一种百合隐症病毒胶体金免疫层析检测试剂卡及制备方法
【专利摘要】一种百合隐症病毒胶体金免疫层析检测试剂卡及制备方法，该试剂卡包括试剂卡槽、衬板、样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，其中胶体金结合垫上含有金标探针，衬板固定于试剂卡槽中，样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次排列连接于衬板上表面，硝酸纤维素膜上设有检测线和对照线，检测线和对照线上分别包被的是兔抗LSV多克隆抗体和羊抗兔IgG纯化抗体；该百合隐症病毒胶体金免疫层析检测试剂卡的制备方法主要是将兔抗LSV多克隆抗体包被于免疫层析膜上，同时用其制成用胶体金结合垫；该试剂卡检测快速、准确率高、特异性强、操作简便，无需特殊的设备和仪器。
【专利说明】一种百合隐症病毒胶体金免疫层析检测试剂卡及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测试剂卡及制备方法，具体是一种用胶体金免疫层析法快速检 测百合隐症病毒（LSV)的试剂卡及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 百合（Lilium spp)是传统的药用和食用植物，现已成为国际上重要的球根花卉之 一。荷兰是世界上最大的百合种球生产国，2005年荷兰百合种球生产面积达3800hm 2,占全 球总面积的72%，每年生产22. 1亿个百合种球，其中约1.0亿个出口到中国。切花百合在 我国花卉产业产值中占第四位，同时百合作为食品和药材，也是一种重要的经济作物。兰州 食用百合由于其色泽洁白、形大味甜、营养丰富等特点享誉海内外。近年来，兰州市及其周 边定西、临夏等地区食用百合的面积已近l〇〇〇〇hm 2,直接参与百合种植的农户已超过9万 户，已成为产区农户的主要收人来源。随着百合种植面积日益扩大，长期无性繁殖使病毒不 断积累，造成百合种性衰退，严重影响了产量和品质，给世界各地百合生产带来了巨大的经 济损失。我国百合产区病毒病发生范围广、为害严重，云南、甘肃、江苏等百合产区病毒病的 自然发病率一般在20%?30%，有的达70%以上，严重者可高达100%。病毒病已成为危 害百合生产的主要病害，也是限制我国百合生产和切花出口的重要原因之一。
[0003] 目前文献报道侵染百合的病毒有20多种，其中百合隐症病毒（Lily symptomless virus, LSV)和百合斑驳病毒（Lily mottle virus, LMoV)是发生最普遍、危害最严重的两 种病毒，其他病毒均为局部地区发生。正常条件下，LSV并不会引起百合植株产生明显症状， 但会使鳞茎缩小，切花寿命减短。LSV与LMoV复合侵染时，导致百合出现坏死斑，并常伴随 植株矮小、花与球茎的减产等。LSV属于麝香石竹潜隐病毒属（Carlaviru)成员，其病毒成 员多呈直形，大约占64%，弯曲形也较为常见，占36%。病毒典型长度介于509?720nm之 间，直径介于11?13nm或者14?18nm。病毒基因组为不分段RNA，全长8.4kb，其中包括 5'端的帽子结构和3'的poly㈧尾巴，具有6个开放阅读框（0RF)，编码包括外壳蛋白 (CP，32kDa)在内的6个蛋白。其中CP亚单位是LSV基因组6个开放阅读框编码的唯一参 与病毒颗粒形态构成的蛋白质，其0RF长度为876nt。CP亚单位围绕病毒RNA分子，组装成 病毒夕卜壳。
[0004] 目前与百合病毒相关的研究主要集中在病毒脱除和病毒检测上，病毒检测研究 虽有电子显微镜技术、酶联免疫法（ELISA)以及分子生物学技术（RT-PCR和基因芯片技 术）等的相关报道，但都还停留在研究和实验室阶段，无法满足大规模检测以及百合种植 现场和田间快速检测的需求，从而无法掌握百合病毒感染的准确信息。此外，包括ELISA和 RT-PCR等方法在内的传统实验室检测方法都存在程序复杂，检测成本高、耗时长、对仪器设 备和检测条件要求高，需要长期经验积累和具有专业操作技能的人员才能完成等问题，因 此应用范围受到很大的局限性。
