。红色荧光团(例如得克萨斯红(Texas Red)、Cy5和四甲基罗丹明)的特征可在于其以通常在590-690纳米范围内的波长发射。荧光团的实例包括，但不限于，4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸芪(isothiocyanatostilbene)-2,2'二磺酸、吖啶、吖啶和吖啶异硫氰酸酯的衍生物、5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5二磺酸盐(Lucifer Yellow VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺、亮黄(Brilliant Yellow)、香豆素、香豆素衍生物、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、Coumarin 120)、7-氨基-三氟甲基香豆素(Coumaran 151)、焰红染料(cyanosine)；4',6-二脒基(diaminidino)-2-苯基吲哚(DAPI)、5',5''-二溴邻苯三酚(dibromopyrogallol)-磺酞(溴邻苯三酚红)、7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸基苯基)-4-甲基香豆素、-4,4'-二异硫氰酸基二氢-芪-2,2'-二磺酸、4,4'-二异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸、5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS、丹磺酰氯)、荧光素和衍生物例如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、QFITC (XRITC)；荧光胺衍生物(荧光与胺反应时)；IR144；IR1446；异硫氰酸孔雀绿；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；酚红、B-藻红蛋白；邻苯二甲醛衍生物(荧光与胺反应时)；芘和衍生物例如芘、丁酸芘和1-芘丁酸琥珀酰亚胺基酯；活性红4 (Cibacron.RTM. 亮红3B-A)、罗丹明和衍生物例如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、异硫氰酸罗丹明X、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101和磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(得克萨斯红)；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)；核黄素；玫红酸和镧系元素螯合物衍生物、花青、pyrelium染料、方酸箐(squaraines)、1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(DDAO)和二甲基吖啶酮(DAO)。在一些实施方案中，荧光团可以是花青、罗丹明、BODIPY或1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(DDAO)染料。在优选的实施方案中，荧光团是花青染料。在进一步的实施方案中，花青染料是Cy3或Cy5。
如本文所用的，术语"原位(in situ)"通常指在原始位置发生的事件，例如，在完整的器官或组织或在器官或组织的代表性的片段。在一些实施方案中，靶标的原位分析可在从多种来源获得的细胞上进行，所述来源包括生物体、器官、组织样品或细胞培养物。原位分析提供前后关系的信息，而这样的信息在将靶标从其起源部位移出时可能会丧失。因此，靶标的原位分析描述位于全细胞或组织样品中的靶标-结合的探针的分析，而不管靶标-结合的探针保留在细胞内时细胞膜是否完全完整或是部分地完整。此外，本文公开的方法可用于原位分析固定的或未固定的细胞或组织样品中的靶标。
如本文所用的，术语“照射”或“辐照”指样品或溶液暴露于非-电离照射的行动或过程。在一些实施方案中，非-电离照射具有350 nm和1.3 μm之间的波长。在优选的实施方案中，非-电离照射是400-700 nm波长的可见光。照射可通过使样品或溶液暴露于照射源例如能够发射某一波长或一定范围波长的照射的灯而实现。在一些实施方案中，能够经历光激发的分子因照射而被光激发。在一些实施方案中，能够经历光激发的分子是信号发生器，例如，荧光信号发生器。在一些实施方案中，荧光信号发生器的照射启动荧光信号发生器和电子转移试剂之间的光反应。在一些实施方案中，照射启动由光敏化化学漂白基本上灭活信号发生器的光反应。
光学滤波器可用于将样品或溶液的照射限制于某一特定波长或一定范围的波长。在一些实施方案中，光学滤波器可用于将照射限制在窄范围的波长，以选择性光激发一个或多个能够经历光激发的分子。术语“选择性光激发”指一种行动或过程，藉此使一个或多个能够经历光激发的分子在一个或多个能够经历光激发的其它分子(其在照射后保持在基础电子状态)的存在下被光激发。
在一些实施方案中，能够经历光激发的分子是荧光染料，例如，花青染料。在一个进一步的实施方案中，采用限制在520-580 nm之间的波长范围的照射以选择性光激发Cy3染料。在另一个进一步的实施方案中，采用限制在620-680 nm之间的波长范围的照射以选择性光激发Cy5染料。在备选的实施方案中，以特定波长照射样品也可通过使用激光实现。
如本文所用的，术语"过氧化物酶"指催化酶底物与电子供体一起的氧化反应的一类酶。过氧化物酶的实例包括辣根过氧化物酶、细胞色素C过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、微过氧化物酶、髓过氧化物酶、乳酸过氧化物酶或大豆过氧化物酶。
如本文所用的，术语"过氧化物酶底物"指通过过氧化物酶在化学上催化以形成反应产物的化学化合物。在一些实施方案中，用于本文方法中的过氧化物酶底物可包括非-发色的或非-化学发光的底物。荧光信号发生器可与过氧化物酶底物连接作为标记。
如本文所用的，术语“漂白”、“光敏化化学漂白”或“光诱导的化学漂白”指一种行动或过程，藉此由信号发生器生成的信号在光反应的过程中被改变。在某些实施方案中，信号发生器被不可逆地改变。
在一些实施方案中，信号由于光敏化化学漂白作用而被减弱或消除。在一些实施方案中，信号发生器被完全漂白，即信号强度减少约100%。在一些实施方案中，信号是光信号，和信号发生器是光信号发生器。术语“光敏化化学漂白”意指不包括光漂白，或者例如在连续照射信号发生器例如荧光团之后，或在其连续暴露于光之后，在电子转移试剂的不存在下可发生的信号(例如，荧光信号)缺失。
如本文所用的，术语“光激发” 指一种行动或过程，藉此分子在吸收辐射能，例如在照射时，从基础电子状态向激发电子状态跃迁。光激发的分子可参与化学反应，例如，参与电子转移反应。在一些实施方案中，能够经历光激发的分子是信号发生器，例如，荧光信号发生器。
如本文所用的，术语“光反应”或“光诱导的反应”指由于至少一种反应物的光激发而启动和/或进行的化学反应。光反应中的反应物可以是电子转移试剂和能够经历光激发的分子。在一些实施方案中，光反应可包括自电子转移试剂至已经历光激发的分子(即，光激发的分子)的电子转移。在备选的实施方案中，光反应也可包括将电子从已经历光激发的分子转移至电子转移试剂。在一些实施方案中，能够经历光激发的分子是荧光信号发生器，例如荧光团。在一些实施方案中，光反应导致光反应的一个或多个成分的不可逆的改变。在一些实施方案中，光反应通过光敏化化学漂白基本上灭活信号发生器。
在一些实施方案中，光反应可包括电子转移试剂和光激发的分子之间的分子间电子转移，例如，当电子转移试剂和光激发的分子之间的连接是短暂的，恰好在电子转移之前形成和电子转移后断开时，发生电子转移。
在一些实施方案中，光反应可包括电子转移试剂和光激发的分子之间的分子内电子转移，例如当在启动电子转移过程之前电子转移试剂和光激发的分子例如通过共价或静电相互作用已经连接在一起时，发生电子转移。例如，当能够经历光激发的分子和电子转移试剂携带相反电荷并形成通过静电相互作用保持的复合物时，可发生涉及分子内电子转移的光反应。例如，阳离子染料(例如阳离子花青染料)和三苯基丁基硼酸盐阴离子可形成复合物，其中在照射时在花青和硼酸盐部分之间可发生分子内电子转移。
如本文所用的，术语"探针"指具有结合剂和标记物(例如信号发生器或酶)的试剂。在一些实施方案中，结合剂和标记物(信号发生器或酶)被包含在一个单一实体中。结合剂和标记物可直接连接(例如，经由结合到结合剂中的荧光分子)或间接连接(例如，通过接头)并以单一步骤应用于生物样品。在备选的实施方案中，结合剂和标记物被包含在离散的实体中(例如，能够结合靶标和酶的第一抗体或能够结合第一抗体的信号发生器-标记的第二抗体)。当结合剂和标记物(信号发生器或酶)是分开的实体时，它们可以单一步骤或多个步骤应用于生物样品。如本文所用的，术语"荧光探针"指具有偶联于荧光信号发生器的结合剂的试剂。在一些实施方案中，探针可包含光信号发生器，以致观测到的信号是光信号。在一些实施方案中，探针可包含荧光信号发生器，以致观测到的信号是荧光信号。
如本文所用的，术语"信号发生器"指能够使用一种或多种检测技术(例如，光谱测定法、热量测定法、光谱法或肉眼检查)提供可检测的信号的分子。可检测的信号的合适实例可包括光信号和电信号。信号发生器的实例包括发色团、荧光团或拉曼-活性标签中的一个或多个。如上所述，关于探针，在某些实施方案中信号发生器和结合剂可存在于单一实体(例如，一种含有荧光标记物靶标结合蛋白)中。或者，结合剂和信号发生器可以是在引入样品之前或引入样品时彼此缔合的分开的实体(例如，受体蛋白和针对特定受体蛋白的标记的抗体)。
在一些实施方案中，信号发生器可以是光信号发生器。在一些实施方案中，光信号发生器可以是荧光信号发生器，例如荧光团。在优选的实施方案中，荧光信号发生器可以是花青染料，例如，Cy3、Cy5或Cy7。在一些实施方案中，信号发生器，例如荧光团，可以带电荷。在一个实施方案中，信号发生器是阳离子荧光染料。
如本文所用的，术语"固体支持物"指存在于生物样品中的靶标可固定于其上且随后可经本文公开的方法检测的物体。靶标可通过物理吸附、通过共价键形成或通过其组合固定在固体支持物上。固体支持物可包括聚合物、玻璃或金属材料。固体支持物的实例包括膜、微量滴定板、珠、滤器、测试条、载玻片、盖玻片和试管。
如本文所用的，术语"特异性结合"指与基本较少地识别其它分子相比，两个不同的分子中的一个特异性识别另一个。分子可具有在其表面上的或在孔穴中的面积，导致由静电相互作用、氢键或疏水相互作用的一或多种引起的两个分子之间的特异性识别。特异性结合实例包括，但不限于，抗体-抗原相互作用、酶-底物相互作用、聚核苷酸相互作用等。在一些实施方案中，在环境条件例如约6-约8的pH和范围从约0℃-约37℃的温度下，结合剂分子对靶标的内在平衡结合常数(KA)可以是不低于约105 M-1。
如本文所用的，术语"靶标"指生物样品的成分，其在存在于生物样品中时可被检测到。靶标可以是对其存在天然存在的特异性结合剂(如，抗体)的任何物质，或对其可制备特异性结合剂(例如，小分子结合剂或适体)的任何物质。一般来说，结合剂可通过靶标的一个或多个分开的化学部分或靶标的三维结构成分(例如，由肽折叠造成的3D结构)结合于靶标。靶标可包括天然的或修饰的肽、蛋白质(例如，抗体、亲和体或适体)、核酸(例如，聚核苷酸、DNA、RNA、或适体)；多糖(例如，凝集素或糖)、脂质、酶、酶底物、配体、受体、抗原或半抗原中的一个或多个。在一些实施方案中，靶标可包括蛋白质或核酸。
本文所用术语“靶标修饰”包括防止或减少探针结合的靶标结构的变化。该变化可以是化学性质的，例如一个或多个氨基酸、一个或多个脂质组分、一个或多个核酸碱基或被靶向用于检测的其它样品组分的氧化或向一个或多个氨基酸、一个或多个脂质组分、一个或多个核酸碱基或被靶向用于检测的其它样品组分中添加自由基，或者该变化可以是物理性质的，例如蛋白或蛋白一部分变性、DNA解链、折叠增加等。
本发明包括通常涉及可应用于分析、诊断，或预后应用的方法的实施方案，所述方法例如分析物检测、荧光-激活的细胞分类(FACS)、组织化学、免疫组织化学或免疫荧光。在一些实施方案中，本文公开的方法特别地应用于组织化学、免疫染色、免疫组织化学、免疫测定或免疫荧光。在一些实施方案中，本文公开的方法可特别地应用于免疫印迹技术，例如，蛋白质印迹或免疫测定 例如酶-联免疫吸附测定(ELISA)。
所公开的方法通常涉及检测单一生物样品中的多靶标。在一些实施方案中，公开了在单一生物样品中使用相同的检测通道检测多靶标的方法。靶标可存在于悬浮中的细胞的表面，存在于细胞学涂片表面，存在于组织学切片表面，存在于DNA微阵列表面, 存在于蛋白质微阵列表面，或存在于固体支持物(例如凝胶、印迹、玻璃载玻片、珠或ELISA板)的表面。
本文公开的方法可允许检测相同生物样品中的多个靶标，对生物样品的完整性具有很少或没有影响。检测在相同生物样品中的靶标可进一步提供关于在生物样品中的靶标的空间信息。本文公开的方法还可应用于这样的分析应用，在所述分析应用中有限量的生物样品可用于分析，并且所述样品可能必须经过处理用于多次分析。本文公开的方法还可有利于固态样品(例如，组织切片)或附着于固体支持物的样品(例如，印迹)的多次分析，而基本不剥离(stripping)探针和靶标。更进一步地，相同的检测通道可用于检测样品中的不同的靶标，使得能够对多靶标的分析有更少的化学需要。所述方法可进一步地促进基于由于可解析信号的限制造成的同时可检测靶标的数目可受到限制的检测方法的分析。例如，使用基于荧光的检测，可同时检测的靶标的数目可被限制为约5个，因为仅有约5个荧光信号可基于其激发和发射波长特性而被解析。在一些实施方案中，本文公开的方法可允许使用基于荧光的检测系统，检测大于5个靶标。
在一些实施方案中，所述方法是包括信号循环过程的高通量多路复用生物样品分析，其中在各个循环中，染色和成像之后应用电子转移试剂以及任选的防止靶标修饰的添加剂和照射生物样品。所述方法允许快速信号循环而不显著改变不同于探针的生物样品的成分。
在一些实施方案中，检测生物样品中的多靶标的方法包括连续检测生物样品中的靶标。方法通常包括检测在生物样品中的第一组靶标，在防止靶标修饰的添加剂的任选存在下通过光诱导的化学漂白来漂白来自第一组靶标的信号的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括用有效从样品中去除残余电子转移试剂的洗涤溶液洗涤样品的步骤。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含乙醇。
在一些实施方案中，所述方法还包括检测在生物样品中的第二组靶标。所述方法还可包括重复来自第二组靶标的信号的光诱导的化学漂白，接着检测在生物样品中的第三组靶标等的步骤。
在一些实施方案中，所述方法包括使生物样品与第一探针接触并使第一探针与第一靶标物理结合的步骤。所述方法还包括检测/观测来自第一探针的第一信号。将电子转移试剂和任选的防止靶标修饰的添加剂应用于探针，并照射包括电子转移试剂、添加剂和探针的样品，由此启动改变第一信号的光反应。所述方法还包括使生物样品与第二探针接触并使第二探针与生物样品中的第二靶标物理结合，接着检测/观测来自第二探针的第二信号。在一些实施方案中，所述方法包括用有效从样品中去除残余电子转移试剂的洗涤溶液洗涤样品的步骤。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含乙醇。
