一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法
【专利摘要】本发明涉及一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法，包括：（1）将污泥样品离心后真空冷冻干燥，然后捣碎加入EDTA-Mcllvaine缓冲提取液漩涡混合后超声萃取，得上清液；（2）将上清液缓缓流经SPE-HLB小柱，全部萃取后用高纯水清洗小柱，真空干燥后用甲醇将目标物质从SPE-HLB小柱上洗脱下来，收集洗脱液；（3）将洗脱液吹至近干，加入乙腈和水混合液定容，然后针头式过滤器过滤；（4）将步骤（3）得到的液体进行HPLC-MS/MS分析。本发明建立了一种超声-固相联合萃取，然后通过高效液相色谱/质谱来测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法，该方法先进、准确、灵敏。
【专利说明】一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于抗生素的痕量检测领域，特别涉及一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法。
【背景技术】
[0002]随着生物医药技术的发展，各种各样的药品为人类的健康生存和发展作出了巨大的贡献。目前约有3000余种不同的药品在世界各国普遍使用，包括各种抗生素、避孕药、油脂调节剂、抗抑郁症药和生长抑制剂等。其中，四环素类药品是广泛应用于临床的一类广谱十二氢化并四苯抗生素，包括金霉素、土霉素、四环素及近年来发展起来的半合成四环素类抗生素(多西环素、米诺环素、吡咯烷甲基四环素、甲烯土霉素、甲氯环素等)，这类药品主要用于牙周炎、上呼吸道感染、扁挑体炎、糖尿病以及动物饲料添加剂等。通常这些四环素类抗生素只能部分被人体或动物吸收转化，剩余大部分药品及其代谢物随尿液和粪便排泄，并通过城市下水道进入到城市污水处理系统中，由于这些物质的亲脂性，它们中的大部分被吸附在污泥上。随着污泥中微量污染物问题被不断提出，对这些抗生素的检测就越来越重要，而抗生素的检测方法成为相关研究的重要因素。
[0003]通常的对污泥中的四环素、土霉素和金霉素的液相色谱法测定中，如何从污泥中萃取并分离鉴别这些物质，对HPLC检测有很大的影响。选择使用超声萃取+固相萃取/高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)进行污泥中四环素类抗生素的定量检测，并选择多反应监测离子模式(MRM)，以求检测污泥中四环素、土霉素和金霉素。高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)的特异性和选择性 强，其多反应监测(MRM)模式可以通过检测分子离子和碰撞诱导解离得到的碎片离子，而更有选择性地定性定量检测目标化合物。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法，该方法中痕量四环素、土霉素和金霉素的色谱图出峰稳定，峰形良好，出峰的拖尾现象消除，并能得到准确的结果。
[0005]本发明的一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法，包括:
[0006](I)将污泥样品于SOOOr.mirT1离心IOmin后，将其中的污泥固体真空冷冻干燥，然后捣碎并过50目筛，接着准确称量1.0OOg筛后污泥并置于离心管中，加入IOmlEDTA-Mcllvaine缓冲提取液游润混合Imin后超声萃取IOmin,并以4000r *min_1离心20min后,收集上清液；再重复萃取2次,合并3次萃取的上清液；
[0007](2)依次用6mL甲醇、6mL高纯水、6mL Na2EDTA的缓冲液对SPE-HLB小柱进行活化和平衡，而后以3mL ^mirT1的流速将合并后的上清液缓缓流经SPE-HLB小柱，全部萃取后用6mL高纯水清洗小柱,接着真空干燥5min ;最后用6mL甲醇以ImL ?mirT1的流速将目标物质从SPE-HLB小柱上洗脱下来，收集洗脱液；
[0008](3)使用氮吹仪在水浴温度40°C以高纯氮气将洗脱液吹至近干，加入乙腈和水混合液定容，然后用0.22 μ m的针头式过滤器过滤；