[0005] 胶体金免疫层析是以硝酸纤维素膜为载体，通过液体的渗移，利用抗原抗体的结 合，以及胶体金呈现颜色反应来检测抗原或抗体。该方法可以避免以上几种检测方法的缺 点，以其特异性强、成本低、操作简便、不需任何仪器、适合现场快速检测等优点已被广泛接 受，已用于多种植物病毒的检测等，包括马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草斑驳病毒、南瓜 花叶病毒等。作为一种快速筛查的手段，既可节省检测成本，又可用于广大基层单位开展百 合病毒的检测和防控工作中，具有重要的经济价值和社会价值。但是至今国内外还没有用 胶体金免疫层析法检测LSV的相关报道，更无商品化的LSV胶体金免疫层析检测试剂卡，很 难满足国内观赏及食用百合的病毒检测需求。因此建立科学、快速、灵敏、稳定、易操作的 LSV检测方法及试剂卡，是生产百合脱毒株的基础，是提高百合产量和品质的前提。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种用胶体金免疫层析法快速检测LSV的试剂卡及其制备 方法。本发明试剂卡检测快速，检测准确率高、特异性强，携带方便，操作简便，检测重复性 好，无需任何仪器和设备。
[0007] 本发明的技术方案为：
[0008] -种百合隐症病毒胶体金免疫层析检测试剂卡，包括：试剂卡槽（1)，衬板（10)， 样品垫（6)，胶体金结合垫（7)，硝酸纤维素膜（8)，吸水滤纸（9)，试剂卡槽（1)包括上壳体 和下壳体，上壳体和下壳体通过卡扣连接，上壳体设有第一孔洞（2)和第二孔洞（3)，样品 垫（6)置于第一孔洞（2)下方，硝酸纤维素膜（8)置于第二孔洞（3)下方，胶体金结合垫 ⑵上含有金标探针，衬板（10)固定于试剂卡槽⑴中，样品垫（6)、胶体金垫（7)、硝酸纤 维素膜⑶和吸水滤纸（9)依次排列连接于衬板（10)上表面，硝酸纤维素膜⑶上设有检 测线（4)和对照线（5)，检测线（4)上包被的是兔抗LSV多克隆抗体，对照线（5)上包被的 是羊抗兔IgG纯化抗体，兔抗LSV多克隆抗体合适包被量为1. 5?2. 0 μ g蛋白，金标探针 合适抗体标记量为16 μ g / mL,羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2. 0?2. 5yg蛋白。
[0009] 其中在用所述试剂卡检测时，在所述第一孔洞处加入少量百合样品的待检溶液， 对比检测线和对照线的颜色，即可判定被检测百合是否感染了百合隐症病毒；
[0010] 其中将少量待检溶液加入所述第一孔洞处5?10分钟后，若待检溶液中含有LSV， 检测样品经过所述胶体金垫时，LSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向 所述检测线方向渗移，当接触到所述检测线时发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成 可见的棕红色条带；未与检测线结合的复合物继续向所述对照线方向渗移，当接触到所述 对照线时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当检测线和 对照线上均出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒；
[0011] 其中将少量待检溶液加入所述第一孔洞处5?10分钟后，若待检溶液中不含LSV， 检测样品经过所述胶体金垫时，则不能与金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述 检测线时不发生反应，金标多克隆抗体继续向所述对照线方向渗移，当接触到所述对照线 时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当检测线没有颜色 变化而仅对照线出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染百合隐症病毒。