在一些实施方案中，所述方法还包括使生物样品与多组多个探针接触并使所述多个探针与多个靶标物理结合的步骤。所述方法还包括检测来自第一组多个探针的第一组信号。将电子转移试剂和任选的防止靶标修饰的添加剂应用于多个探针，并照射样品，由此启动改变来自第一组多个探针的第一组信号的光反应。所述方法还包括自第二组多个靶标产生第二组信号并检测第二组信号。第二组信号的产生可包括使第二组探针与包含信号发生器的分开的部分缔合。例如，第二组探针可包含生物素标签，和包含信号发生器的部分还可包含能够结合生物素标签的链霉抗生物素。或者，第二组信号的生成可包括，例如，通过改变荧光团-猝灭剂对之间的距离，未屏蔽信号-生成的部分。在还一个实施方案中，第二组信号可因标记的核酸探针与第二组探针上的未标记的互补序列的杂交产生。在一些实施方案中，所述方法包括用有效从样品中去除残余电子转移试剂的洗涤溶液洗涤样品的步骤。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含乙醇。
在其它实施方案中，所述方法包括提供包括多靶标的样品并将具有与酶偶联的结合剂的至少一个探针结合存在于样品中的一个或多个靶标的步骤。所述方法还包括使结合的探针与偶联至信号发生器的酶底物反应并观测来自信号发生器的信号。将在光反应的过程中基本上灭活信号发生器和酶二者的电子转移试剂，以及任选的防止光敏化化学漂白期间靶标修饰的添加剂应用于样品。所述方法还包括任选的灭活酶的独立步骤。酶灭活的步骤可包括，例如，酶灭活试剂的应用。所述方法还包括将至少一个具有与酶偶联的结合剂的后续探针结合存在于样品中的一个或多个靶标。所述方法还包括使结合的探针与偶联至信号发生器的酶底物反应并观测来自信号发生器的信号。在一些实施方案中，所述方法包括用有效从样品中去除残余电子转移试剂的洗涤溶液洗涤样品的步骤。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含乙醇。
在另外其它实施方案中，所述方法包括提供包含多靶标的生物样品并使至少一个探针结合存在于样品中的一个或多个靶标的步骤。该方法还包括检测来自结合的探针的信号。使结合的探针与电子转移试剂和任选的防止靶标修饰的添加剂接触，并照射包含结合的探针、添加剂和电子转移试剂的样品，由此漂白探针。所述方法还包括将至少一个后续探针结合存在于样品中的一个或多个靶标，接着检测来自后续结合的探针的信号。在一些实施方案中，所述方法包括用有效从样品中去除残余电子转移试剂的洗涤溶液洗涤样品的步骤。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含乙醇。
在另外其它实施方案中，所述方法包括提供包含多靶标的生物样品并使至少一个荧光探针结合存在于样品中的一个或多个靶标的步骤。所述方法还包括使至少一个对照探针结合存在于样品中的一个或多个靶标。使结合的探针与电子转移试剂和任选的防止靶标修饰的添加剂接触，并照射包含结合的探针、添加剂和电子转移试剂的样品，由此漂白探针而不漂白对照探针。所述方法还包括将至少一个后续探针结合存在于样品中的一个或多个靶标，接着检测来自后续结合的探针的信号。在一些实施方案中，所述方法包括用有效从样品中去除残余电子转移试剂的洗涤溶液洗涤样品的步骤。在一些实施方案中，所述洗涤溶液包含乙醇。
在另外其它实施方案中，以上描述的方法提供一系列描绘光学标记的生物靶标的至少两个图像。
生物样品
根据本发明的一个实施方案的生物样品可以是固体或液体。生物样品的合适实例可包括，但不限于，培养物、血、血浆、血清、唾液、脑脊液、胸膜液、乳汁、淋巴、痰、精液、尿、粪便、泪液、唾液、针抽吸液；皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外部切片；肿瘤、器官、细胞培养物或细胞培养物成分、或实体组织切片。细胞培养物可包括混合的细胞培养物、干细胞集落或得自各种癌或原代细胞系的培养物。在一些实施方案中，生物样品可原样分析，即无需收获和/或分离感兴趣的靶标。在备选的实施方案中，收获和分离靶标可在分析之前进行。在一些实施方案中，本文公开的方法可特别地适合于体外分析生物样品。
生物样品可包括任何上述样品，而不管其物理条件，例如，但不限于被冷冻或染色或以别的方式进行处理。在一些实施方案中，生物样品可包括并非天然地在本质上与样品掺混的化合物，例如防腐剂、抗凝血剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素等。
在一些实施方案中，生物样品可包括组织样品或切片、全细胞、细胞成分例如细胞器官、细胞离心物(cytospin)或细胞涂片。在一些实施方案中，生物样品主要包括组织样品。组织样品可包括得自可具有类似功能的生物受试者的组织的类似细胞的收集物。在一些实施方案中，组织样品可包括得自人的组织的类似细胞的收集物。人的组织的合适实例包括，但不限于，(1) 上皮；(2)结缔组织，包括血管、骨和软骨；(3) 肌肉组织；和(4)神经组织。组织样品的来源可以是得自新鲜的、冷冻的和/或保藏的器官或组织样品或活组织切片的固体组织或抽吸液；血或任何血成分；体液例如脑脊液、羊水、腹膜液或间质液；或来自受试者的妊娠期或发育期的任何时间的细胞。在一些实施方案中，组织样品可包括原代或培养的细胞或细胞系。
在一些实施方案中，生物样品包括得自健康或患病的组织样品的组织切片(例如，得自结肠、乳腺组织、前列腺的组织切片)。组织切片可包括单一部分的组织样品或一片组织样品，例如，自组织样品切割的一薄片组织或细胞。在一些实施方案中，可采取组织样品的多个切片并经历分析, 只要关于至少两个不同的靶标，可用本文公开的方法分析组织样品的同一切片(在形态学或分子水平)。在一些实施方案中，可使用组织微阵列。在一些实施方案中，关于至少5个不同的靶标，可分析组织样品的同一切片(在形态学或分子水平)。在一些实施方案中，关于大于5个不同的靶标可分析组织样品的同一切片(在形态学或分子水平)。在一些实施方案中，可在形态学和分子水平两者上分析组织样品的同一切片。
组织切片，如果用作生物样品，可具有范围少于约100微米，范围少于约50微米，范围少于约25微米，或范围少于约10微米的厚度。
在一些实施方案中，生物样品可包含蛋白质、碳水化合物或核酸中的一种或多种。在一些实施方案中，生物样品或在生物样品中的靶标可附着于固体支持物。固体支持物可包括微阵列(例如，DNA或RNA微阵列)、凝胶、印迹、玻璃载玻片、珠或ELISA板。在一些实施方案中，生物样品或在生物样品中的靶标可附着于选自尼龙、硝基纤维素和聚二氟亚乙烯的膜。在一些实施方案中，固体支持物可包括选自聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚丙烯的塑料表面。
靶标
靶标可存在于生物样品表面(例如，组织切片表面上的抗原)或存在于大量的样品(例如，在缓冲液中的抗体)中。在一些实施方案中，靶标可不固有地存在于生物样品的表面，并且生物样品可必须被处理，以使靶标在表面上为可利用的(例如，抗原恢复、酶促消化、抗原决定部位修复或阻断)。在一些实施方案中，靶标可存在于体液例如血、血浆、血清或尿中。在一些其它实施方案中，靶标可固定于组织中，在细胞表面上或者在细胞内。
待分析的靶标的适用性可通过生物样品所需的分析类型和性质确定。在一些实施方案中，靶标可提供有关生物样品中分析物的存在或不存在的信息。在另一个实施方案中，靶标可提供有关生物样品的状态的信息。例如，如果生物样品包括组织样品，本文公开的方法可用于检测以下靶标：其可有助于比较不同的类型的细胞或组织，比较不同的发育阶段, 检测疾病或异常的存在，或确定疾病或异常的类型。
靶标可包括肽、蛋白质(例如，抗体、亲和体或适体)、核酸(例如，聚核苷酸、DNA、RNA或适体)；多糖(例如，凝集素或糖)、脂质、酶、酶底物、配体、受体、抗原或半抗原中的一种或多种。在一些实施方案中，靶标可主要包括蛋白质或核酸。在其它实施方案中，在一个或多个循环中在同一生物样品中可检测和/或分析多种类型的靶标，例如，核酸、多糖、脂质、酶、酶底物、配体、受体、抗原或半抗原。上述靶标中的一个或多个可以是特定细胞所特有的，而其它靶标可与特定疾病或病症相关。在一些实施方案中，可使用本文公开的方法检测和分析的靶标可包括，但不限于，预后靶标、激素或激素受体靶标、淋巴靶标、肿瘤靶标、细胞周期相关的靶标、神经组织和肿瘤靶标或簇分化的靶标。
预后靶标的合适的实例可包括酶促靶标例如半乳糖基转移酶II、神经元特异性烯醇酶, 质子ATP酶-2或酸性磷酸酶。
激素或激素受体靶标的合适的实例可包括人绒毛膜促性激素(HCG)、促肾上腺皮质激素、癌胚抗原(CEA)、前列腺-特异性抗原(PSA)、雌激素受体、孕酮受体、雄激素受体、gC1q-R/p33补体受体、IL-2受体、p75神经营养因子受体、PTH受体、甲状腺激素受体或胰岛素受体。
淋巴靶标的合适的实例可包括α-1-抗胰凝乳蛋白酶、α-1-抗胰蛋白酶、B细胞靶标、bcl-2、bcl-6、B淋巴细胞抗原36 kD、BM1 (髓性靶标)、BM2 (髓性靶标)、半乳凝素-3、颗粒酶B、HLA I型抗原、HLA II型(DP)抗原、HLA II型(DQ)抗原、HLA II型(DR)抗原、人中性白细胞防卫素、免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、κ轻链、κ轻链、λ轻链、淋巴细胞/组织细胞抗原、巨噬细胞靶标、胞壁质酶(溶菌酶)、p80间变性(anaplastic)淋巴瘤激酶、血浆细胞靶标、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂、T细胞抗原受体(JOVI 1)、T细胞抗原受体(JOVI 3)、末端脱氧核苷酸转移酶或非聚集(unclustered) B细胞靶标。
肿瘤靶标的合适的实例可包括α胎儿球蛋白、载脂蛋白D、BAG-1 (RAP46蛋白)、CA19-9 (唾液酸基路易斯酸(sialyl lewisa))、CA50 (癌相关粘蛋白抗原)、CA125 (卵巢癌抗原)、CA242 (肿瘤相关粘蛋白抗原)、嗜铬粒蛋白A、簇蛋白(载脂蛋白J)、上皮膜抗原、上皮-相关抗原、上皮特异性抗原、巨囊性病液体蛋白质-15、肝细胞特异性抗原、调蛋白、人胃粘蛋白、人乳脂肪球、MAGE-1、基质金属蛋白酶、黑素A、黑素瘤靶标(HMB45)、间皮素、金属硫蛋白、小眼球转录因子(MITF)、Muc-1核心糖蛋白、Muc-1糖蛋白、Muc-2糖蛋白、Muc-5AC糖蛋白、Muc-6糖蛋白、髓过氧化物酶、Myf-3 (横纹肌肉瘤靶标)、Myf-4 (横纹肌肉瘤靶标)、MyoD1 (横纹肌肉瘤靶标)、肌红蛋白、nm23蛋白、胎盘碱性磷酸酶、前白蛋白、前列腺特异性抗原、前列腺酸性磷酸酶、前列腺抑制素肽、PTEN、肾细胞癌靶标、小肠黏蛋白抗原、四连接素、甲状腺转录因子-1、基质金属蛋白酶1的组织抑制剂、基质金属蛋白酶2的组织抑制剂、酪氨酸酶、酪氨酸酶-相关蛋白质-1、绒毛蛋白或血管假性血友病因子(von Willebrand factor)。
细胞周期相关的靶标的合适实例可包括细胞凋亡蛋白酶激活因子-1、bcl-w、bcl-x、溴脱氧尿苷、CAK (cdk-活化激酶)、细胞凋亡易感性蛋白质(CAS)、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶8、CPP32 (胱天蛋白酶-3)、CPP32 (胱天蛋白酶-3)、细胞周期蛋白依赖性激酶、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D2、细胞周期蛋白D3、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白G、DNA断裂因子(N-末端)、Fas (CD95)、Fas-相关死亡域蛋白、Fas配体、Fen-1、IPO-38、Mcl-1、微小染色体维持蛋白、错配修复蛋白(MSH2)、聚(ADP-核糖)聚合酶、增生细胞核抗原、p16蛋白、p27蛋白、p34cdc2、p57蛋白(Kip2)、p105蛋白、Stat 1α、拓扑异构酶I、拓扑异构酶IIα、拓扑异构酶IIIα或拓扑异构酶IIβ。
神经组织和肿瘤靶标的合适的实例可包括αB晶体蛋白、α-丝联蛋白、α突触核蛋白、淀粉样前体蛋白、β淀粉样蛋白、钙结合蛋白、胆碱乙酰转移酶、兴奋性氨基酸转运蛋白1、GAP43、神经胶质纤维酸性蛋白、谷氨酸受体2、髓鞘碱性蛋白、神经生长因子受体(gp75)、成神经细胞瘤靶标、神经丝蛋白68 kD、神经丝蛋白160 kD、神经丝蛋白200 kD、神经元特异性烯醇酶、烟碱型乙酰胆碱受体α4、烟碱型乙酰胆碱受体β2、外周蛋白、蛋白基因产物9、S-100蛋白、血清素、SNAP-25、突触蛋白I、突触素、τ蛋白(tau)、色氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶或遍在蛋白。
簇分化靶标的合适的实例可包括CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8α、CD8β、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16a、CD16b、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD44R、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CDw93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CDw119、CD120a、CD120b、CD121a、CDw121b、CD122、CD123、CD124、CDw125、CD126、CD127、CDw128a、CDw128b、CD130、CDw131、CD132、CD134、CD135、CDw136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CDw150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166和TCR-ζ。
其它的合适预后靶标可包括着丝粒蛋白-F (CENP-F)、巨蛋白、内披蛋白、核纤层蛋白A&C (XB 10)、LAP-70、粘蛋白、核孔复合物蛋白、p180板层体蛋白、ran、r、组织蛋白酶D、Ps2蛋白、Her2-neu、P53、S100、上皮靶标抗原(EMA)、TdT、MB2、MB3、PCNA或Ki67。
探针
如在前文所限定的，探针指具有结合剂和标记物(例如信号发生器或酶)的试剂。
在一些实施方案中，结合剂和标记物(信号发生器或酶)可彼此直接偶联(即无需任何接头)。在其它实施方案中，结合剂和标记物(信号发生器或酶)可经由接头彼此偶联。如本文所用的，"偶联的" 通常指两个实体(例如，结合剂和信号发生器)通过任何物理化学手段彼此稳定地结合。偶联的性质可使得其基本上不削弱任一实体的有效性。结合剂和标记物可通过共价或非-共价相互作用彼此偶联。非-共价相互作用可包括，但不限于，疏水相互作用、离子相互作用、氢-键相互作用、高亲和力相互作用(如，生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素络合)或其它亲和力相互作用。
