一种使用薄层色谱板检测黄酒中生物胺的方法
【专利摘要】本发明公开了一种使用薄层色谱板检测黄酒中生物胺的方法，属于黄酒成分分析检测【技术领域】。本发明将生物胺标准品和待测黄酒样品用衍生试剂衍生，利用液液萃取富集生物胺，于薄层板上点样，将薄层板置于装有一定比例展开剂的层析缸中展开。于紫外灯下显色、观察，定性检测目标生物胺。最后采用薄层色谱仪对黄酒中生物胺进行定量测定。本方法中生物胺的检测限范围是0.5μg/mL-5μg/mL，平均加标回收率88.5％-110.3％，标准偏差为3.8％-12.5％，一块20*20的薄层玻璃板上最多可同时检测13个样品。与其他分析方法相比，本方法不但实现了黄酒生物胺的定性、定量分析，且操作简便、费用低，可同时检测多个样品。
【专利说明】一种使用薄层色谱板检测黄酒中生物胺的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种使用薄层色谱板检测黄酒中生物胺的方法，尤其是一种使用薄层色谱法定性、定量检测黄酒中生物胺的种类及含量的方法，属于黄酒成分分析检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]黄酒是我国特有的发酵酒，堪称东方酿造界的典型代表。但其发酵过程复杂且难以控制，因此黄酒酒液中含有丰富而复杂的成分，包括水分、乙醇、糖类、有机酸、含氮化合物、总固形物、不挥发酯、挥发性成分(包括醇、酸、酯、羟基化合物)、有机成分等。其中含有的氨基酸种类高达18种，总含量是其他酒种(啤酒、葡萄酒、白酒)氨基酸含量的一倍至数倍。氨基酸可被微生物代谢形成生物胺等潜在的有害成分，使得黄酒的安全性受到质疑。黄酒中的生物胺(尤其是组胺)越来越多的受到消费者、制造商和研究者的关注，因此加强黄酒中生物胺的监测对提高黄酒品质和安全性具有重要意义。
[0003]一些研究已经确认来自不同地区的黄酒中存在生物胺，并对黄酒中生物胺的种类及含量进行了检测分析。目前，黄酒中的生物胺主要是通过高效液相色谱法进行检测。高效液相色谱法技术虽然精确、灵敏，但既昂贵又费时，且一次只能完成I种样品的检测，远远不能满足实际生产中高通量、便宜、简便、快速的检测要求。在原有分析检测方法的基础上，亟需发明一种费用低、操作简单、可同时实现多个样品检测的方法。
[0004]薄层色谱法(thin-layer chromatography, TLC)是一种基于视觉光斑强弱的简单、半定量的方法，不需要重型或昂贵的设备，且允许对多个样品进行同时分析。本发明首次成功地应用薄层色谱法定性和定量地分析了黄酒中的生物胺，并对方法的准确性和精确性进行了验证，表明该方法是一个有效替代HPLC的检测分析方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是在于提供一种使用薄层色谱板检测黄酒中生物胺的方法，尤其是一种运用薄层色谱法定性、定量检测黄酒中生物胺种类及含量的方法。由于生物胺分子中缺少发色基团，本身既无紫外吸收、又无荧光及电化学活性，使得各类生物胺的分离及测定非常困难，所以本发明方法利用衍生化试剂对黄酒样品中的生物胺进行衍生，使其带上发光基团，然后在薄层色谱硅胶板上点样，用一定比例的展开剂展开，从而可在紫外或者荧光灯下定性检测，采用薄层色谱分析仪对相应的生物胺进行定量。
[0006]本发明的技术方案主要包括以下步骤:
[0007](I)称取适量生物胺标品用0.lmol/L的盐酸定容，制成母液备用；称取适量丹磺酰氯溶于丙酮制备成1-lOmg/mL的衍生化试剂备用；
[0008]所述生物胺包括尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺、腐胺、色胺等；
[0009](2)不同浓度的生物胺标准溶液的配制:10-400μ g/mL酪胺、亚精胺标准溶液；
5.0-200 μ g/mL精胺标准溶液；20_800 μ g/mL组胺、腐胺标准溶液；40_1000 μ g/mL尸胺标准溶液；
[0010](3)衍生:分别取等体积的待衍生标准溶液及黄酒样于不同的塑料离心管中，在每个离心管中加入一定体积的饱和NaHCO3溶液使之呈碱性，再加入1-5倍样品溶液体积的衍生化试剂，在涡流混合器上涡旋混匀，置于黑暗恒温水浴锅中衍生，取出；在室温下放置几分钟后，加入1/2样品溶液体积的饱和NaCl溶液，再加入与样品溶液等体积的有机溶剂萃取，待分层后取上层有机相在薄层硅胶板上点样；所述衍生温度为25°C?60°C，衍生时间为10?60min ；