[0012] 一种百合隐症病毒胶体金免疫层析检测试剂卡的制备方法，按以下步骤进行：1、 兔抗LSV多克隆抗体的制备：从感染了 LSV的百合叶片中提取总RNA进行逆转录聚合酶链 式反应（RT-PCR)，扩增LSV的CP基因片段。通过酶切克隆至pET-28a载体。重组质粒转 化入大肠杆菌BL21，37°C培养，IPTG诱导表达，镍柱亲和层析纯化获得大小32. OkDa的LSV CP基因工程融合蛋白。用lmg / mL的LSV CP基因工程融合蛋白作为免疫原分别免疫新西 兰大白兔，获得抗血清。所得抗血清依次通过20%、50%、33%三个饱和度的硫酸铵沉淀粗 提后，透析至PH7. 8的磷酸缓冲液，然后使用DE52阴离子交换柱进行纯化而获得兔抗LSV 多克隆抗体IgG ;2、胶体金标记兔抗LSV多克隆抗体的方法：分别取半径为30nm的胶体金 10mL及兔抗LSV多克隆抗体160 μ g，在PH7. 5的条件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加牛 血清白蛋白（BSA)作为稳定剂，且使得终浓度为1%，采用高速离心法除去未结合的多克隆 抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-抗体结 合物；3、胶体金结合垫的制备：用1 / 10标记前胶体金溶液体积的重悬液悬浮胶体金-抗 体结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，37°C烘干，制成胶体金结合垫；4、 免疫层析膜的包被：检测线上包被的是兔抗LSV多克隆抗体，对照线上包被的是羊抗兔IgG 纯化抗体；5、试剂卡的组装：将聚氯乙烯衬板作为支撑载体固定于试剂卡槽下壳体中，然 后样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次排列连接于衬板上表面，再将试剂 卡槽上壳体与下壳体通过卡扣连接，就得到LSV胶体金免疫层析检测试剂卡。
[0013] 本发明的试剂卡具有以下优点：
[0014] 检测时，吸取少量百合样品的待检测溶液，滴在试剂卡槽上壳体第一孔洞处，对比 检测线和对照线的颜色，即可判定百合植株是否感染了 LSV。
[0015] 1、检测快速：检测时间只需5?10分钟，可以满足现场检测的需要。
[0016] 2、检测准确率高、特异性强：本反应与其他百合主要病毒没有交叉反应，检测灵敏 度高。
[0017] 3、携带方便，操作简便：本发明不需要借助其他仪器设备，适合广大基层单位开展 百合病毒的检测和防控工作，也适合百合生产的企业、公司以及百合种植的农户使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为本发明百合隐症病毒胶体金免疫层析检测试剂卡平面结构示意图
[0019] 图2为本发明百合隐症病毒胶体金免疫层析检测试剂卡内部结构示意图
【具体实施方式】
[0020] 如图1和图2所示的LSV胶体金免疫层析检测试剂卡，包括试剂卡槽1，衬板10， 样品垫6,胶体金结合垫7,硝酸纤维素膜8,吸水滤纸9,其中试剂卡槽1包括上壳体和下壳 体，上壳体和下壳体通过卡扣连接，上壳体设有第一孔洞2和第二孔洞3,样品垫6置于第 一孔洞2下方，硝酸纤维素膜8置于第二孔洞3下方，胶体金结合垫7上含有金标探针，衬 板10固定于试剂卡槽1中，样品垫6、胶体金结合垫7、硝酸纤维素膜8和吸水滤纸9依次 排列连接于衬板10上表面，硝酸纤维素膜8上设有检测线4和对照线5,检测线4上包被的 是兔抗LSV多克隆抗体，对照线5上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，兔抗LSV多克隆抗体合 适包被量为1.5?2. Oyg蛋白，金标探针合适抗体标记量为16 μ g / mL,羊抗兔IgG纯化 抗体合适包被量为2. 0?2. 5 μ g蛋白。
[0021] 其中，样品垫和胶体金结合垫材质均为玻璃纤维素膜，衬板为聚氯乙烯材质做成， 起支持作用。
[0022] 本发明试剂卡的制备方法：
[0023] 1、本发明中兔抗LSV多克隆抗体的制备方法
[0024] 从感染了 LSV的百合叶片中提取总RNA进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR)，扩 增LSV的CP基因片段。通过酶切克隆至pET-28a载体。重组质粒转化入大肠杆菌BL21， 37°C培养，IPTG诱导表达，镍柱亲和层析纯化获得大小32. OkDa的LSV CP基因工程融合蛋 白。用lmg / mL的LSV CP基因工程融合蛋白作为免疫原分别免疫新西兰大白兔。初次免 疫中，将蛋白抗原与弗氏完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射。两周后进行加强免 疫，将蛋白抗原与弗氏不完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射。以后每两周加强免 疫一次，在第4次加强免疫后的5?7天颈动脉采血，静至，离心，收集到的血清加入质量百 分比浓度0.02%的叠氮钠，-20°C保存。所得抗血清依次通过20%、50%、33%三个饱和度 的硫酸铵沉淀粗提后，透析至PH7. 8的磷酸缓冲液，然后使用DE52阴离子交换柱进行纯化 而获得兔抗LSV多克隆抗体IgG。