在一些实施方案中，结合剂和标记物(信号发生器或酶)可通过在合适的条件下能够反应和形成连键的官能团彼此化学地连接。官能团组合的合适的实例可包括，但不限于，胺酯和胺或苯胺；酰基叠氮化物和胺或苯胺；酰基卤化物和胺、苯胺、醇或苯酚；酰基腈和醇或苯酚；醛和胺或苯胺；烷基卤化物和胺、苯胺、醇、苯酚或硫醇；烷基磺酸酯和硫醇、醇或苯酚；酐和醇、苯酚、胺或苯胺；芳基卤化物和硫醇；氮丙啶和硫醇或硫醚；羧酸和胺、苯胺、醇或烷基卤化物；重氮烷和羧酸；环氧化物和硫醇；卤代乙酰胺和硫醇；卤代三嗪和胺、苯胺或苯酚；肼和醛或酮；羟胺和醛或酮；亚氨酸酯和胺或苯胺；异氰酸酯和胺或苯胺；以及异硫氰酸酯和胺或苯胺。在上述官能团对之一中的一个官能团可存在于结合剂中并且对应的官能团可存在于信号发生器或酶中。例如，结合剂可包括羧酸并且信号发生器或酶可包括胺、苯胺、醇或酰基卤化物，或反之亦然。结合剂和信号发生器或酶之间的缀合在这种情况下可通过形成酰胺键或酯键来实现。
在一些实施方案中，可用信号发生器(例如，如果结合剂是蛋白质，在合成期间使用可检测地标记的氨基酸)或酶(例如，如果结合剂是酶)内在地标记结合剂。被内在地标记的结合剂可不需要分开的信号发生器或酶以便被检测。更确切的是，内在的标记物可足以使探针为可探测的。在备选的实施方案中，结合剂可通过使其与特异性信号发生器或酶结合而被标记(即，被内在地标记)。
在一些实施方案中，结合剂和标记物(信号发生器或酶)被包括在单一实体中。在备选的实施方案中，结合剂和标记物(信号发生器或酶)被包括在分开的实体中(例如，能够结合靶标的第一抗体和能够结合第一抗体的酶或信号发生器-标记的第二抗体，或者能够结合靶标的半抗原标记的第一抗体和能够结合半抗原标记的第一抗体的酶或信号发生器-标记的抗-半抗原抗体)。当结合剂和信号发生器或酶为分开的实体时，它们可以单一步骤或多个步骤应用于生物样品。在一些实施方案中，结合剂和标记物(信号发生器或酶)为分开的实体，其在应用于生物样品之前经预连接并以单一步骤应用于生物样品。在另外其它实施方案中，结合剂和标记物(信号发生器或酶)为分开的实体，其独立地应用于生物样品并在应用后结合。
结合剂
本文公开的方法包括以特定的方式物理地结合靶标的结合剂的使用。在一些实施方案中，结合剂可以足够的特异性结合靶标，即是说，结合剂可以比其结合任何其它分子更大的亲和力结合靶标。在一些实施方案中，结合剂可结合其它分子，但是所述结合可使得非-特异性结合可以处于或接近于本底水平。在一些实施方案中，结合剂对感兴趣的靶标的亲和力可以在其对其它分子的亲和力的至少2倍、至少5倍、至少10倍或更大的范围内。在一些实施方案中，可使用具有最大的区别亲和力的结合剂，虽然它们可能不是对靶标具有最大亲和力的那些结合剂。
在一些实施方案中，靶标和结合剂之间的结合可通过物理结合实现。物理结合可包括使用非-共价相互作用实现的结合。非-共价相互作用可包括，但不限于，疏水相互作用、离子相互作用、氢-键相互作用或亲和力相互作用(如，生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素络合)。在一些实施方案中，靶标和结合剂可在其表面或在孔穴中具有面积，其在导致物理结合的二者之间产生特异性识别。在一些实施方案中，基于结合剂和生物靶标的分子形状的一部分的相互配合，结合剂可与生物靶标结合。
结合剂及其相应的靶标可被看作是结合对，其非限制性实例包括免疫-型结合对，例如，抗原/抗体、抗原/抗体片段、或半抗原/抗-半抗原；非免疫-型结合对，例如生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素、叶酸/叶酸结合蛋白质、激素/激素受体、凝集素/特异性的糖类、酶/酶、酶/底物、酶/底物类似物、酶/假-底物(不能被酶促活性催化的底物类似物)、酶/辅因子、酶/调节剂、酶/抑制剂、或维生素B12/内在因子。结合对的其它合适的实例可包括互补的核酸片段(包括DNA序列、RNA序列、LNA序列和PNA序列或文献中已知的其它修饰的核酸)；蛋白质A/抗体；蛋白质G/抗体；核酸/核酸结合蛋白；或多聚核苷酸/多聚核苷酸结合蛋白。
在一些实施方案中，结合剂可以是序列-或结构-特异性结合剂，其中被结合剂识别和结合的靶标的序列或结构对该靶标可以是足够独特的。
在一些实施方案中，结合剂可以是结构-特异性的并可识别靶标的一级、二级或三级结构。靶标的一级结构可包括其原子组成和连接那些原子的化学键(包括立体化学)的说明，例如，在蛋白质中的氨基酸的线性排列的类型和性质。靶标的二级结构可指生物分子片段的一般三维形式，例如，对于蛋白质，二级结构可指将肽"骨架"链折叠成可导致使距离远的氨基酸彼此接近的各种构型。二级结构的合适的实例可包括，但不限于，α螺旋、β折叠片或无规则卷曲(random coils)。靶标的三级结构可以是其整体三维结构。靶标的四级结构可以是通过其与一个或多个其它靶标或大分子的非共价相互作用(例如蛋白质相互作用)形成的结构。四级结构的实例可以是由构成血红蛋白的四个-球蛋白蛋白亚单位形成的结构。根据本发明的实施方案的结合剂对于任何上述结构可以是特异性的。
结构-特异性结合剂的实例可包括可结合蛋白质靶标的蛋白质-特异性分子。合适的蛋白质-特异性分子的实例可包括抗体和抗体片段、核酸(例如，识别蛋白质靶标的适体)或蛋白质底物(非-可催化的)。
在一些实施方案中，靶标可包括抗原和结合剂可包括抗体。合适的抗体可包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或抗体片段，只要它们特异性地结合靶标抗原。
在一些实施方案中，生物样品可包括细胞或组织样品，并且本文公开的方法可用于免疫组织化学(IHC)。免疫化学可包括使靶标抗原结合基于抗体的结合剂，以提供关于组织或细胞(例如，患病细胞对比正常细胞)的信息。适合作为用于本文公开方法的结合剂的抗体(和相应的疾病/疾病细胞)的实例包括，但不限于，抗-雌激素受体抗体(乳腺癌)、抗-孕酮受体抗体(乳腺癌)、抗-p53抗体多种癌症)、抗-Her-2/neu抗体(多种癌症)、抗-EGFR抗体(上皮生长因子，多种癌症)、抗-组织蛋白酶D抗体(乳腺癌和其它癌)、抗-Bcl-2抗体(凋亡细胞)、抗-E-钙粘蛋白抗体、抗-CA125抗体(卵巢癌和其它癌)、抗-CA15-3抗体(乳腺癌)、抗-CA19-9抗体(结肠癌)、抗-c-erbB-2抗体、抗-P-糖蛋白抗体(MDR，多重耐药)、抗-CEA抗体(癌胚抗原)、抗-视神经母细胞瘤蛋白(Rb)抗体、抗-ras肿瘤蛋白(p21)抗体、抗-Lewis X (也称为CD15)抗体、抗-Ki-67抗体(细胞增殖)、抗-PCNA (多种癌症)抗体、抗-CD 3抗体(T-细胞)、抗-CD4抗体(辅助T细胞)、抗-CD5抗体(T细胞)、抗-CD7抗体(胸腺细胞、未成熟的T细胞、NK杀伤细胞)、抗-CD8抗体(抑制T细胞)、抗-CD9/p24抗体(ALL)、抗-CD10 (也称为CALLA)抗体(普通的急性成淋巴细胞性白血病)、抗-CD11c抗体(单核细胞、粒细胞、AML)、抗-CD13抗体(髓样单核细胞、AML)、抗-CD14抗体(成熟的单核细胞、粒细胞)、抗-CD15抗体(霍奇金氏病)、抗-CD19抗体(B细胞)、抗-CD20抗体(B细胞)、抗-CD22抗体(B细胞)、抗-CD23抗体(激活的B细胞、CLL)、抗-CD30抗体(激活的T和B细胞、霍奇金氏病)、抗-CD31抗体(血管发生标志物)、抗-CD33抗体(骨髓细胞、AML)、抗-CD34抗体(内皮干细胞、间质瘤)、抗-CD35抗体(树突细胞)、抗-CD38抗体(浆细胞、激活的T、B和骨髓细胞)、抗-CD 41抗体(血小板、巨核细胞)、抗-LCA/CD45抗体(白细胞通用抗原)、抗-CD45RO抗体(辅助、诱导T细胞)、抗-CD45RA抗体(B细胞)、抗-CD39、CD100抗体、抗-CD95/Fas抗体(细胞凋亡)、抗-CD99抗体(尤因氏(Ewings)肉瘤标志物、MIC2 基因产物)、抗-CD106抗体(VCAM-1；激活的内皮细胞)、抗-泛素蛋白抗体(阿尔茨海默氏病)、抗-CD71 (运铁蛋白受体)抗体、抗-c-myc (肿瘤蛋白和半抗原)抗体、抗-细胞角蛋白(运铁蛋白受体)抗体、抗-波形蛋白(内皮细胞)抗体(B和T细胞)、抗-HPV蛋白(人乳头状瘤病毒)抗体、抗-κ轻链抗体(B细胞)、抗-λ轻链抗体(B cell)、抗-黑素体(HMB45)抗体(黑素瘤)、抗-前列腺特异性抗原(PSA)抗体(前列腺癌)、抗-S-100抗体(黑素瘤、涎细胞、神经胶质细胞)、抗-τ抗原抗体(阿尔茨海默氏病)、抗-纤维蛋白抗体(上皮细胞)、抗-角蛋白抗体、抗-细胞角蛋白抗体(肿瘤)、抗-α-连环蛋白抗体(细胞膜)或抗-Tn-抗原抗体(结肠癌、腺癌和胰腺癌)。
合适的抗体的其它特异性实例可包括，但不限于，抗增生细胞核抗原、克隆pc10 (Sigma Aldrich, P8825)；抗平滑肌α肌动蛋白(SmA)、克隆1A4 (Sigma, A2547)；兔抗β连环蛋白(Sigma, C 2206)；小鼠抗泛细胞角蛋白(anti pan cytokeratin)、克隆PCK-26 (Sigma, C1801)；小鼠抗雌激素受体α、克隆1D5 (DAKO, M 7047)；β连环蛋白抗体、克隆15B8 (Sigma, C 7738)；山羊抗波形蛋白(Sigma, V4630)；循环雄激素受体克隆AR441 (DAKO, M3562)；血管假性血友病因子7、角蛋白5、角蛋白8/18、e-钙粘蛋白、Her2/neu、雌激素受体、p53、孕酮受体、β连环蛋白；驴抗-小鼠(Jackson Immunoresearch, 715-166-150)；或驴抗兔(Jackson Immunoresearch, 711-166-152).
在一些实施方案中，结合剂可以是序列-特异性的。序列-特异性结合剂可包括核酸，并且结合剂可以能够识别靶标中的核苷酸或其衍生物的特定线性排列。在一些实施方案中，线性排列可包括邻接的核苷酸或其衍生物，其可各自结合结合剂中的相应的互补核苷酸。在一个备选的实施方案中，序列可以不是邻接的，因为可在探针上存在一个、两个或更多个可以不具有相应的互补残基的核苷酸。基于核酸的结合剂的合适的实例可包括，但不限于，DNA或RNA寡核苷酸或多聚核苷酸。在一些实施方案中，合适的核酸可包括核酸类似物，例如双氧素(dioxygenin) dCTP、生物素dCTP 7-氮鸟苷(azaguanosine)、叠氮胸苷、肌苷或尿苷。
在某些实施方案中，结合剂和靶标两者可包括核酸。在一些实施方案中，基于核酸的结合剂可与核酸靶标形成沃森-克里克键(Watson-Crick bond)。在另一个实施方案中，核酸结合剂可与核酸靶标形成Hoogsteen键，由此形成三链体(triplex)。通过Hoogsteen结合的核酸结合剂可进入核酸靶标的大沟并与位于那里的碱基杂交。以上结合剂的合适的实例可包括识别并结合核酸的小沟和大沟的分子(例如，某些形式的抗生素)。在某些实施方案中，核酸结合剂可与核酸靶标形成沃森-克里克键和Hoogsteen键二者(例如，双PNA探针能够与核酸同时沃森-克里克和Hoogsteen结合)。
核酸结合剂的长度还可决定结合的特异性。结合剂与核酸靶标之间的单个错配的能量成本(energetic cost)，对于较短序列比较长序列相对更高。在某些实施方案中，较小的核酸结合剂的杂交比较长的核酸探针的杂交可更具特异性，因为较长探针可更易错配并可根据条件而持续结合核酸。在某些实施方案中，较短的结合剂在给定温度和盐浓度时可表现出更低的结合稳定性。可对结合短序列表现出较大稳定性的结合剂可用于这种情况(例如，双PNA)。在某些实施方案中，核酸结合剂的长度范围可为约4个核苷酸至约12个核苷酸、约12个核苷酸至约25个核苷酸、约25个核苷酸至约50个核苷酸、约50个核苷酸至约100个核苷酸、约100个核苷酸至约250个核苷酸、约250个核苷酸至约500个核苷酸、或约500个核苷酸至约1000个核苷酸。在某些实施方案中，核酸结合剂的长度范围可大于约1000个核苷酸。不管核酸结合剂的长度，并非结合剂的所有核苷酸残基都可与核酸靶标中的互补核苷酸杂交。例如，结合剂长度可包含50个核苷酸残基，这些核苷酸残基中仅25个可与核酸靶标杂交。在某些实施方案中，可杂交的核苷酸残基可彼此相邻。核酸结合剂可以是单链或者可包括二级结构。在一些实施方案中，生物样品可包括细胞或组织样品，并且生物样品可使用核酸结合剂经受原位杂交(ISH)。在一些实施方案中，除了免疫组织化学(IHC)外，组织样品还可经受原位杂交以获得来自样品的所需信息。
无论结合剂和靶标的类型如何，结合剂和靶标之间的结合特异性还可受结合条件(例如在互补核酸的情况下的杂交条件)的影响。可通过调节pH、温度或盐浓度的一个或多个实现合适的结合条件。
结合剂可以是内在标记的(在合成结合剂期间连接的信号发生器或酶)或非内在标记的(在随后的步骤中连接的信号发生器或酶)。例如对于基于蛋白质的结合剂，内在标记的结合剂可通过使用标记的氨基酸制备。类似地，内在标记的核酸可使用这样的方法合成，即根据用于核酸合成的方法，将信号发生器-标记的核苷酸或信号发生器标记的核苷亚磷酰胺直接掺入到成长的核酸中。在一些实施方案中，结合剂可以使得信号发生器或酶可在随后的阶段掺入的方式来合成。例如，这种较后的标记可通过化学方法通过将活性氨基或硫醇基引入核酸或肽链中完成。在一些实施方案中，结合剂例如蛋白质(例如，抗体)或核酸(例如，DNA)可使用适宜的化学物直接化学标记。
在一些实施方案中，可使用结合剂的组合，所述组合可提供更大的特异性，或在某些实施方案中提供信号的放大。因此，在一些实施方案中，可使用夹层结合剂，其中第一结合剂可结合靶标并起提供二次结合的作用，其中第二结合剂可包括或可不包括标记物，其可进一步提供第三结合(如果需要的话)，其中第三结合成员可包括标记物。
结合剂组合的合适的实例可包括第一抗体-第二抗体、互补核酸或其它配体-受体对(例如生物素-链霉抗生物素)。合适的结合剂对的某些具体实例可包括小鼠抗-myc与具有c-myc抗原决定部位的重组表达的蛋白质；小鼠抗-HisG与带有His-Tag抗原决定部位的重组蛋白；小鼠抗-expressTM与具有抗原决定部位-标记的重组蛋白；兔抗-山羊与山羊IgG主要分子；互补核酸序列与核酸；小鼠抗-硫与硫氧还蛋白融合蛋白；兔抗-GFP与融合蛋白；菠萝蜜凝集素与α-D-半乳糖；和蜜二糖(melibiose)与碳水化合物-结合蛋白、糖、镍偶联基质或肝素。
在某些实施方案中，第一抗体和第二抗体的组合可用作结合剂。第一抗体可具有结合靶标的特定区域的能力，而第二抗体可具有结合第一抗体的能力。第二抗体可在与第一抗体结合之前与信号发生器或酶连接，或者可在随后的步骤能够与信号发生器或酶结合。在一个备选实施方案中，可使用第一抗体和特异性结合配体-受体对(例如生物素-链霉抗生物素)。第一抗体与在配对(pair)的一个成员(例如生物素)连接，而另一成员(例如链霉抗生物素)可用信号发生器或酶标记。第二抗体、抗生物素蛋白、链霉抗生物素或生物素可各自独立地用信号发生器或酶标记。
在一些实施方案中，本文公开的方法可用于免疫染色程序，和第一抗体可用于特异性地结合靶标蛋白质。第二抗体如果存在的化，可用于特异性地结合第一抗体，由此形成第一抗体和随后的试剂(例如信号发生器或酶)之间的桥接。例如，第一抗体可以是小鼠IgG (一种在小鼠中产生的抗体)，并且相应的第二抗体可以是具有能够结合小鼠IgG中区域的区域的山羊抗-小鼠(一种在山羊中产生的抗体)。