[0009](4)将步骤(3)得到的液体进行HPLC-MS/MS分析，分析条件如下:
[0010]a高效液相色谱条件:
[0011]色谱柱:C8液相色谱柱(美国Phenomenex公司)；
[0012]流动相:A相为乙腈:B相为含0.28%甲酸的高纯水；
[0013]流速:0.4mL.mirT1 ；
[0014]进样量:20yL;
[0015]柱温:40°C;
[0016]b串联质谱条件:
[0017]离子源:电喷雾电离源正离子模式(ESI+);
[0018]检测方式:多反应监测(MRM)离子模式；
[0019]毛细管电压:3.5kV ;干燥气为:250°C。
[0020]步骤(1)中所述的EDTA-Mcllvaine缓冲提取液具体为:0.05mol.L^1EDTA,
0.06mol.L-1Na2HPO4^0.08mol.L-1 柠檬酸，pH=4。
[0021]步骤(3)中所述的乙腈和水的混合液中乙腈与水的体积比7:3。
[0022]步骤(4)中所述的流动相A和流动相B的体积比为70:30。
[0023]本发明中采用超声萃取和固相萃取泥样中四环素、土霉素和金霉素；用HPLC-MS/MS和外标法计算四环素、土霉素和金霉素的含量。
[0024]在样品制备时，本发明采用了超声萃取泥中四环素、土霉素和金霉素到液体中，超声萃取具有较高的分离效果，能够有效萃取污泥中的物质。
[0025]有益效果:
[0026](1)本发明分别获得了对测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的高效液相色谱法有重要影响的几个条件:柱温、流动相配比和流速等，并考察了回归方程、相关系数及线性范围，获得较好的精密度与加标回收率；
[0027](2)本发明采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)的多反应监测(MRM)模式和C8反相硅胶色谱柱，采用了超声萃取和非极性萃取柱联合的泥相萃取方法，使用乙腈/超纯水为流动相，恒速洗脱，通过对超纯水pH与流动相配比的调整，使分析方法中痕量四环素、土霉素和金霉素的色谱图出峰稳定，峰形良好，出峰的拖尾现象消除，并能得到准确的结果。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1:四环素色谱图；
[0029]图2:四环素质谱图；
[0030]图3:土霉素色谱图；
[0031]图4:土霉素质谱图；
[0032]图5:金霉素色谱图；
[0033]图6:金霉素质谱图。
【具体实施方式】[0034]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0035]实施例1
[0036]1、标准溶液的制备
[0037]本实验采用5点外标物标准曲线对目标抗生素进行定量分析。实验前需要进行标准样品储备液和混合标准样品工作溶液的配置工作，具体方法如下:
[0038]标准样品储备液:按纯度折算校正后分别准确称取三种抗生素，用乙腈溶解摇匀后定容于IOOmL棕色容量瓶中，配制成浓度为200mg -1的各种四环素单标准储备液(其中土霉素标准储备液配制时滴加适量稀盐酸以使其溶解完全)。于_4°C冰箱避光保存。
[0039]混和标准样品标工作溶液:临用时分别准确量取一定体积的标准样品储备液，用乙腈配制成混合标准母液，取混合标准母液用乙腈逐步稀释，配制成浓度范围为10~2000 μ g.L—1标准曲线工作液。
[0040]标准曲线的确定:混合标准样品工作溶液准备完成后，按3.1.3的相关HPLC-MS/MS条件并以浓度从小到大的顺序连续依次进样进行测定(每个样品重复检测6次)，根据样品浓度对应相应色谱峰面积得到3种抗生素标准曲线的线性关系。
[0041 ] 在空白水样中添加混 标准溶液制成浓度为Ojyg^L-1的加标混合溶液，采用目标化合物的母离子和特征子离子为选择检测离子对，结合不同的保留时间对目标化合物进行回收率实验，并水平平行测定5次.[0042]通过连续注射测定11次浓度为200 μ g -1的标准溶液来计算平均值和相对标准偏差(RSD)来确定精密度，并以标准偏差的3倍值浓度作为检出限(LOD)；
[0043]2、生活污水处理厂污泥的前处理