[0011](4)点样、分离:在硅胶薄层玻璃板上进行衍生样品的分离，样品从距板的底部IOmm处开始点样，试样之间的距离至少15mm ；
[0012](5)展开:在分析之前，层析缸需要用展开剂混合物饱和，然后将点样后的硅胶薄层玻璃板置于装有展开剂的薄层室中展开，混合物从盘的底部升到约19cm处停止，干燥；
[0013](6)显色:在紫外灯下显色，与混合标准样品进行比对，定性分析黄酒样品中的生物胺种类。
[0014](7)定量分析:采用薄层色谱仪在254nm条件下对色谱板进行扫描，根据样品中斑点对应的的峰面积定量计算黄酒中各生物胺含量及黄酒中生物胺的总量。
[0015]所述步骤(3)中有机萃取剂优选异己烷、乙醚、乙酸乙酯等。
[0016]所述步骤(3)中加入饱和碱性溶液是让衍生在碱性条件下进行，更利于衍生反应使生物胺带上发光基团并有效降低该检测法的检测限。步骤(3)中加入饱和盐溶液的目的是为了提高灵敏度，促进生物胺进入有机相，使得萃取效率最佳。
[0017]所述步骤(5)中的展开剂比例优选展开速度最快、展开时间最短、展开效果最佳的比例。
[0018]所述步骤(5)中展开剂优选按体积比2:1?6:1混合的氯仿:三乙胺或按体积比2:1:1?6:4:1混合的氯仿:乙醚:三乙胺，最佳比例根据展开时间的长短、生物胺的分离效果而定；展开时间优选I?2h。
[0019]本发明对传统方法进行了改进，优化了样品的前处理方法、衍生试剂的比例、衍生条件，生物胺萃取剂以及展开剂的比例。这些修饰可以最大限度地缩短检测时间，从而实现快速检测。本发明方法是一种简便、高通量的分析方法，标准曲线的线性良好，检测下限范围是0.5μ g/mL-5y g/mL，平均加标回收率88.5% -110.3%，标准偏差为3.8% -12.5%,该方法可在l_2h内同时测定13个黄酒样品。与现代检测食品中生物胺通常使用的分析方法:高效液相色谱法和毛细管电泳法相比，本发明无需昂贵的分析仪器，费用低，操作简便、快捷，对黄酒中生物胺的定性与定量测定，可有效降低检测成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1:不同浓度的生物胺混合标准溶液薄层色谱图；图中从左向右各加样孔生物胺浓度分别为:80、40、20、10、5.0,2.0、1.0,0.5 μ g/mL
[0021]图2:不同浓度的酪胺标准溶液薄层色谱图；图中从左向右各加样孔酪胺浓度分别为:10、20、40、80、160、320μ g/mL
[0022]图3:不同浓度的酪胺标准溶液薄层色谱标准曲线
[0023]图4:不同浓度的组胺标准溶液薄层色谱图；图中从左向右各加样孔组胺浓度分别为:20、40、80、160、320、640μ g/mL
[0024]图5:不同浓度的组胺标准溶液薄层色谱标准曲线
[0025]图6:不同浓度的亚精胺标准溶液薄层色谱图；图中从左向右各加样孔亚精胺浓度分别为:10、20、40、80、160、320 μ g/mL
[0026]图7:不同浓度的亚精胺标准溶液薄层色谱标准曲线
[0027]图8:不同浓度的尸胺标准溶液薄层色谱图；图中从左向右各加样孔尸胺浓度分别为:40、80、160、320、640、1000μ g/mL
[0028]图9:不同浓度的尸胺标准溶液薄层色谱标准曲线
[0029]图10:不同浓度的腐胺标准溶液薄层色谱图；图中从左向右各加样孔腐胺浓度分别为:20、40、80、160、320、640μ g/mL
[0030]图11:不同浓度的腐胺标准溶液薄层色谱标准曲线图
[0031]图12:不同生产阶段黄酒中生物胺的薄层色谱图；图中从左向右各加样孔样品所处生产阶段分别为:浸米第2天、浸米第3天、前酵第I天、前酵第2天、前酵第3天、混合标准品、后酵第5天、后酵第10天、原酒、沉淀酒、混合标准品
[0032]图13:不同年份黄酒样品中生物胺的薄层色谱图；图中从左向右各加样孔样品的年份分别为:2014 年、2013 年、2012 年、2011 年、2010 年、2009 年、2004 年、1988 年
【具体实施方式】
[0033]以下结合具体的实例对本发明做进一步的详细说明。