在一些实施方案中，当数个第二抗体可结合第一抗体上的抗原决定部位时，可获得信号放大。在免疫染色程序中，第一抗体可以是用于该程序的第一种抗体和第二抗体可以是用于该程序的第二种抗体。在其它实施方案中，第三抗体可用于进一步增加信号。例如，在小鼠中产生的抗体可用于结合靶标。山羊-抗-小鼠的第二抗体可用于结合第一抗体，而标记的驴-抗-山羊抗体可用作第三抗体结合已经与第一抗体结合的第二抗体，初次抗体本身与靶标结合。在一些实施方案中，第一抗体可以是用于免疫染色程序的唯一抗体。
信号发生器
适合于本文公开的方法的信号发生器类型可取决于多种因素，包括所进行的分析的性质、所用能源和探测器的类型、所用电子转移试剂的类型、结合剂的类型、靶标类型。
合适的信号发生器可包括能够提供可探测的信号的分子或化合物。信号发生器可在与能源或电流相互作用后提供特征信号。能源可包括电磁照射源和荧光激发源。电磁照射源可以能够提供任何波长包括可见光、红外和紫外线的电磁能。电磁照射可以是直接光源的形式或可通过光发射化合物例如供体荧光团发射。荧光激发源可以能够产生荧光的来源或可导致光子发射(即，电磁照射、定向电场、温度、物理接触或机械破碎)。合适的信号发生器可提供能够被多种方法探测的信号，所述方法包括光学测量(例如，荧光)、电导率或放射性。合适的信号发生器可以是，例如，光发射、能量接受、发荧光、放射性或猝灭。
合适的信号发生器可以是空间和化学上与其结合的成分例如结合剂相容的。此外，合适的信号发生器可不干扰结合剂与靶标的结合，也可不显著影响结合剂的结合特异性。合适的信号发生器在性质上可以是有机的或无机的。在一些实施方案中，信号发生器可具有化学的、肽或核酸特性。
合适的信号发生器可以被直接检测。可直接检测的部分可以是可通过其发射信号(例如被另一个较低的、特征波长的光激发后发射特定波长的光的荧光标记物)和/或吸收特定波长的光的能力而可被直接检测的部分。
根据本文公开的方法的适合的信号发生器可适应应用电子转移试剂时的操作。在一些实施方案中，信号发生器可以是能够被漂白的，例如，其产生的信号可由于信号发生器在光反应的过程中被修饰而减少或破坏。化学修饰可包括信号发生器的完全分解或信号发生器的信号-生成成分的修饰。在一些实施方案中，信号发生器是带电的。
信号-生成成分的修饰可包括可导致信号生成特征改变的任何化学修饰(例如添加、取代或去除)。例如，解开(unconjugating)缀合的信号发生器可导致信号发生器的发色特征破坏。类似地，取代荧光信号发生器上的荧光-抑制官能团可导致其荧光特性的改变。在一些实施方案中，基本上抵抗由特定化学剂引起的灭活的一个或多个信号发生器可用作在提供的方法中的对照探针。
在一些实施方案中，信号发生器可选自光发射分子、放射性同位素(例如，P32或H3、14C、125I和131I)、光学或电子密度标记、拉曼-活性标签、电子自旋共振分子(例如硝酰基)、电荷转移分子(即，电荷转换分子)、半导体纳米晶体、半导体纳米颗粒、胶体金纳米晶体、微珠、磁珠、顺磁性颗粒。
在一些实施方案中，信号发生器可以是光信号发生器，例如，可包括光-发射分子。光发射分子可响应用特定波长的光照射而发射光。光发射分子可以能够通过发光(在激发时由物质的电磁照射的非-热发射)、磷光(由于吸收照射而延迟发光)、化学发光(由于化学反应的发光)、荧光或偏振荧光而吸收和发射光。光信号发生器的非限制性实例包括荧光信号发生器，例如，荧光团、拉曼-活性标签或发色团。
在一些实施方案中，信号发生器可基本包括荧光团。在一些实施方案中，信号发生器可基本包括与抗体连接的荧光团，例如，在免疫组织化学分析中。可与第一抗体缀合的合适的荧光团包括，但不限于，荧光素、罗丹明、得克萨斯红、载体红(VECTOR Red)、ELF (酶-标记的荧光)、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy7、Fluor X、钙黄绿素、钙黄绿素-AM、CRYPTOFLUOR、Orange (42 kDa)、Tangerine (35 kDa)、Gold (31 kDa)、Red (42 kDa)、Crimson (40 kDa)、BHMP、BHDMAP、Br-俄勒冈(Oregon)、萤光黄、Alexa染料家族、N-[6-(7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]己酰基] (NBD)、BODIPY、硼二吡咯亚甲基二氟化物(boron dipyrromethene difluoride)、1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(DDAO)、二甲基吖啶酮(DAO)、俄勒冈绿、MITOTRACKER Red、藻红蛋白、藻胆蛋白BPE (240 kDa) RPE (240 kDa) CPC (264 kDa) APC (104 kDa)、光谱蓝(Spectrum Blue)、光谱青(Spectrum Aqua)、光谱绿、光谱金、光谱橙、光谱红、红外(IR)染料、环状GDP-核糖 (cGDPR)、Calcofluor White、丽丝胺、伞形酮、酪氨酸或色氨酸。在一些实施方案中，荧光团可以是花青、罗丹明、香豆素或pyrelium染料。在一些实施方案中，信号发生器可基本包括花青染料。在进一步的实施方案中，信号发生器可基本包括Cy2染料、Cy3染料、Cy5染料或Cy7染料中一个或多个。在备选的实施方案中，信号发生器可以是BODIPY、罗丹明、1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(DDAO)或7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(DAO)。
在一些实施方案中，信号发生器可以是FRET对的部分。FRET对包括两种荧光团，当定位彼此接近时，其能够经历FRET以产生或消除可检测的信号。供体的某些实例可包括Alexa 488、Alexa 546、BODIPY 493、Oyster 556、Fluor (FAM)、Cy3或TTR (Tamra)。接受器的某些实例可包括Cy5、Alexa 594、Alexa 647或Oyster 656。
如上所述，一个或多个上述分子可用作信号发生器。在一些实施方案中，一个或多个信号发生器可适应信号破坏，并且信号发生器可基本包括能够被光敏化化学漂白作用漂白的分子。在一些实施方案中，信号发生器可包括能够在光反应中被化学修饰的荧光团，所述光反应也涉及电子转移试剂和照射。在一些实施方案中，信号发生器可基本包括花青、BODIPY、罗丹明或吖啶酮(例如，DDAO和DAO)，其可在也包括添加电子转移试剂和照射的光反应中被修饰。在一些实施方案中，信号发生器可包括Cy2染料、Cy3染料、Cy5染料或Cy7染料中的一个或多个，这些染料可被光敏化化学漂白作用漂白。
酶和酶底物
在一些实施方案中，探针可包括与酶偶联的结合剂。在一些实施方案中，合适的酶催化酶底物的化学反应，以形成能结合存在于样品中的受体(例如，酚基)的反应产物。受体可以是外源性的(即，非内在地与样品或固体-支持物连接的受体)或内源性的(内在地存在于样品或固体-支持物中的受体)。因为单一酶可催化底物的化学反应以共价结合靶标附近的多个信号发生器，因此可进行信号放大。
在一些实施方案中，合适的酶也可以在光反应的过程中能够被灭活的。合适的酶的实例包括过氧化物酶、氧化酶、磷酸酯酶、酯酶和糖苷酶。合适的酶的具体实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、脂肪酶和葡萄糖氧化酶。在一些实施方案中，酶是选自辣根过氧化物酶、细胞色素C过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、微过氧化物酶、髓过氧化物酶、乳酸过氧化物酶和大豆过氧化物酶的过氧化物酶。
在某些实施方案中，酶在光反应的过程中不被灭活，但在光反应完成之前或之后进行的独立的灭活步骤中被灭活。灭活步骤可包括将酶灭活试剂应用于包含酶的样品。
在一些实施方案中，结合剂和酶可包括在单一实体中，例如能够结合靶标并且还催化底物的化学反应的蛋白质分子。在其它实施方案中，结合剂和酶可包括在分开的实体中，并可通过共价键形成或通过使用配体-受体缀合物对(例如，生物素链霉抗生物素)偶联。
可根据所用的酶和样品中可用于结合的靶标选择酶底物。例如，在包括作为酶的HRP的实施方案中，底物可包括取代的苯酚(例如，酪胺)。HRP对酪胺的反应可产生激活的酚底物，其可结合内源性的受体像存在于生物样品的表面蛋白质上的富电子部分(例如酪氨酸或色氨酸)或酚基。在其中3-甲基-2-苯并噻唑啉酮盐酸盐(MBTH)可与HRP酶一起用作底物的备选实施方案中，外源性受体像对-二甲基氨基苯甲醛(DMAB)可在与底物反应之前粘附于固体支持物或生物样品。
在某些实施方案中，酶底物可在与酶反应之后被去磷酸化。去磷酸化反应产物可以能够结合样品或固体-支持物中的内源性或外源性受体(例如，抗体)。例如，酶可包括碱性磷酸酶(AP)和底物可包括NADP、取代的磷酸酯(例如，硝基苯基磷酸酯)或磷酸化生物素。因此受体可包括NAD结合蛋白、对去磷酸化反应产物的抗体(例如，抗硝基-苯酚)、抗生物素蛋白，或链霉抗生物素。在一些实施方案中，底物可在酶作用时产生不溶性产物，其可沉积在生成它们的近处。这样的底物的非限制性实例可包括用于HRP的二氨基联苯胺(diaminobenzidine) (DAB)和用于AP的ELF。
在某些实施方案中，酶可包括β-半乳糖苷酶和底物可包括荧光素或香豆素的β-半乳吡喃糖基-糖苷。受体可包括对去糖基化部分的抗体(例如，抗-荧光素或抗-香豆素)。在一些实施方案中，多个酶组合像HRP/AP可用作酶。底物可包括磷酸化的取代的苯酚例如，磷酸酪氨酸，其可在与HRP反应之前经AP去磷酸化，形成能够结合基于酚基或富电子部分的受体的反应产物。
酶底物的反应产物可进一步地能够提供可检测的信号。在一些实施方案中，用于本文公开的方法的酶底物可包括非-发色的或非-化学发光的底物，即酶和酶底物的反应本身可不产生可检测的信号。用于本文公开的方法的酶底物可包括外来的信号发生器(例如，荧光团)作为标记物。信号发生器和酶底物可直接(如，含有荧光标记物的酶底物)或间接(例如，通过配体-受体缀合物对)连接。在一些实施方案中，底物可包括保护的功能团(例如，巯基)。激活的底物结合受体之后，官能团可以脱去保护并与信号发生器缀合，所述缀合使用具有硫醇反应性基团的信号发生器(例如，马来酰亚胺或碘代乙酰基)进行。
在一些实施方案中，探针可包括辣根过氧化物酶和底物选自取代的苯酚(例如，酪胺)。在一些实施方案中，辣根过氧化物酶引起激活的酚底物与存在于样品中的酚基共价结合。在一些实施方案中，探针可包括与HRP偶联的结合剂和底物可包括与荧光团偶联的酪胺。
电子转移试剂和光反应
电子转移试剂可包括可参与和能够经历光激发的分子的光反应的一个或多个化学物。能够经历光激发的分子可以是信号发生器。电子转移试剂可与固体、溶液、凝胶，或悬浮液形式的样品接触。
在某些实施方案中、电子转移试剂可包括硼酸盐。在一些实施方案中，硼酸盐由以下结构式表示：
其中：
R1、R2和R3各自独立地是烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)烷基氨基、氨基、羟基、氰基、卤素或硝基。
R4是烷基、烯基或炔基，其中烷基、烯基或炔基任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)烷基氨基、氨基、羟基、氰基、卤素或硝基，和
M+选自无机阳离子和有机阳离子。
在一些实施方案中，M+选自无机阳离子，例如，Li+、Na+或K+。在其它实施方案中，M+选自有机阳离子。有机阳离子的非限制性实例可包括NR4+，其中各R独立地是氢、取代的或未取代的烷基(例如，羟基烷基、氨基烷基或铵烷基)或取代的或未取代的芳基(例如，苯基、萘基和蒽基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡喃基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、噻唑、噁唑基和四唑)。
在一些实施方案中，R1、R2和R3各自是芳基。在一些实施方案中，芳基是苯基。在一些实施方案中，苯基是未取代的苯基。
在一些实施方案中，R4是任选取代的烷基。在一些实施方案中，R4为未取代的丁基。
在一些实施方案中，R1、R2和R3各自是任选取代的芳基和R4是任选取代的烷基。在进一步的实施方案中，R1、R2和R3各自为未取代的苯基和R4为未取代的丁基，和硼酸盐为三苯基丁基硼酸盐。
在一些实施方案中，电子转移试剂是高水溶性硼酸盐。高水溶性硼酸盐是可在信号漂白后通过不添加促成剂的简单PBS洗涤从样品基本除去的硼酸盐。在一些实施方案中，高水溶性硼酸盐是具有小烷基C3-C5的四烷基硼酸盐。在一些实施方案中，高水溶性硼酸盐在硼酸盐的烷基或芳基上具有亲水性官能度。在一些实施方案中，亲水性基团是短的低聚聚乙二醇链。在一些实施方案中，高水溶性硼酸盐的水溶解性为> 20 mM。
在一些实施方案中，M+是无机阳离子。在一些实施方案中，无机阳离子是Li+、Na+或K+。在一个实施方案中，M+是Li+。
其它合适的电子转移试剂可包括亚磺酸盐、烯醇化物、羧酸盐(例如，抗坏血酸)、有机金属化合物和胺(例如，三乙醇胺和N-苯基甘氨酸)。这些和其它电子转移试剂先前已经描述(参加，例如，Macromoleculers1974, 7, 179-187；Photogr. Sci. Eng.1979, 23, 150-154；Topics in Current Chemistry, Mattay, J., Ed.；Springer-Verlag: Berlin, 1990, Vol. 156, pp 199-225；和Pure Appl. Chem.1984, 56, 1191-1202)。
选择要用于光敏化化学漂白的电子转移试剂，以使电子转移试剂和信号发生器之间的光反应是高能(energetically)有利的。在一些实施方案中，电子转移试剂和光激发的信号发生器形成电子供体/受体对，其中自电子转移试剂向信号发生器的电子转移是高能有利的。电子转移可进一步地导致信号发生器的化学修饰，导致信号发生器的漂白。能形成电子供体/受体对的电子转移试剂和信号发生器的实例包括作为电子转移试剂的三芳基烷基硼酸盐例如三苯基丁基硼酸盐和作为信号发生器的花青染料(例如，Cy3和Cy5)、BODIPY、罗丹明或吖啶酮染料。
一种或多种上述电子转移试剂可与防止靶标修饰的添加剂组合用于本文公开的方法，这取决于信号发生器、酶、结合剂、靶标或生物样品对光激发和/或随后与电子转移试剂的光反应的易感性。在一些实施方案中，在防止靶标修饰的添加剂存在下，信号发生器经照射的光激发和随后的电子转移试剂和光激发的信号发生器之间的光反应基本不影响结合剂、靶标和生物样品的完整性。在一些实施方案中，在防止靶标修饰的添加剂存在下，信号发生器经照射的光激发和随后的光反应不影响结合剂和靶标之间结合的特异性。