[0044]将取回的污泥样品于8000r.mirT1离心IOmin后，取出其中的污泥固体置于冷冻干燥机中真空冷冻干燥24小时,之后捣碎并过50目筛。准确称量1.0OOg筛后污泥并置于离心管中，加入 IOmlEDTA-MclIvaine缓冲提取液(0.05mol ?L^EDTA+0.06mol.L-1Na2HPOf0.08mol.L-1朽1樣酸，pH=4),游润混合Imin后超声萃取IOmin,并以4000r.mirT1离心20min后，收集上清液。再重复萃取2次，步骤同上。合并3次萃取操作收集的上清液。
[0045]依次用6mL甲醇、6mL高纯水、6mL Na2EDTA的缓冲液对SPE-HLB小柱进行活化和平衡，而后以3mL ^irT1的流速将合并后的3次萃取的上清液缓缓流经SPE-HLB小柱，全部萃取后用6mL高纯水清洗小柱,接着真空干燥5min ;最后用6mL甲醇以ImL.mirT1的流速将目标物质从SPE-HLB小柱上洗脱下来，收集洗脱液；使用氮吹仪在水浴温度40°C以高纯氮气将洗脱液吹至近干，加入乙腈和水混合液定容(腈与水的体积比7:3)。
[0046]3.色谱条件
[0047]a高效液相色谱条件:
[0048]色谱柱:C8液相色谱柱(美国Phenomenex公司)。
[0049]流动相:A相为乙腈:B相为高纯水(含0.28%甲酸)=7:3。
[0050]流速:0.4mL.mirT1。
[0051]进样量:20μ L。[0052]柱温:40°C。
[0053]b串联质谱条件:
[0054]离子源:电喷雾电离源正离子模式(ESI+);
[0055]检测方式:多反应监测(MRM)离子模式；
[0056]毛细管电压:3.5kV ;干燥气为:250°C。
[0057]表1目标抗生素的质子化离子、产物离子和质谱条件参数
[0058]
【权利要求】
1.一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法，包括: (1)将污泥样品于SOOOr.HIirT1离心IOmin后，将其中的污泥固体真空冷冻干燥，然后捣碎并过50目筛，接着准确称量1.0OOg筛后污泥并置于离心管中，加入IOmlEDTA-Mcllvaine缓冲提取液游润混合Imin后超声萃取IOmin,并以4000r 离心20min后,收集上清液；再重复萃取2次,合并3次萃取的上清液； (2)依次用6mL甲醇、6mL高纯水、6mLNa2EDTA的缓冲液对SPE-HLB小柱进行活化和平衡，然后以3mL ^irT1的流速将步骤(1)得到的上清液缓缓流经SPE-HLB小柱，全部萃取后用6mL高纯水清洗小柱,接着真空干燥5min ;最后用6mL甲醇以ImL.mirT1的流速将目标物质从SPE-HLB小柱上洗脱下来，收集洗脱液； (3)在水浴温度40°C以高纯氮气将洗脱液吹至近干，加入乙腈和水的混合液定容，然后用0.22 μ m的针头式过滤器过滤； (4)将步骤(3)得到的液体进行HPLC-MS/MS分析，分析条件如下: a高效液相色谱条件: 色谱柱:C8液相色谱柱 流动相:A相为乙腈:B相为含0.28%甲酸的高纯水；
流速:0.4mL.mi rT1 ； 进样量:20yL ; 柱温:40°C ； b串联质谱条件: 离子源:电喷雾电离源正离子模式； 检测方式:多反应监测离子模式； 毛细管电压:3.5kV ;干燥气为:250°C。
2.根据权利要求1所述的一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法，其特征在于:步骤(1)中所述的EDTA-Mcllvaine缓冲提取液具体为:0.05mol.L^1EDTA,0.06mol.L-1Na2HPO4^0.08mol.L-1 柠檬酸，pH=4。
3.根据权利要求1所述的一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法，其特征在于:步骤(3)中所述的乙腈和水的混合液中乙腈与水的体积比7:3。
4.根据权利要求1所述的一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法，其特征在于:步骤(4)中所述的流动相A和流动相B的体积比为70:30。
【文档编号】G01N30/88GK103823005SQ201410072616
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】黄满红, 刘冲, 张微, 刘松山, 宋盼盼, 陈东辉, 陈亮 申请人:东华大学