[0025] 2、胶体金标记兔抗LSV多克隆抗体的方法
[0026] 分别取半径为30nm的胶体金10mL及兔抗LSV多克隆抗体160 μ g，在PH7. 5的条 件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加牛血清白蛋白（BSA)作为稳定剂，使得终浓度为1%， 采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及去凝聚物，在离心管底 部的深红色沉淀即为胶体金-抗体结合物。
[0027] 3、胶体金结合垫的制备
[0028] 用1 / 10标记前胶体金溶液体积的重悬液悬浮胶体金-抗体结合物，离心，上清 液用喷涂设备涂于玻璃纤维素膜上，37 °C烘干，制成胶体金结合垫。
[0029] 4、免疫层析膜的包被
[0030] 检测线包被的是兔抗LSV多克隆抗体，对照线包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，每条 线宽2mm，兔抗LSV多克隆抗体合适包被量为1. 5?2. 0 μ g蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体合适 包被量为2.0?2. 5yg蛋白。
[0031] 5、胶体金试剂卡的组装
[0032] 聚氯乙烯衬板作为支撑载体固定于试剂卡槽下壳体中，然后样品垫、胶体金结合 垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次排列连接于聚氯乙烯衬板上表面，再将试剂卡槽上壳体 与下壳体通过卡扣连接。
[0033] 6、胶体金试剂卡的使用及结果判定
[0034] 吸取少量百合样品的待检测溶液，滴在试剂卡槽上壳体第一孔洞2处，由于毛细 效应液体往前移动，若待测液中含有LSV，检测样品经过胶体金垫时，LSV与金标垫上的金 标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述检测线方向层析泳动，当接触到检测线时与兔 抗LSV多克隆抗体发生抗原抗体结合反应而被截留下来，形成可见的棕红色条带；未结合 的复合物继续向对照线方向渗移，当接触到对照线时与固定在对照线上的羊抗兔IgG纯化 抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带。即当检测线和对照线上均出现棕红色的 条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒。
[0035] 若待测液中不含LSV，检测样品经过胶体金垫时，则不能与金标垫上的金标多克隆 抗体结合，当接触到所述检测线时不发生反应，金标多克隆抗体继续向对照线方向渗移，当 接触到对照线时与固定在对照线上的羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的 棕红色条带。即当检测线没有颜色变化而仅对照线出现棕红色的条带时，则判定被检样品 没有感染百合隐症病毒。
[0036] 上述实施例可以看出，本发明可直接对LSV进行检测，一般人员不需专门培训即 可操作，5?10分钟就可出结果，从而达到快速、简便、及时检测该病毒的目的。
【权利要求】