在其中两个或更多个(至多5个)信号发生器可同时地使用的一些实施方案中，光反应可以能够选择性地修饰一个或多个信号发生器。这种选择性可来自经以特定波长照射的信号发生器的选择性光激发。选择照射波长以使一个或多个信号发生器可被光激发，而剩下的可存在于样品中的一个或多个信号发生器可保持不受影响。在一些实施方案中，限于520-580 nm之间范围的波长的照射可用于Cy3染料的选择性光激发。在其它实施方案中，限于620-680 nm之间范围的波长的照射可用于Cy5染料的选择性光激发。在备选的实施方案中, 选择性光激发可通过使用激光实现。
光激发的信号发生器进一步地经受光反应的倾向性，可取决于如上讨论的电子转移试剂的选择，以及取决于反应条件，例如温度、溶剂和pH。
在一些实施方案中，光敏化化学漂白在4-50℃的温度下，更优选地在20-30℃的温度下进行。
在一些实施方案中，光敏化化学漂白在溶液中进行。在一些实施方案中，溶液是缓冲溶液。在进一步的实施方案中，缓冲溶液是在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中缓冲的溶液。在一些实施方案中，溶液在5-9的pH下缓冲。在优选的实施方案中，溶液的pH是6-8。
防止靶标修饰的添加剂
防止靶标修饰的添加剂包括自由基清除剂和单线态氧淬灭剂。采用添加剂由于提高样品完整性而进一步改进光敏化化学漂白技术，从而允许多轮染色、成像、漂白和复染色，这使得能够扫描许多生物标志物靶标，允许定量分析单个生物样品，例如组织切片中的多个生物标志物，而不改变生物标志物的可检测性。
光敏化化学漂白的机制基于所激发的染料(受体)和电子转移试剂(供体)之间的电子转移，接着将自由基从电子转移试剂添加到染料分子，这使得染料经化学修饰为非荧光物类。该方法生成自由基中间体，自由基中间体除了淬灭染料之外，还与例如一些蛋白表位、非饱和脂质或DNA碱基反应，使其检测在后续轮次中较不稳健。另一个潜在的问题是通过光激发荧光染料分子产生反应性高的单线态氧物类，其也可以破坏靶标。自由基和单线态氧猝灭剂被用于清除从染料附近扩散远离的任何自由基或活性氧物类，从而防止任何靶标修饰。因为电子转移仅仅发生在电子转移试剂和染料都彼此接近时，并因此在该染料的附近产生自由基，并且该自由基可以很容易地与染料反应，所以染料仍然被猝灭。同样在染料激发期间产生的任何单线态氧或其他活性氧物类在扩散远离并与单线态氧/自由基猝灭剂相互作用之前具有破坏染料的可能性。与在不存在这种清除剂添加剂时的光敏化化学漂白相比，在自由基和单线态氧清除剂存在时实现了抗原效应的减少。
抗氧化剂或自由基清除剂是指与各种自由基直接反应的任何添加剂，包括过氧自由基(ROO.)、CCl3.和HO.以及超氧化物自由基(O2.-)。所述添加剂的实例不限于维生素C (抗坏血酸)、没食子酸正丙酯、巯基乙醇、盐酸半胱氨酸、叔丁基羟基甲苯(BHT)、环庚三烯(CHT)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、1,4-二氢-o-甲苯酰胺(TA)、维生素E(α-生育酚)和trolox。
单线态氧是另一种类型的由荧光团的三重态敏化产生的活性氧物类。并非所有的自由基清除剂/猝灭剂可有效地对抗单线态氧，但一些自由基猝灭剂可以有效地淬灭单线态氧。例如，抗氧化剂例如α-生育酚和抗坏血酸也可以作为单线态氧清除剂。一些猝灭剂例如姜黄素和DABCO是有效的单线态氧猝灭剂，但对抗自由基没有效果。
在某些实施方案中，防止靶标修饰的添加剂包括无机化合物。这些包括清除氢、羟基自由基的碱性无机盐，例如碳酸盐、碳酸氢盐、高锰酸盐、碘化物、硝酸盐、亚铁氰化物、氯化物盐。在又其他实施方案中，这些无机化合物可以包括过渡金属的盐或含有金属离子例如Fe(II)、Co(II)、Mn(II)和Ru(II)的络合物，其可以结合NO和/或活性氧物类(ROS)并与之反应。在某些实施方案中，防止靶标修饰的添加剂包括NO清除剂，例如具有二硫代氨基甲酸酯的铁络合物或具有聚胺-聚羧酸酯骨架的钌化合物。在其他实施方案中，无机添加剂包括金属辅因子，例如硒、铁、锰、锌或铜和相应的抗氧化酶，例如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶等。
一些添加剂的化学结构在此示出：
(抗坏血酸)
(没食子酸正丙酯)
(DABCO)
在光敏化化学漂白过程中使用自由基或单线态氧猝灭剂(即添加剂)保存生物样品的免疫原性，以进行额外靶标的复染色。这通过将一种或多种自由基/单线态氧/活性氧物类清除剂添加到电子转移试剂然后将染色的载玻片在该混合物中暴露于光来实现。示例性过程涉及用紫外或可见光(300-700nm波长)照射到透明容器，其包括电子转移试剂(例如，三烷基芳基硼酸盐)和自由基清除剂/单线态氧清除剂添加剂的水溶液，且支持用荧光生物标志物染色的组织的载玻片浸入其中。来自电子转移试剂的光子直接激发荧光染料分子和产生自由基和/或活性氧物类，其与染料分子反应并使染料分子化学修饰，由此淬灭其荧光。未被用于淬灭染料的自由基和所产生的任何单线态氧，虽然能够与靶标反应，但被清除剂添加剂有效淬灭。
尽管下面提供的实施例涉及花青染料的漂白，但使用清除剂并不限于这些染料。清除剂淬灭光敏化化学漂白过程中由于染料-电子转移试剂复合物产生的自由基物类而产生的自由基，或在该过程之后淬灭自由基。用清除剂的自由基猝灭可与染料淬灭竞争，这取决于所用猝灭剂浓度，以及电子转移试剂和染料之间的电子转移机制。当染料猝灭通过分子内电子转移机制发生时，与分子间电子转移相比，产生与染料反应的自由基机会增加，其中自由基可以具有更大的机会扩散远离染料并与样品或自由基猝灭剂反应。在某些实施方案中，清除剂的浓度低于电子转移试剂的浓度。在某些优选的实施方案中，清除剂的浓度是电子转移试剂浓度的至多1/10。在某些更优选的实施方案中，清除剂的浓度是电子转移试剂浓度的至多1/100。
在一个优选的实施方案中，电子转移试剂是硼酸盐，例如三芳基烷基硼酸盐，例如三苯基丁基硼酸盐，和信号发生器包括荧光染料，例如花青染料(例如，Cy3和Cy5)、BODIPY、罗丹明或吖啶酮染料。
序贯地分析生物样品，接触和结合探针
生物样品可与探针接触以使探针结合生物样品中的靶标。在一些实施方案中，靶标可不易实现与探针的结合，而生物样品可被进一步地处理以促进靶标和探针中的结合剂之间的结合，例如通过抗原恢复，酶促消化，抗原决定部位修复，或封闭。
在一些实施方案中，探针可与溶液形式的生物样品接触。在一些实施方案中，探针可包括于标记物(信号发生器或酶)偶联的结合剂。结合剂和标记物(信号发生器或酶)可包括在单一分子中，并且探针溶液可以单一步骤应用。或者，结合剂和标记物(信号发生器或酶)可以是不同的实体和探针溶液可以单一步骤或多个步骤应用。在所有实施方案中，对照探针可进一步地与样品中的一个或多个靶标结合。
根据结合剂、靶标和这二者之间的结合的性质，可允许足够的接触时间。在一些实施方案中，可使用过量的探针分子(和相应的结合剂分子)，以确保在生物样品中的所有的靶标被结合。在为结合作用提供足够的时间后，样品可与洗涤溶液(例如，适宜的缓冲液)接触以洗去任何未结合的探针。根据所用探针的浓度和类型，生物样品可经受许多洗涤步骤，在各步骤中采用相同的或不同的洗涤溶液。
在一些实施方案中，生物样品可在第一结合步骤中与一个以上的探针接触。多个探针可以能够结合生物样品中的不同靶标。例如，生物样品可包括两个靶标：靶标1和靶标2，且两组探针可用于这种场合：探针1 (具有能够结合靶标1的结合剂1)和探针2 (具有能够结合靶标2的结合剂2)。多个探针也可包含多个多组靶标-结合探针。多个探针可同时地与生物样品接触(例如，作为单一混合物)或序贯地与生物样品接触(例如，探针1可与生物样品接触，接着经洗涤步骤以除去任何未结合的探针1，接着使探针2与生物样品接触，等)。
可同时地结合靶标的探针的数目可取决于所用检测的类型，即是说，可达到的光谱分辨率。例如，对于基于荧光的信号发生器，根据所公开的方法，可使用至多5个不同的探针(提供至多5个光谱可分辨的荧光信号)。关于多个荧光信号发生器，光谱可分辨表明信号发生器的荧光发射谱带是截然不同的, ，即充分非重叠的，以致连接各个信号发生器的结合剂可根据由各个信号发生器生成的荧光信号，使用标准光检测系统进行区分。在某些实施方案中，所有的探针可同时地结合，但在每周期1-5个探针的设置下序贯地进行检测。
在一些实施方案中，在第一结合步骤中，生物样品可基本上与5个或少于5个探针接触。在使用基于酶的探针的实施方案中，可同时地结合靶标的探针数目也可取决于不同的酶的数目及其相应的可获得的底物。
在一些实施方案中，生物样品可包括全细胞、组织样品，或生物样品可附着于微阵列、凝胶或膜。在一些实施方案中，生物样品可包括组织样品。组织样品可通过多种程序获得，包括，但不限于手术切除、抽吸或活检。组织可以是新鲜的或冷冻的。在一些实施方案中，组织样品可以固定和包埋在石蜡中。可固定组织样品或以其它方式通过常规方法保藏；固定剂的选择可由将要对组织进行组织学染色或其它方面分析的目的确定。固定时间的长度可取决于组织样品的尺寸和所用的固定剂。例如，中性缓冲的福尔马林、Bouin's或多聚甲醛可用于固定或保藏组织样品。
在一些实施方案中，可首先固定组织样品，然后通过递增系列的醇脱水、浸润(infiltrated)和用石蜡或其它切片介质包埋，以便可对组织样品进行切片。在备选的实施方案中，可对组织样品进行切片并随后固定。在一些实施方案中，可将组织样品包埋在石蜡中并在其中处理。可使用的石蜡的实例包括，但不限于，Paraplast、Broloid和Tissuemay。一旦组织样品被包埋，样品可经切片机切成可具有在约3微米-约5微米范围内厚度的切片。一旦被切片，则可使用粘合剂将切片附接在载玻片上。载玻片粘合剂的实例可包括，但不限于，甲硅烷、明胶、聚-L-赖氨酸。在实施方案中，如果石蜡被用作包埋料，则可将组织切片去石蜡化并以水再水合。组织切片可例如，通过使用有机试剂(如，二甲苯或逐渐递减系列的醇)而去石蜡化。
在一些实施方案中，除了以上讨论的样品制备程序外，在免疫组织化学之前、期间或之后，组织切片可经受进一步的处理。例如，在一些实施方案中，组织切片可经受抗原决定部位修复方法，例如，将组织样品在柠檬酸盐缓冲液或Tris缓冲液中加热，或在二者中以序贯的方式加热。在一些实施方案中，组织切片可任选地经受封闭步骤，以使任何非-特异性结合最少化。
在一些实施方案中，生物样品或生物样品的部分，或存在于生物样品中的靶标可附接在表面上，例如DNA微阵列或蛋白质微阵列，或附接在固体支持物(例如凝胶、印迹膜、玻璃载玻片、珠或ELISA板)表面上。在一些实施方案中，存在于生物样品的靶标可连接在固体支持物的表面上。在生物样品中的靶标可通过物理键形成、通过共价键形成或二者连接在固体支持物上。
在一些实施方案中，在生物样品中的靶标可粘附于膜并使用本文公开的方法连续地探测。在一些实施方案中，可在样品接触膜之前处理生物样品中的靶标。例如，涉及探测组织样品中的蛋白质靶标的方法的实施方案可包括从组织匀浆或提取物的生物样品提取靶标蛋白质的步骤。固体组织或全细胞可首先使用搅拌机(对于较大的样品体积)、使用匀浆器(较少的体积)或通过超声处理来机械破碎。不同的细胞隔室和细胞器可使用过滤和离心技术分离。还可使用去垢剂、盐和缓冲液以促进细胞的溶解并增加蛋白质的溶解。类似地，涉及探测核酸的方法的实施方案可包括制备DNA或RNA片段的步骤，例如使用限制性内切酶(对于DNA)。
在一些实施方案中，自生物样品提取的靶标可进一步通过凝胶电泳分离。靶标的分离可通过等电点(pI)、分子量、电荷或这些因素的组合来进行。分离的性质可取决于样品的处理和凝胶的性质。合适的凝胶可选自聚丙烯酰胺凝胶、SDS-聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶。
可选择合适的膜以使膜具有非-特异性靶标结合特性。在一些实施方案中，合适的膜可选自聚偏乙烯氟化物膜、硝基纤维素膜或尼龙膜。在一些实施方案中，可选择合适的膜以使膜对多次探测可以是基本上稳定的。在涉及使用蛋白质探针探测靶标的实施方案中，膜可使用封闭液封闭以防止蛋白质探针非-特异性与膜结合。在涉及探测DNA片段的实施方案中，DNA凝胶可用稀HCL溶液或碱溶液处理以促进DNA自凝胶更有效的转移至膜。
在一些实施方案中，膜可经受约60℃-约100℃范围的温度，以使靶标共价地结合膜，例如使DNA靶标结合硝基纤维素膜。在一些实施方案中，膜可暴露于紫外线照射，以使靶标共价地结合膜，例如使DNA靶标结合尼龙膜。在一些实施方案中，在生物样品中的靶标印迹于膜上之前，可不经电泳分离，而是可例如以点印迹技术直接在膜上探测。
在制备组织样品或膜后，探针溶液(例如，标记的-抗体溶液)可与组织切片或膜在适合于结合剂结合靶标(例如，抗原)的条件下，接触足够的时间段。如早先所描述的，可采用两种检测方法：直接法或间接法。在直接检测中，信号发生器-标记的第一抗体(例如，荧光团-标记的第一抗体或酶-标记的第一抗体)可与组织样品或膜中的抗原一起温育，其可目测而无需进一步的抗体相互作用。在间接检测中，未缀合的第一抗体可与抗原一起温育，然后标记的第二抗体可结合第一抗体。当数个第二抗体可与第一抗体上的不同的抗原决定部位反应时可发生信号放大。在一些实施方案中，两个或更多个(最多5个)第一抗体(来自不同的物种，标记的或未标记的)可与组织样品接触。然后未标记的抗体可与相应的标记的第二抗体接触。在备选的实施方案中，可使用第一抗体和特异性结合配体-受体对(例如生物素-链霉抗生物素)。第一抗体可连接于所述对的一个成员(例如生物素)，而另一成员(例如链霉抗生物素)可用信号发生器或酶标记。第二抗体、抗生物素蛋白、链霉抗生物素或生物素可各自独立地用信号发生器或酶标记。
在其中第一抗体或第二抗体可与酶促标记物缀合的实施方案中，可加入荧光信号发生器-偶联的底物以提供抗原的目测。在一些实施方案中，底物和荧光信号发生器可包括在单一分子中并可以单一步骤应用。在其它实施方案中，底物和荧光信号发生器可以是不同的实体并可以单一步骤或多个步骤应用。
偶联结合剂的酶可与底物反应以催化底物的化学反应，使荧光信号发生器-偶联的底物与生物样品共价地结合。在一些实施方案中，酶可包括辣根过氧化物酶和底物可包括酪胺。辣根过氧化物酶(HRP)与酪胺底物的反应可使酪胺底物共价地结合存在于样品中的酚基。在使用酶-底物缀合物的实施方案中，当一个酶可催化多个底物分子时，可获得信号放大。在一些实施方案中，可采用本文公开的方法，使用间接检测方法(如，使用第一-第二抗体)、使用HRP-酪胺信号放大方法、或这两种方法的组合(例如，间接HRP-酪胺信号放大方法)检测低丰度靶标。信号放大技术结合到本文公开的方法和相应的结合的信号放大技术的类型可取决于特定靶标所需的灵敏性和包括在方案中的步骤数目。
检测来自探针或来自第一组多个探针的信号
来自信号发生器的信号可使用检测系统检测。所用的检测系统的性质可取决于所用的信号发生器的性质。检测系统可包括电荷耦合装置(CCD)检测系统、荧光检测系统、电检测系统、胶片检测系统、化学发光检测系统、酶检测系统、光学检测系统、近场检测系统或全内反射(TIR)检测系统。
可采用上述技术中的一种或多种以检测来自信号发生器(与结合剂偶联或与酶底物偶联)的信号的一个或多个特征。在一些实施方案中，信号强度、信号波长、信号点、信号频率或信号移位可使用上述技术中的一种或多种测定。在一些实施方案中，可观测、测量和记录信号的一个或多个上述特征。
在一些实施方案中，观测和检测的信号是荧光信号，和结合生物样品中的靶标的探针可包括其为荧光团的信号发生器。在一些实施方案中，荧光信号可通过使用荧光检测系统确定荧光波长或荧光强度来测定。在一些实施方案中，可原位检测信号，即，信号可直接自信号发生器检测，所述信号发生器通过结合剂与生物样品中的靶标联合。在一些实施方案中，来自信号发生器的信号可在生物样品内分析，避免了对分离的基于阵列的检测系统的需求。
在一些实施方案中，检测信号可包括捕获生物样品的图像。在一些实施方案中，根据本文公开的方法，连接于成像装置的显微镜可用作检测系统。在一些实施方案中，可激发信号发生器(如，荧光团)，并且获得的信号(如，荧光信号)可以数字信号(例如，数字化图像)的形式被观测和记录。对于在样品中结合的不同的信号发生器(如果存在的话)，可使用适宜的荧光滤波器重复相同的程序。
在一些实施方案中，多个不同类型的信号可在同一样品中检测到。例如，一个靶标可用荧光探针检测，并且同一样品中的第二靶标可用发色的探针检测。
应用电子转移试剂和照射以启动光反应来修饰信号
为修饰信号，可将电子转移试剂应用于样品，随后样品可经照射以启动光反应。在某些实施方案中，防止靶标修饰的添加剂在电子转移试剂应用之前、期间或之后但在照射样品之前应用于样品。在一些实施方案中，信号修饰可包括一个或多个信号特征的改变，例如，降低信号强度、信号峰的移动或共振频率的改变。在一些实施方案中，光反应可通过基本上灭活(即漂白)荧光信号发生器和酶(如果使用的话)修饰信号。
在某些实施方案中，电子转移试剂和防止靶标修饰的添加剂可以呈溶液的形式。在一个实施方案中，电子转移试剂和防止靶标修饰的添加剂以含水缓冲溶液的形式存在。
在一些实施方案中，电子转移试剂可以是硼酸盐。在进一步的实施方案中，电子转移试剂可以是以0.001 mM-1000 mM浓度存在的三苯基丁基硼酸的锂盐。在优选的实施方案中，硼酸盐的浓度是20 mM-100 mM。在一些实施方案中，电子转移试剂(例如，硼酸盐)的浓度可表示1-60当量浓度的信号发生器(例如，荧光染料)。
在一些实施方案中，防止靶标修饰的添加剂可以是抗氧化剂或自由基清除剂。在其它实施方案中，抗氧化剂或自由基清除剂可以是抗坏血酸、没食子酸正丙酯、巯基乙醇、盐酸半胱氨酸、叔丁基羟基甲苯(BHT)、环庚三烯(CHT)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、1,4-二氢-o-甲苯酰胺(TA)、α-生育酚和trolox。在一些实施方案中，防止靶标修饰的添加剂可以是单线态氧淬灭剂。在其它实施方案中，单线态氧淬灭剂是α-生育酚、抗坏血酸、姜黄素或DABCO。
在某些实施方案中，清除剂的浓度低于电子转移试剂的浓度。在某些优选的实施方案中，清除剂的浓度是电子转移试剂浓度的至多1/10。在某些更优选的实施方案中，清除剂的浓度是电子转移试剂浓度的至多1/100。
与电子转移试剂接触的样品的照射可进行预定量的时间。照射的持续时间可取决于电子转移试剂和光激发的信号发生器之间的光反应所需的持续时间。在一些实施方案中，照射步骤可进行约1毫秒至约60分钟，优选约100毫秒至约15分钟，甚至更优选约1秒至约5分钟。在一些实施方案中，照射步骤可进行至未观测到来自信号发生器的残余信号。在一些实施方案中，照射步骤可于室温下进行。
在一些实施方案中，光反应在4-50℃的温度，更优选在20-30℃的温度下进行。
在一些实施方案中，光反应在溶液中进行。在一些实施方案中，溶液是缓冲的溶液。在进一步的实施方案中，缓冲的溶液是在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中缓冲的溶液。在一些实施方案中，溶液在5-9的pH下被缓冲。在优选的实施方案中，溶液的pH是6-8。
在一些实施方案中，可选择光反应的条件(例如，照射波长)，以使结合剂、靶标、生物样品及结合剂和靶标之间的结合可不受光反应的影响。在一些实施方案中，光反应可仅影响信号发生器和酶(如果使用的话)和电子转移试剂，并可不影响靶标/结合剂结合或结合剂的完整性。因此，通过举例的方式，结合剂可包括第一抗体或第一抗体/第二抗体的组合。依据本文公开的方法的光反应可仅影响信号发生器，并且第一抗体或第一抗体/第二抗体的组合可基本上保持不受影响。在一些实施方案中，在样品与电子转移试剂和任选的防止靶标修饰的添加剂接触并随后照射以启动光反应后，结合剂(如，第一抗体或第一抗体/第二抗体的组合)可保持结合生物样品中的靶标。
在一些实施方案中，在照射样品后，用洗涤溶液洗涤样品以从样品去除残余电子转移试剂。在某些实施方案中，用PBS溶液洗涤样品。残余硼酸盐的有效去除是重要的，因为样品中的残余硼酸盐可影响来自后续染色的信号。PBS洗涤后残余硼酸盐的量取决于所用的硼酸盐。高水溶性硼酸盐通过单独PBS洗涤而基本去除。在其它情况下，单独PBS不足以去除显著量的硼酸盐。在此情况下，可向PBS中添加促成剂或可在PBS洗涤前使用促成剂。在这样的实施方案中，替代PBS溶液洗涤或在PBS溶液洗涤后，用有效从样品去除残余电子转移试剂的含有促成剂的洗涤溶液洗涤样品。在一些实施方案中，这些促成剂包括有机溶剂、阳离子试剂、离液剂、去污剂或其组合。在优选的实施方案中，促成剂是乙醇。
在一些实施方案中，可在光反应后检测信号的特征以确定信号修饰的有效性。例如，可在光反应之前观测到色彩，而在光反应后可以不存在色彩。在另一个实例中，可在在光反应之前和光反应之后观测来自荧光信号发生器的荧光强度。在一些实施方案中，预定量的信号强度下降可称为信号修饰或光敏化化学漂白或漂白。在一些实施方案中，信号的修饰或光敏化化学漂白可指信号强度下降的量在大于约50%的范围。在一些实施方案中，信号的修饰或光敏化化学漂白可指信号强度下降的量在大于约60%的范围。在一些实施方案中，信号的修饰或光敏化化学漂白可指信号强度下降的量在大于约80%的范围。在一些实施方案中，信号的修饰或光敏化化学漂白可指信号强度下降的量在大于约90%的范围。在一些实施方案中信号的修饰或光敏化化学漂白可指信号强度下降的量在大于约95%的范围。在一些实施方案中，信号的修饰或光敏化化学漂白可指信号强度下降的量在约100%的范围，或指完全漂白。
使样品与后续探针接触并结合随后的靶标
使用本文以上对第一探针描述的一个或多个程序，可使生物样品或样品与后续探针接触。后续探针可以能够结合与在早先步骤中结合的靶标不同的靶标。在其中多个探针可与在早先的探针接触步骤中的生物样品接触的实施方案中，后续探针可以能够结合与早先的探针组结合的靶标不同的靶标。在一些实施方案中，生物样品可在后续探针接触步骤中与多个探针接触。在一些实施方案中，当多个多组探针应用于第一步骤中的生物样品时，可自后续的探针组生成后续的信号组。第二组信号的生成可包括第二组探针与包含信号发生器的分开部分的缔合。例如，第二组探针可包含生物素标签，和包含信号发生器的部分还可包含能够结合生物素标签的链霉抗生物素。或者，第二组信号的生成可包含未掩蔽的信号-生成部分，例如，通过修改荧光团-猝灭剂对之间的距离。在一些实施方案中，第二组信号的生成可通过与连接第二组探针的序列互补的标记探针的杂交进行。
在其中与酶偶联的结合剂可用作探针的实施方案中，结合步骤还可包括涉及酶与偶联荧光信号发生器的酶底物反应的反应步骤。
在一些实施方案中，用于不同的结合步骤的信号发生器(如，荧光信号发生器)可以相同，即，可在相同的检测通道中检测。当可获得有限数目的检测通道时，在不同的结合步骤中使用相同的信号发生器的方法可允许检测多个靶标。在其中一组探针(2-5个探针)可用于第一结合步骤的一些实施方案中，后续探针可包括与早先的结合步骤相同的信号发生器。例如，第一结合步骤可包括Cy3、Cy5和Cy7-缀合的不同的结合剂。在一些实施方案中，随后的结合步骤也可包括相同的染料组，即Cy3、Cy5和Cy7。
在一些实施方案中，用于不同的结合步骤的信号发生器(如，荧光信号发生器)可以是不同的，即，可在不同的检测通道中独立地检测。例如，在一些实施方案中，第一探针可包括具有在绿色区域内的荧光发射波长的Cy3染料，和后续探针可包括具有在近红外区域内的荧光发射波长的Cy7染料。
在使用结合剂-偶联的酶作为探针的实施方案中，用于不同的结合和反应步骤的酶和底物可以相同。在样品结合随后的酶以防止早先的酶与随后的底物交叉反应之前，早先的酶可在光反应的过程中或在独立的灭活步骤中被灭活。例如，第一结合和反应步骤可包括偶联HRP的结合剂和偶联第一荧光团的酪胺。光诱导的化学漂白步骤可包括基本上灭活荧光团和基本上灭活HRP的步骤。在一些实施方案中，光诱导的化学漂白和灭活步骤可同时地发生。在一些实施方案中，光诱导的化学漂白和灭活步骤可顺序地发生。在优选实施方案中，光诱导的化学漂白在防止靶标修饰的添加剂存在下进行。光诱导的化学漂白和灭活步骤后，样品可与随后的偶联HRP的结合剂接触，所述HRP可进一步地与偶联第二荧光团的酪胺反应。类似地，使用多个迭接的HRP-酪胺作为酶底物缀合物可实现随后的结合和反应步骤，每个结合和反应步骤之后是光诱导的化学漂白和灭活步骤。根据可用于检测的检测通道的数目，第一荧光团和随后的荧光团可以是相同的或不同的。
在一些实施方案中，第一结合步骤可包括一组探针(例如，2-5个探针)，每个探针包括能够结合不同靶标的结合剂和每种酶能够催化不同的底物的化学反应。例如，在一个实施方案中，第一探针组可包括偶联HRP的结合剂1和偶联AP的结合剂2。反应步骤可包括使样品与偶联Cy3的酪胺和偶联Cy7的NADP接触。在酶与其相应的底物反应并观测信号后，花青染料可通过光诱导的化学漂白，任选在防止靶标修饰的添加剂存在下，和在光反应的过程中灭活酶或通过添加合适的灭活剂而被灭活。随后的探测步骤可包括同一组的结合剂-酶和底物-荧光团对或不同组的结合剂-酶和底物-荧光团对。多个探针和底物-信号发生器可与生物样品同时地(例如，作为单一混合物)或连续地(例如，探针1可与生物样品接触，接着洗涤步骤以除去任何未结合的探针1，接着使探针2与物样品接触等)接触。
检测来自后续探针的后续信号
可采用在上文描述的一种或多种检测方法以观测来自后续信号发生器(存在于后续探针中)的后续(例如，第二、第三等)信号的一个或多个特征。在一些实施方案中，信号强度、信号波长、信号点、信号频率或信号移位可使用一种或多种上述技术确定。类似于第一信号，获得的后续信号(例如，荧光信号)可以数字信号的形式(例如，数字化图像)记录。在一些实施方案中，检测后续信号还可包括捕获生物样品的光学图像。
重复接触、结合和检测步骤
在一些实施方案中，在样品与后续(例如，第二、第三等)探针接触后，信号发生器在光反应中的漂白，和来自已经结合的探针的后续探针给予/信号生成可重复多次。在一些实施方案中，在检测来自第二探针的第二信号后，生物样品可与电子转移试剂接触并被照射以修饰来自第二探针的信号。任选地，接触和照射步骤在防止靶标修饰的添加剂存在下进行。此外，第三探针可与生物样品接触，其中第三探针可以能够结合不同于第一和第二探针的靶标。同样地，可检测到来自第三探针的信号，接着应用电子转移试剂和照射以修饰信号，任选在防止靶标修饰的添加剂存在下进行。结合、检测和漂白步骤可使用能够结合另外的靶标的第n个探针反复重复多次，以提供给用户关于使用多种探针和/或信号发生器的多个靶标的信息。在其中偶联酶的结合剂可用作探针的实施方案中，结合步骤还可包括涉及酶与偶联荧光信号发生器的酶底物反应的反应步骤。
在一些实施方案中，漂白、结合、反应(如果可适用的话)和检测步骤可重复一或多次。在一些实施方案中，漂白、结合、反应(如果可适用的话)和检测步骤可重复至少5次、至少15次、至少30次、至少60次、至少100次或至少150次。在一些实施方案中，系列步骤可重复25-30次。在其它实施方案中，系列步骤可重复2-10次。
在一些实施方案中，一系列探针可以序贯方式与生物样品接触，以获得生物样品的多重分析。在一些实施方案中，系列探针组(一组包括至多5个探针)可以序贯方式与生物样品接触，以获得生物样品的多重分析。多重分析通常指使用相同的检测机理分析生物样品中的多个靶标。
在其中在第一步骤中生物样品与多个多组探针接触的一些实施方案中，包括漂白、自后续组的探针生成信号和检测信号的一系列步骤可重复至少5次、至少15次、至少30次、至少60次、至少100次或至少150次。在一些实施方案中，系列步骤可重复25-30次。在其它实施方案中，系列步骤可重复2-10次。
在一些实施方案中，生物样品的成分在漂白、结合、反应(如果可适用的话)和信号检测步骤的重复周期后没有显著的改变。在一些实施方案中，生物样品的成分在漂白步骤期间没有显著的改变。在一些实施方案中，在漂白步骤期间没有显著改变的生物样品成分是靶标。在一些实施方案中，超过80%的靶标在漂白步骤过程中没有显著改变。在一些实施方案中，超过95%的靶标在漂白步骤过程中没有显著改变。
样品与一个或多个形态学染色剂接触
在一些实施方案中，生物样品可包括细胞或组织，和样品可在与在第一探针或后续探针的接触步骤之前、期间或之后与形态学染色剂接触。形态学染色剂可包括可染色不同的细胞成分的染料，以促进细胞类型或疾病状态的鉴定。在一些实施方案中，形态学染色剂可容易地区分探针中的信号发生器，即是说，染色剂可不发射可与来自探针的信号重叠的信号。例如，对于荧光形态学染色剂，来自形态学染色剂的信号可不发出与用于探针的荧光团的相同波长的自体萤光。
形态学染色剂可在任一上述步骤之前、期间或之后与生物样品接触。在一些实施方案中，形态学染色剂可在第一探针接触步骤的同时与生物样品接触。在一些实施方案中，形态学染色剂可在样品与电子转移试剂和任选的防止靶标修饰的添加剂接触之前与生物样品接触，并在第一探针结合靶标之后进行照射。在一些实施方案中，形态学染色剂可在样品与电子转移试剂和任选的防止靶标修饰的添加剂接触之后与生物样品接触，并照射以修饰信号。在一些实施方案中，形态学染色剂可在第二探针接触步骤的同时与生物样品接触。在一些实施方案中，生物样品可在第二探针结合靶标后与形态学染色剂接触。在其中形态学染色剂可导致对于来自信号发生器的荧光信号的本底噪音的一些实施方案中，形态学染色剂可在探测、漂白和再探测步骤后与生物样品接触。例如，形态学染色剂像H&E可本文公开的方法之后连续地成像和记录。
在一些实施方案中，发色团、荧光团或酶/酶底物可用作形态学染色剂。可用作形态学染色剂(及其靶标细胞、亚细胞区室或细胞成分)的发色团的合适实例可包括，但不限于，苏木精(核酸)、Orange G (血细胞、胰腺和垂体细胞)、Light Green SF (胶原蛋白)、Romanowsky-Giemsa (全细胞形态学)、May-Grunwald (血细胞)、Blue Counterstain (Trevigen)、Ethyl Green (CAS) (淀粉样蛋白)、Feulgen-Naphthol Yellow S (DNA)、Giemsa (区分地染色各种细胞区室)、Methyl Green (淀粉样蛋白)、派若宁(pyronin) (核酸)、Naphthol-Yellow (红细胞)、Neutral Red (细胞核)、Papanicolaou染色剂(苏木精、Orange G和Bismarck Brown的混合物(全细胞形态学))、Red Counterstain B (Trevigen)、Red Counterstain C (Trevigen)、Sirius Red (淀粉样蛋白)、Feulgen试剂(副品红) (DNA)、Gallocyanin chrom-alum (DNA)、Gallocyanin chrom-alum和Naphthol-Yellow S (DNA)、Methyl Green-Pyronin Y (DNA)、Thionin-Feulgen试剂(DNA)、Acridine Orange (DNA)、Methylene Blue (RNA和DNA)、Toluidine Blue (RNA和DNA)、Alcian blue (碳水化合物)、Ruthenium Red (碳水化合物)、Sudan Black(脂质)、Sudan IV (脂质)、Oil Red-O (脂质)、Van Gieson's三色染色剂(酸性品红和苦味酸混合物) (肌肉细胞)、Masson三色染色剂(苏木精、酸性品红和Light Green混合物) (分别染色胶原蛋白、细胞质、细胞核)、Aldehyde Fuchsin (弹性蛋白纤维)或Weigert染色剂(区分网状纤维和胶原纤维)。