1. 一种百合隐症病毒胶体金免疫层析检测试剂卡，包括：试剂卡槽（1)，衬板（10)，样 品垫（6)，胶体金结合垫（7)，硝酸纤维素膜（8)，吸水滤纸（9)，其特征在于：试剂卡槽（1) 包括上壳体和下壳体，上壳体和下壳体通过卡扣连接，上壳体设有第一孔洞（2)和第二孔 洞（3)，样品垫（6)置于第一孔洞（2)下方，硝酸纤维素膜（8)置于第二孔洞（3)下方，胶体 金结合垫（7)上含有金标探针，衬板（10)固定于试剂卡槽（1)中，样品垫（6)、胶体金结合 垫（7)、硝酸纤维素膜（8)和吸水滤纸（9)依次排列连接于衬板（10)上表面，硝酸纤维素 膜（8)上设有检测线（4)和对照线（5)，检测线（4)上包被的是兔抗LSV多克隆抗体，对照 线（5)上包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，兔抗LSV多克隆抗体合适包被量为1. 5?2. 0 μ g 蛋白，金标探针合适抗体标记量为16 μ g/mL,羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2. 0? 2. 5 μ g蛋白。
2. 根据权利要求1所述的百合隐症病毒胶体金免疫层析检测试剂卡，其中在用所述百 合隐症病毒胶体金免疫层析检测试剂卡检测时，在所述第一孔洞处加入少量百合样品的待 检溶液，对比检测线和对照线的颜色，即可判定被检测百合是否感染了百合隐症病毒。
3. 根据权利要求2所述的百合隐症病毒胶体金免疫层析检测试剂卡，其中将少量待检 溶液加入所述第一孔洞处5?10分钟后，若待检溶液中含有LSV，检测样品经过所述胶体 金结合垫时，LSV与金标垫上的金标多克隆抗体形成复合物，然后继续向所述检测线方向渗 移，当接触到所述检测线时与兔抗LSV多克隆抗体发生抗原抗体结合反应而被截留下来， 形成可见的棕红色条带；未与检测线结合的复合物继续向所述对照线方向渗移，当接触到 所述对照线时与羊抗兔IgG纯化抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当检测 线和对照线上均出现棕红色的条带时，则判定被检样品感染了百合隐症病毒。
4. 根据权利要求2所述的百合斑驳病毒胶体金免疫层析检测试剂卡，其中将少量待检 溶液加入所述第一孔洞处5?10分钟后，若待检溶液中不含LSV，检测样品经过所述胶体金 结合垫时，则不能与金标垫上的金标多克隆抗体结合，当接触到所述检测线时不发生反应， 金标多克隆抗体继续向所述对照线方向渗移，当接触到所述对照线时与羊抗兔IgG纯化抗 体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带；当检测线没有颜色变化而仅对照线出现棕 红色的条带时，则判定被检样品没有感染百合隐症病毒。
5. -种如权利要求1-4所述的百合隐症病毒胶体金免疫层析检测试剂卡的制备方法， 其特征在于按以下步骤进行：（1)兔抗LSV多克隆抗体的制备；（2)胶体金标记兔抗LSV 多克隆抗体的方法：分别取半径为30nm的胶体金10mL及兔抗LSV多克隆抗体160 μ g，在 PH7. 5的条件下通过磁力搅拌震荡使其结合，加牛血清白蛋白（BSA)作为稳定剂，且使得终 浓度为1 %，采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝聚物， 在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-抗体结合物；（3)胶体金结合垫的制备：用1 / 10 标记前胶体金溶液体积的重悬液悬浮胶体金-抗体结合物，离心，上清液用喷涂设备涂于 玻璃纤维素膜上，37°C烘干，制成胶体金结合垫；(4)免疫层析膜的包被：在硝酸纤维素膜 上分别包被兔抗LSV多克隆抗体检测线和羊抗兔IgG纯化抗体对照线，每条线宽2mm，兔抗 LSV多克隆抗体合适包被量为1. 5?2. 0 μ g蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为2. 0? 2. 5 μ g蛋白；（5)试剂卡的组装：将聚氯乙烯衬板作为支撑载体固定于试剂卡槽下壳体中， 然后样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次排列连接于衬板上表面，再将试 剂卡槽上壳体与下壳体通过卡扣连接，就得到LSV胶体金免疫层析检测试剂卡。
【文档编号】G01N33/543GK104122390SQ201410151342
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】张玉宝, 王亚军, 谢忠奎, 王若愚, 郭志鸿, 张丽华 申请人:中国科学院寒区旱区环境与工程研究所