合适的荧光形态学染色剂(及其靶标细胞、亚细胞区室或细胞成分，如果适用的话)的实例可包括、但不限于：4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) (核酸)、Hoechst 33258和Hoechst 33342 (两个双苯酰亚胺) (核酸)、碘化丙啶(核酸)、光谱橙(核酸)、光谱绿(核酸)、奎纳克林(核酸)、Fluorescein-phalloidin (肌动蛋白纤维)、色霉素A 3 (核酸)、吖啶黄-Feulgen反应(核酸)、奥拉明O-Feulgen反应(核酸)、溴化乙啶(核酸)、Nissl染料(神经元)、高亲和力DNA荧光团例如POPO、BOBO、YOYO和TOTO和其它、和与DNA结合蛋白例如组蛋白融合的绿色荧光蛋白质、ACMA、奎纳克林和吖啶橙。
合适的酶(及其初级细胞位置或活性)的实例可包括，但不限于，ATP酶(肌肉纤维)、琥珀酸脱氢酶(线粒体)、细胞色素c氧化酶(线粒体)、磷酸化酶(线粒体)、磷酸果糖激酶(线粒体)、乙酰基胆碱酯酶(神经细胞)、乳糖酶(小肠)、酸性磷酸酶(溶酶体)、亮氨酸氨基肽酶(肝细胞)、脱氢酶(线粒体)、myodenylate脱氨酶(肌细胞)、NADH心肌黄酶(diaphorases) (红细胞)和蔗糖酶(小肠)。
在一些实施方案中，形态学染色剂对光敏化化学漂白可以是稳定的，即是说，形态学染色剂的信号生成特性可基本上不受光反应的影响，所述光反应包括使形态学染色剂与电子转移试剂和任选的防止靶标修饰的添加剂接触并随后照射。在其中生物样品可用探针和形态学染色剂同时染色的一些实施方案中，来自探针的信号的漂白可不改变来自形态学染色剂的信号。在一些实施方案中，形态学染色剂可用作对照以共记录分子信息(通过重复的探测步骤而获得)和形态学信息(通过形态学染色剂获得)。在一些实施方案中，在照射样品时，形态学染色剂不被电子转移试剂和防止靶标修饰的添加剂改变。
使样品与一个或多个对照探针接触
在一些实施方案中，对照探针可结合生物样品中的一个或多个靶标。在一些实施方案中，对照探针可在第一探针接触步骤的同时结合靶标。在一些实施方案中，对照探针可与第一探针同时地应用于生物样品。在一些实施方案中，对照探针可序贯地应用于生物样品，即，在第一探针的应用之前或之后，但在应用电子转移试剂和任选的防止靶标修饰的添加剂和后续的照射之前。
对照探针可包括对光敏化化学漂白是稳定的信号发生器，或在与电子转移试剂和任选的防止靶标修饰的添加剂接触并经后续照射时，信号发生器的信号生成特性基本上不受影响。信号发生器可包括在暴露于电子转移试剂和防止靶标修饰的添加剂和照射期间是稳定的放射性同位素，或者在暴露于电子转移试剂和防止靶标修饰的添加剂和照射时不经化学修饰的荧光团。合适的放射性同位素可包括P32、3H、14C、125I或131I。合适的荧光团可包括DAPI。
在一些实施方案中，合适的信号发生器可偶联结合剂，形成对照探针。例如，放射性标记物可偶联抗体以形成对照探针，并且抗体可结合存在于生物样品的一个或多个靶标抗原。在其它实施方案中，合适的信号发生器可以能够结合在样品中的一个或多个靶标并且还提供可检测的信号，所述信号在电子转移试剂和任选的防止靶标修饰的添加剂的存在下和照射期间是稳定的。例如，合适的对照探针可以是DAPI，其能够结合样品中的核酸并且还能够提供对光敏化化学漂白基本上是稳定的荧光信号，即，其在添加电子转移试剂和防止靶标修饰的添加剂和后续照射后基本上不变化。
在一些实施方案中，对照探针可用于本文公开的方法，以提供靶标对重复的染色步骤的稳定性的指示。例如，对照探针可结合样品中的已知靶标，并且可观测和定量来自对照的信号。然后可在重复的染色步骤期间监测对照信号，以提供靶标或结合剂对电子转移试剂、任选的防止靶标修饰的添加剂和后续照射的稳定性的指示。在一些实施方案中，可监测对照信号的量化度量(例如，信号强度)以在重复的探测步骤后对存在于样品中的靶标定量。
在一些实施方案中，可使用对照探针以获得感兴趣的样品的定量信息，例如在样品中的靶标的浓度或在样品中的靶标的分子量。例如，对照靶标(具有已知的浓度或已知的分子量)可与感兴趣的样品一起装载于印迹技术中。对照探针可结合对照靶标，并观测对照信号。然后可使用以下本文中描述的方法，将对照信号与自感兴趣的样品观测到的信号相关联。
在一些实施方案中，对照探针可用于本文公开的方法以提供多个分子信息(通过重复的探测步骤获得)和形态学信息(例如，使用DAPI获得)的共记录。在一些实施方案中，本文公开的方法可包括共记录例如使用H&E获得的多个荧光图像与亮视野形态学图像。在一些实施方案中，用于重复的探测步骤的探针可不具有可用于以H&E图像记录的任何共同区室信息。可采用对照探针像DAPI核染色剂，以共记录在亮视野图像与荧光图像中用苏木精染色的细胞核。荧光图像和亮视野图像可使用图像记录算法进行共记录，所述图像记录算法分成两类：基于强度和基于特征的技术。
使第一信号和后续信号相关
在一些实施方案中，可分析第一信号、后续信号或第一信号和后续信号以获得有关生物样品的信息。例如，在一些实施方案中，第一信号的存在或不存在可指示生物样品中的第一靶标(能够结合第一结合剂)的存在或不存在。类似地，第二信号的存在或不存在可指示第二靶标(能够结合生物样品中的第二结合剂)的存在或不存在。在其中多靶标可使用多个探针分析的实施方案中，特定信号的存在或不存在可指示生物样品中相应的靶标的存在或不存在。
在一些实施方案中，观测步骤可包括样品中的至少一个靶标的定量测量。在一些实施方案中，可测量信号的强度值(例如，荧光强度)并可与生物样品中的靶标的量相关联。靶标的量和信号强度之间的相互关系可使用校准标准确定。在一些实施方案中，可测量第一和第二信号的强度值并使其与各自的靶标量相关联。在一些实施方案中，通过比较两种信号强度，可确定第一靶标和第二靶标(彼此相对或相对于对照)的相对量。类似地，在可使用多个探针分析多靶标的情况下，在生物样品中的不同靶标的相对量可通过测量不同的信号强度来确定。在一些实施方案中，可如上文描述的那样使用一个或多个对照样品。通过观测样品(感兴趣的生物样品与对照)中的信号的存在或不存在，可获得有关生物样品的信息。例如通过比较患病的组织样品与正常组织样品，可获得有关存在于患病组织样品中的靶标的信息。类似地，通过比较样品(即，感兴趣的样品和一个或多个对照)之间的信号强度，可获得有关样品中靶标的表达的信息。
在一些实施方案中，检测步骤包括共同定位(co-localizing)样品中的至少两个靶标。用于共同定位样品中的靶标的方法描述于2007年3月15日提交的美国专利申请系列号11/686,649，题目为"分析组织样品图像的系统和方法(System and Methods for Analyzing Images of Tissue Samples)"；2006年8月7日提交的美国专利申请系列号11/500,028，题目为"共记录组织微阵列的多通道图像的系统和方法(System and Methods for Co-Registering Multi-Channel Images of a Tissue Micro Array)"；2006年11月30日提交的美国专利申请系列号11/606,582，题目为"对组织微阵列图像评分的系统和方法(System and Methods for Scoring Images of a Tissue Micro Array)；和题目为图像结构的自动分割(Automated Segmentation of Image Structures)的美国专利号8,036,462，其各自通过引用结合到本文中。
在一些实施方案中，可检测生物样品中信号的位置。在一些实施方案中，可使用形态学染色法检测生物信号中的信号的定位。在一些实施方案中，可观测两个或更多个信号的相对定位。信号的定位可与生物样品中的靶标的定位相关联，提供关于生物样品中的不同靶标的定位的信息。在一些实施方案中，可使信号的强度值和信号的定位相关，以获得关于生物样品中的不同靶标的定位的信息。例如相对于在细胞核中，某些靶标可更多地在细胞质中表达，或反之亦然。在一些实施方案中，关于靶标的相对定位的信息可通过比较两个或更多个信号的位置和强度值而获得。
在使用印迹技术的实施方案中，检测步骤可包括检测信号在印迹上的位置。然后可使印迹中的信号位置与连同凝胶中的样品一起负载的校准标准相关，以获得关于不同谱带中的靶标的分子量的信息。在一些实施方案中，信号在印迹上的位置可与靶标的分子量和靶标的等电点相关，例如，在2D-PAGE中。在一些实施方案中，结构蛋白例如肌动蛋白或微管蛋白可用对照探针在蛋白质印迹中探测，以量化样品中的靶标的量。
在一些实施方案中，一个或多个检测或相关步骤可用计算机辅助装置进行。在其中来自信号发生器的信号可以数字图像的形式储存的实施方案中，可进行图像的计算机辅助分析。在一些实施方案中，图像(例如，来自探针和形态学染色的信号)可使用计算机辅助叠影覆盖，以获得生物样品的完整信息，例如拓扑及相关信息。
在一些实施方案中，一个或多个上述方法可以是自动化的和可使用自动系统进行。在一些实施方案中，所有步骤可使用自动系统进行。
本文公开的方法可发现在生物学和在医学的分析、诊断和治疗应用中的用途。在一些实施方案中，本文公开的方法可发现在组织化学，特别是免疫组织化学中的用途。依据本文描述的方法，分析得自患者的细胞或组织样品可用于诊断(例如，鉴定患有特定疾病、已暴露于特定毒素或对特定治疗剂或器官移植反应良好的患者)和预测(例如，鉴定可能发生特定疾病、对特定治疗剂或接受特定器官移植反应良好的患者)。本文公开的方法，可有利于来自相同生物样品的多数(例如，可能无限数目)靶标(例如，疾病标记物)的精确和可靠分析。
实施例
以下实施例仅意欲举例说明根据本发明的方法和实施方案，且同样地不应视为对权利要求书施加限制。
实施例1. 花青染料的光敏化化学漂白：剂量反应
向Cy3的PBS溶液中加入2-60当量的三苯基丁基硼酸锂盐，并将溶液照射4分钟或10分钟。测量于550 nm处的吸光度以监测光敏化化学漂白作用，并对结果绘图，如在图1中所示。带有方块的实线表示在不同浓度的三苯基丁基硼酸盐的存在下，照射Cy3染料4分钟后的A550吸光度。带有菱形的实线表示在不同浓度的三苯基丁基硼酸盐的存在下，照射Cy3染料10分钟后的A550的吸光度。结果证实Cy3漂白的程度随着硼酸盐的浓度的增加而增加。
实施例2. 光反应和热氧化所致Cy3漂白的比较
对漂白Cy3的3种方法进行比较。对于光敏化化学漂白反应，使Cy3与三苯基丁基硼酸锂盐混合并照射20秒。对于热氧化反应，使Cy3与碱性过氧化氢混合并温育20秒。对于对照反应，使Cy3与水一起温育20秒。在各自温育和/或反应之前和之后，比较Cy3溶液在所有3种反应中的色彩。对照反应并不改变其深粉红色色彩。热氧化反应的色彩在热氧化20秒钟后从深粉红色改变为浅粉红色。光敏化化学漂白反应在照射20秒钟后从深粉红色转变为无色。
实施例3. Cy3和Cy5在组织中的光敏化化学漂白
组织微阵列(TMA, Pantomics目录号MTU541C)用Cy3-缀合的细胞角蛋白和Cy5-缀合的泛-钙粘蛋白染色。Cy3和Cy5的光敏化化学漂白通过使染色的TMA与三苯基丁基硼酸锂盐一起温育并照射2分钟完成。在漂白之前和之后，图像在Olympus显微镜上拍摄。在漂白之前和之后用Cy3-缀合的细胞角蛋白染色的样品图像显示在图2中。在漂白之前和之后用Cy5-缀合的泛-钙粘蛋白染色的样品图像显示在图3中。这种数据证实光敏化化学漂白有效地破坏染色组织中的Cy3和Cy5信号。
实施例4. BODIPY的光敏化化学漂白
BODIPY的光敏化化学漂白反应在甲醇/水(含或不含100 mM三苯基丁基硼酸锂盐溶液)中进行。两种样品的照射使用100W卤素灯进行2分钟。包含BODIPY和三苯基丁基硼酸盐的反应瓶的亮黄色色彩在照射后变成淡黄色。照射前(不均匀的虚线)和照射后(实线)反应的荧光光谱示于图4中。荧光光谱证实BODIPY因光敏化化学漂白所致的完全荧光猝灭。包含BODIPY而不含三苯基丁基硼酸盐的反应瓶的亮黄色色彩在照射后维持其亮黄色色彩。
实施例5. 罗丹明的光敏化化学漂白
罗丹明的光敏化化学漂白反应在甲醇/水(含或不含100 mM三苯基丁基硼酸锂盐溶液)中进行。两种样品的照射使用100W卤素灯进行2分钟。包含罗丹明和三苯基丁基硼酸锂盐的反应瓶的亮红色色彩在照射后失去。照射前(不均匀的虚线)和照射后(实线)反应的荧光光谱示于图5中。荧光光谱证实罗丹明因光敏化化学漂白所致的完全荧光猝灭。包含罗丹明而不含三苯基丁基硼酸盐的反应瓶的亮红色色彩在照射后维持其亮红色色彩。
实施例6. 1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(DDAO)的光敏化化学漂白
吖啶酮的光敏化化学漂白反应在甲醇/水(含或不含100 mM三苯基丁基硼酸锂盐溶液)中进行。两种样品的照射使用100W卤素灯进行2分钟。反应物的棕色色彩在照射后变成黄色。照射前(不均匀的虚线)、照射1分钟后(实线)和照射2分钟后(均匀的虚线)反应的荧光光谱示于图6中。荧光光谱还证实在照射所用的有限时间内DDAO的不完全荧光猝灭。包含DDAO而不含三苯基丁基硼酸盐的反应瓶的棕色色彩在照射后维持其棕色色彩。
实施例7：在Cy3的光敏化化学漂白中使用清除剂
1. 制备组织样品
人肺组织阵列样品作为包埋在石蜡中的组织载玻片而获得。这些样品包括腺细胞、鳞状细胞、小细胞和大细胞肺癌的微阵列。
2. 载玻片清洁
将3个石蜡包埋的载玻片在60℃下烘烤1小时，且组织朝上并平行于烘箱架。烘烤后，将载玻片通过温和搅拌10分钟在二甲苯中洗涤而脱蜡。然后将样品如下再水化：在四种递减浓度的乙醇溶液(约100％、95％、70％和50％)中洗涤，然后用1×磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)洗涤。再水化后，将载玻片用1×PBS洗涤。在0.3％ Triton X-100/PBS中进行10分钟洗涤，以进行组织膜透化，接着用1×PBS洗涤。
3. 抗原修复
载玻片清洁过程后，将载玻片用双缓冲剂热诱导的表位修复处理。用高压锅将载玻片暴露于70℃柠檬酸盐缓冲液pH 6.0 (Vector Unmasking Solution)，加热至110℃温度保持4分钟，达到约7psi压力，然后逐渐冷却(最终温度96℃)。将载玻片置于柠檬酸盐缓冲液共20分钟，然后转移到热的(96℃) Tris-EDTA缓冲液pH 9.0，让其在大气压力下在锅中静置，逐渐冷却20分钟。接着在室温下冷却10分钟，在1xPBS中进行一系列洗涤。
4. 封闭
抗原修复后，通过在4℃在10％的驴血清、3％牛血清白蛋白(BSA)溶液中孵育过夜，将载玻片针对非特异性结合而封闭。
5. 染色和成像
将载玻片用DAPI染色并盖上盖玻片。在蛋白染色之前，以20倍拍摄图片，将Cy3和Cy5通道的自发荧光作为基线。将载玻片在1xPBS中去除盖玻片，并用在3％BSA/1×PBS(第1轮)中稀释的Cy3和Cy5直接缀合物的混合物染色，如下表所显示的。孵育在室温进行1小时。孵育后，一系列的1xPBS洗涤除去过量的抗体，将载玻片盖上盖玻片。对样品进行成像，然后去除盖玻片。在去除盖玻片之后，如下所述在表中的条件下，将每张载玻片漂白。
漂白方案：
(a)载玻片1-用在PBS中制备的丁基硼酸盐10mM处理，用可见灯照射载玻片(光敏化化学漂白)
(b)载玻片2-用在PBS中制备的丁基硼酸盐(10mM)和没食子酸丙酯100uM处理，用可见灯照射载玻片(光敏化化学漂白)
(c)载玻片3-用在PBS中制备的丁基硼酸盐(10mM)和DABCO 10uM处理，用可见灯照射载玻片(光敏化化学漂白)
(d)载玻片4-用在PBS中制备的丁基硼酸盐(10mM)和抗坏血酸100uM处理，用可见灯照射载玻片(光敏化化学漂白)
(e)载玻片5-用NaHCO3和H2O2处理15分钟(热漂白)
漂白之后，所有的载玻片用PBS洗涤，并盖上盖玻片，以获得漂白背景图像。将载玻片去除盖玻片，如染色和成像所述，应用下一轮抗体。后续步骤的漂白与漂白方案中所述相同。
6. 结果与讨论
组织微阵列的系列切片用荧光标记的PCK26抗体染色，如在染色和成像中讨论。每个载玻片然后通过在单线态氧和/或自由基猝灭剂存在或不存在下荧光染料和三苯基丁基硼酸盐之间光诱导的电子转移而被漂白。将一个载玻片用碱性过氧化氢漂白。然后将载玻片针对TRIM29染色。两个组织核心(P002＆P003)的图像如上所示。表明猝灭剂防止通过光诱导的电子转移过程而漂白所导致的TRIM29表位损坏(图7)。当使用自由基清除剂像DABCO、没食子酸丙酯和抗坏血酸时，用随后的TRIM29生物标志物复染色看起来与经历基于氧化剂(NaHCO3/H2O2)的漂白的载玻片一样，被有效染色。
在漂白TRIM29抗体的Cy3信号后，将载玻片用MUC1的Cy3标记抗体染色。图8示出结果，包括当三芳基丁基硼酸盐被用于漂白与TRIM29生物标志物相关联的先前的Cy3信号时，自由基清除剂不存在时的抗原效应(表位损坏)。当使用自由基清除剂像DABCO、没食子酸丙酯和抗坏血酸时，用随后的MUC1生物标志物复染色看起来与经历基于氧化剂(NaHCO3/H2O2)的漂白的载玻片一样，被有效染色。相比抗坏血酸，DABCO＆没食子酸丙酯被证明是更有效地防止靶标修饰。
在漂白MUC1抗体的Cy3信号后，将载玻片用Napsin A的Cy3标记抗体染色。图9示出结果，包括当三芳基丁基硼酸盐被用于漂白与MUC1生物标志物相关联的先前的Cy3信号时，自由基清除剂不存在时的抗原效应(靶标修饰)。当使用自由基清除剂像DABCO、没食子酸丙酯和抗坏血酸时，用随后的Napsin A生物标志物复染色看起来与经历基于氧化剂(NaHCO3/H2O2)的漂白的载玻片一样，被有效染色。
实施例8. 在光敏化化学漂白循环后去除残余的硼酸盐
1. 制备组织样品
人多组织阵列样品作为包埋在石蜡中的组织载玻片获得。这些样品包括正常、癌前病变和具有渐进分级的癌症组织的微阵列(Pantomics，MNT241)。
2. 载玻片清洁(见实施例7)
3. 抗原修复(见实施例7)
4. 封闭(见实施例7)
实验1：从组织去除在漂白循环期间保留的残余的硼酸盐
预先染色的载玻片(用Cy5标记的抗S6抗体染色)通过在500ul单苄基三苯基硼酸盐(1 mM)/DABCO (100 uM)溶液的存在下暴露于可见光7分钟而被漂白。载玻片用PBS洗涤3次，或50％乙醇洗涤3次随后PBS洗涤3次。将载玻片成像，在显微镜本身的Cy5通道暴露于光，持续1分钟，然后重新成像。将用碱性过氧化物漂白、用抗S6抗体染色并用PBS洗涤3次的单独载玻片用作对照。如图10所示，先前用光诱导电子转移过程漂白并只用PBS洗涤的载玻片显示减弱信号，其在长时间暴露后进一步降低。经历额外乙醇洗涤的载玻片的信号并没有受到显著影响。
图10：残余硼酸盐对来自后续染色和成像的信号的影响以及用乙醇去除残余硼酸盐。a)用碱性过氧化物漂白的对照载玻片的图像，b)用PICB漂白但用单独PBS洗涤的载玻片图像，c)用PICB漂白然后用50％乙醇洗涤然后用PBS洗涤的载玻片图像，d)＆e) 分别为在重新成像之前将载玻片在Cy5通道暴露于光1分钟之后的b)＆c)图像。
实验2：去除残余硼酸盐的其他试剂/缓冲剂的评估
如上对于实验1所述进行实验，不同之处在于用PICB漂白后，将载玻片用不同试剂/缓冲剂洗涤3×5分钟，然后用PBS洗涤。将载玻片用抗NaKATP酶-Cy5和抗CD79-Cy3或AE1-Cy3抗体缀合物染色。将载玻片成像，暴露于光1分钟，然后再次成像，如上所述。还如上对于实验1所述使用对照载玻片。结果示于图11。
图11(a)：评价去除残余硼酸盐的不同试剂/缓冲剂，这通过对来自下一轮染色和延长光暴露的信号的后续影响而测量。a)用50％乙醇洗涤，b)用0.1％聚乙烯亚胺洗涤，c)用市售Leica Bond洗涤溶液洗涤，d)用0.1％赖氨酸洗涤，e)用市售Biocare洗涤溶液洗涤，f)用0.1％CTAB洗涤以及g)用0.1％胍洗涤。不同的试剂在不同程度上是有效的。
图11(b)：评价去除残余硼酸盐的不同试剂/缓冲剂：试剂浓度的影响：a)用50％乙醇洗涤的载玻片图像，b)用0.5％赖氨酸洗涤的载玻片图像，c)用5％赖氨酸洗涤的载玻片图像，d)用10％赖氨酸洗涤的载玻片图像，e)对照载玻片图像，a'-e') 暴露于光1分钟后a-e的图像。更高浓度赖氨酸是更有效的，表明洗涤条件可以进一步微调。
实验3：不同百分比的乙醇对残余硼酸盐去除的影响。
如实验1中所述，预先染色的组织微阵列载玻片通过PICB漂白，然后用不同百分比的乙醇(3×5分钟)洗涤，接着用去离子水洗涤，然后对载玻片进行残余硼的Tof-SIMS质谱分析(硼-10和硼-11)。图12表明，约70％的乙醇浓度最有效地除去大部分残余硼酸盐。
图12(a)：在肺鳞状细胞癌组织样品中不同洗涤后的残余硼酸盐(通过硼含量测量)。
图12(b)：在肝细胞癌组织样品中不同洗涤后的残余硼酸盐(通过硼含量测量)。
图12(c)：在侵袭性乳腺导管癌中不同洗涤后的残余硼酸盐(通过硼含量测量)。对于其他组织类型的组织样品观察到类似结果。
实施例9：更高水溶性的硼酸盐合成
(a) 二苯基-双-2-(4-(甲氧基PEG(10)甲基)苯基)乙基硼酸锂盐的制备：
向装配有磁搅拌棒和氮气旁通管的250 mL三颈圆底烧瓶放入10.0g (13.7毫摩尔) 4-(甲氧基PEG(10)甲基)-1-乙烯基苯的80mL无水乙醚溶液。用冰浴将溶液冷却至0℃。观察到混浊/不透明的混合物。通过注射器向该溶液中滴加0.714mL(6.85毫摩尔)氯二氢硼烷-二甲硫复合物。将不透明反应溶液在0℃搅拌约1小时。将冰浴除去并且将反应溶液用NMR分析，表明某些原料的存在。然后继续在室温搅拌过夜。分析表明，反应没有更进一步进行。然后将反应溶液再次冷却至0℃，添加另外0.3当量的硼烷复合物。30分钟后除去冰浴，在室温下搅拌混合物3小时。
用干冰-丙酮浴将反应混合物冷却至-78℃。向冷却的混合物中加入7.4mL (13.4毫摩尔)苯基锂。反应混合物变得粘稠并部分固化成悬浮液(紫/棕色固体)。在-78℃搅拌2小时后，除去冷却浴，并且将混合物慢慢温热至室温过夜，同时搅拌。固体变成黄色。通过滗析除去乙醚。用新鲜乙醚洗涤胶状固体两次，同时搅拌。然后将固体溶于THF中，以用盐水洗涤。分出THF层，并浓缩，得到2.5 g粗产物。将粗胶状固体通过溶解在800mL水中而纯化(观察到混浊的溶液)，并过滤。然后在减压下将水蒸发，将混浊的淡黄色液体残余物在真空下干燥过夜。收率：1.79 g(16％)
1H-NMR (D2O): 7.22-7.66ppm(d, m, 18H); 4.47ppm(s, 4H); 3.73ppm (t, 4H); 3.57ppm (bs, 80H), 3.19ppm(s, 6H); 2.76ppm (t, 4H)。
(b) 苯基-三-2-(4-甲氧基PEG(10)甲基苯基)乙基硼酸锂盐的制备：
向装配有磁搅拌棒和氮气旁通管的100 mL三颈圆底烧瓶放入3.82 g (5.22毫摩尔) 4-(甲氧基PEG(10)甲基)-1-乙烯基苯的40mL无水乙醚溶液。用冰浴将溶液冷却至0℃。观察到稍微混浊的溶液。通过注射器向该溶液中滴加0.14mL(1.74毫摩尔)氯二氢硼烷-二甲硫复合物。将反应溶液在0℃下搅拌约15分钟。将冰浴除去并且将反应混合物在室温下搅拌4小时，直到所有的原料消失(由1H-NMR分析)。然后将不透明反应混合物冷却至-78℃，通过注射器逐滴加入0.99mL(1.74毫摩尔)苯基锂。在30秒内该反应混合物变成热粉色。将其在冷却浴中搅拌过夜，同时缓慢地允许其升温至室温。溶剂蒸发后，将粗胶状固体通过溶解在500mL水中而纯化(观察到混浊溶液)，并过滤。然后在减压下将水蒸发，将浅黄色液体残余物在真空下干燥过夜。
1HNMR (D2O): 7.0-7.5ppm(m, 19H); 4.54ppm(s, 6H); 3.8ppm (m, 6H); 3.63ppm (bs, 120H), 3.37 (s, 9H), 2.8-3.0ppm (m, 6H)。
(c) 四正丁基硼酸锂盐的制备
在氮气下，向250 3颈圆底烧瓶中放入20mL (20毫摩尔) 1.0M三正丁基硼烷/THF。另外添加40mL干燥的THF。用干冰丙酮浴将溶液冷却至-78℃。在约10分钟内，通过注射器向冷却的溶液中滴加8.8mL(22毫摩尔)2.5M正丁基锂/己烷。在完成添加后，将反应溶液在-78℃搅拌1小时，除去冷却浴，将反应混合物慢慢升温至室温。然后在氮气下将其继续在室温搅拌过夜。
将澄清的反应溶液转移到干燥氮气箱中的圆底烧瓶中，将溶剂在减压下除去。得到白色固体。该固体用己烷(3×100mL)反复洗涤并干燥。收率：5.7 g。
1H-NMR (D2O): 1.24ppm (五重峰, 8H), 1.08ppm (五重峰, 8H), 0.85ppm (t, 12H), -0.14ppm (m, 8H)。
实施例10：通过高水溶性硼酸盐对后续染色信号的影响而测定的高水溶性硼酸盐的降低保留
如上对于实施例8实验1所述进行实验，不同之处在于漂白如实施例8实验1用单苄基三苯基硼酸盐或更高水溶性的硼酸盐双-(4-m-dPEG10-苯乙基)二苯基硼酸盐进行，并且在漂白后，只用PBS洗涤(3×5分钟)载玻片。图13显示，用更高水溶性的硼酸盐1分钟曝光后，大多数染色强度被保留(相比对照载玻片)。
实施例11：通过高水溶性硼酸盐对后续染色信号的影响而测定的高水溶性硼酸盐的降低保留
如上对于实施例8实验1所述进行实验，不同之处在于漂白如实施例8实验1用单苄基三苯基硼酸盐进行或用更高水溶性的硼酸盐四丁基硼酸盐进行，并且漂白后，用单苄基三苯基硼酸盐处理的载玻片用70％乙醇(3×1分钟)，然后PBS(3×5分钟)洗涤，而用四丁基硼酸盐处理的载玻片用单独PBS洗涤(3×5分钟)。图14显示四丁基硼酸盐不需要额外的乙醇洗涤并被单独PBS有效地除去，给出的信号与用3次额外的70％乙醇洗涤的单苄基三苯基硼酸盐相当。
实施例12：用于光敏化化学漂白的自动化过程
美国20120135458描述了一种用于使生物样品重复染色的自动化装置。所述自动化装置包含：与染色剂单元和漂白剂单元流体连通的流动池，其中所述流动池包含表面，所述表面设置为与其中的样品可操作地接合；用于照明至少一部分生物样品的照明来源；监测单元，其与流动池可操作地偶联并且设置为用于在施用至少一种染色剂和漂白剂之前、期间和/或之后监测生物样品的一个或多个光学特性。所述装置还包含处理单元，其用于基于生物样品的至少一个光学特性确定品质因数；和与处理单元和流动池连通的控制器单元，其中所述控制器单元设置为至少部分基于品质因数来控制至少一种染色剂和漂白剂的施用。术语“品质因数”包括但不限于光强度、图像的对比度、Brenner梯度或信号与背景比率。监测单元可包含与照相机可操作地偶联的显微镜。
US 20120135458也描述了一种用于使生物样品染色的闭环自动化方法。所述方法包括在流动池中提供生物样品，使至少一部分生物样品染色，在染色期间监测生物样品的一个或多个光学特性，和基于至少一个光学特性确定品质因数。所述方法还可包括漂洗至少一部分生物样品，在漂洗期间从一部分生物样品监测一个或多个光学特性，和基于至少一个光学特性确定品质因数。所述方法还可包括使至少一部分生物样品漂白，在漂白期间从一部分生物样品监测一个或多个光学特性，和基于至少一个光学特性确定品质因数。在染色后，可将生物样品孵育确定的时间段，以提供足够的时间使抗体与生物样品中的分子结合。可在孵育期期间实施用于染色步骤的成像。在一个实例中，在染色、漂白和漂洗中的一个或多个期间，监测包括获取生物样品的图像，和确定品质因数包括使用获取的图像确定一部分生物样品的光强度。染色、漂洗和漂白步骤中的每一个可通过使含有特定试剂的溶液流动经过位于流动池内的生物样品来完成。在一些实施方案中，在自动化方法期间，流动池可固定在显微镜载物台上。
通过计算机控制染色循环涉及的一个或多个过程步骤，可实现自动化，例如但不限于加入染色试剂和氧化剂。当将流动池系统并入到合并的样品处理和图像获取系统时，图像获取组件(例如，显微镜或照相机)还可通过软件(例如用LabVIEW或C编写的程序)来控制。
任何合适的流动池可以用于生物样品的染色的自动化方法。代表性的流动池为US20130287645“微流体室装置和制造(Microfluidic chamber device and fabrication)”和US20120135449“生物样品的反复染色(Iterative staining of biological samples)”中公开的那些，两者都通过引用以其整体并入本文。
用于光敏化化学漂白的自动化过程按照图15的流程进行。该过程始于在流动池装置中装载/捕获生物样品。流动池室然后通过将含有探针的溶液流经流动池装置而填充有至少一个探针。在规定的条件并在规定的时间孵育探针，以使探针结合样品中的靶标。通过将洗涤缓冲液流经该装置而漂洗掉未结合的探针。染色样品图像被捕获。接着将流动池室填充有电子转移试剂(单苄基三苯基硼酸盐(1mM))和防止后续样品照射期间靶标修饰的添加剂(DABCO(100 uM))。然后将样品通过暴露于特定波长的光而照射1秒钟，以灭活探针信号(即，用10x物镜Olympus IX-81显微镜1秒曝光)。然后使用含有70％乙醇的PBS缓冲液漂洗掉电子传递试剂和添加剂。捕获样品图像以显示信号灭活的有效性。探针信号不再可检测(数据未显示)。
图像捕获之前，通过将介质流经该装置，流动池室任选填充有增强图像捕获的介质。图像捕获后，通过将洗涤缓冲液流经该装置而漂洗掉所述介质。
在将电子转移试剂和添加剂漂洗掉后，所述流动池室可填充有至少一种其它探针，用于另一轮成像和漂白。
样品照射可通过不同的方法来完成。例如，样品照射可通过用光学滤波器和显微镜物镜，用所需波长而暴露样品特定区域来完成。一种自动平移台可以允许样品相对于物镜准确定位。样品的多个区域可以通过在曝光之间使样品相对于物镜移动而进行照射。或者，样品照射可通过用所需波长使整个样品同时曝光而不将光聚焦到限定区域来实现。
虽然已经显示和描述了本发明的具体实施方案，但对本领域技术人员显而易见的是可在不背离本发明的教导的情况下进行修改和改变。在前面说明书和附图中阐明的内容仅通过举例的方式提出而并不作为一种限制。本发明的实际范围基于现有技术从其正确的角度观察时，意欲在权利要求书中限定。
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