[0034]实施例1不同浓度标准品溶液标准曲线的制作方法
[0035]薄层色谱法制作不同生物胺的标准曲线，包括以下步骤:
[0036](I)不同浓度的生物胺标准溶液的配制:10_400μ g/mL酪胺、亚精胺标准溶液；
5.0-200 μ g/mL精胺标准溶液；20_800 μ g/mL组胺、腐胺标准溶液；40_1000 μ g/mL尸胺标准溶液。分别取不同浓度的标准溶液于不同的塑料离心管中，先加入与标准品溶液等体积的饱和NaHCO3溶液使之呈碱性，再加入1-5倍标准品溶液体积的丹磺酰氯衍生溶液(1-lOmg/mL丙酮)，在涡流混合器上涡旋混匀Imin后，分别置于黑暗30°C -60°C恒温水浴锅中衍生10-60min时间后,取出，在室温下放置几分钟后,加入1/2标准品溶液体积的饱和NaCl溶液，再加入与标准品溶液等的体积有机溶剂萃取，待分层后用进样针取上层有机相在娃胶玻璃板上点样；
[0037](2)在硅胶薄玻璃板上进行衍生样品的分离，样品从距板的底部IOmm开始点样，且等分试样之间的距离需要至少是15mm ；
[0038](3)在分析之前，层析缸需要用展开剂混合物饱和，展开剂混合物为:2:1-6:1 (V/V)的氯仿:三乙胺。然后将硅胶薄玻璃板置于层析缸中展开，混合物从盘的底部升到一定高度(整体迁移约17.5cm)后，将硅胶薄玻璃板在通风橱中干燥；
[0039](4)显色:在凝胶电泳分析成像系统的紫外光下进行显色，找到不同浓度单标准品溶液中生物胺显色的斑点。
[0040](5)定量:采用薄层色谱扫描仪在254nm条件下对色谱板进行扫描，得到不同浓度单标准品溶液中生物胺显色斑点的峰值，每个斑点的峰值对应一定的含量，从而可直接得到各标准品的标准曲线。[0041]实施例2检测不同衍生温度下衍生的黄酒样中的生物胺
[0042]薄层色谱法定性、定量检测不同衍生温度下衍生的黄酒样中的生物胺，包括以下步骤:
[0043](I)分别取黄酒样于不同的塑料离心管中，先加入与黄酒样溶液等体积的饱和NaHCO3溶液使之呈碱性，再加入1-5倍样品溶液体积的丹磺酰氯衍生溶液(Ι-lOmg/mL丙酮)，在涡流混合器上涡旋混匀Imin后，分别置于黑暗的常温、35°C、45°C、50°C、55°C、60°C恒温水浴锅中衍生30min时间后，取出，在室温下放置几分钟后，加入1/2样品溶液体积的饱和NaCl溶液，再加入与样品溶液等的体积有机溶剂萃取，待分层后用进样针取上层有机相在娃胶玻璃板上点样；
[0044](2)在硅胶薄玻璃板上进行衍生样品的分离，样品从距板的底部IOmm开始点样且等分试样之间的距离需要至少是15mm ；
[0045](3)在分析之前，层析缸需要用展开剂混合物饱和，展开剂混合物为2:1-6:1(V/V)的氯仿:三乙胺。然后将硅胶薄玻璃板置于层析缸中展开，混合物从盘的底部升到一定高度(整体迁移约17.5cm)后，将硅胶薄玻璃板在通风橱中干燥；
[0046](4)显色:在凝胶电泳分析成像系统的紫外光下进行显色，找到黄酒样中目标生物胺显色的斑点，定性分析黄酒样中生物胺的种类。
[0047](5)定量:采用薄层色谱扫描仪在254nm条件下对色谱板进行扫描，得到不同衍生温度下黄酒样中各生物胺斑点的峰值，将其带入不同生物胺的标准曲线，即可算出不同衍生温度下黄酒样中各生物胺的含量及生物胺的总量。
[0048](6)总结:根据实验结果分析，衍生温度为60°C最佳，在该温度下能检测到最高的生物胺含量。
[0049]实施例3检测不同衍生时间后黄酒中的生物胺
[0050]用薄层色谱法检测衍生不同时间后黄酒中生物胺的方法，包括以下步骤:
[0051](I)分别取不同浓度的黄酒样于不同的塑料离心管中，先加入与黄酒样品溶液等体积的饱和NaHCO3溶液使之呈碱性，再加入1-5倍样品溶液体积的丹磺酰氯衍生溶液(Ι-lOmg/mL丙酮)，在涡流混合器上涡旋混匀Imin后，分别置于黑暗60°C恒温水浴锅中分别衍生10min、20min、30min、40min、50min、60min后，取出，在室温下放置几分钟后,加入1/2样品溶液体积的饱和NaCl溶液，再加入与样品溶液等的体积有机溶剂萃取，待分层后用进样针取上层有机相在硅胶玻璃板上点样；
[0052](2)在硅胶薄玻璃板上进行衍生样品的分离，样品从距板的底部IOmm开始点样且等分试样之间的距离需要至少是15mm ；
[0053](3)在分析之前，层析缸需要用展开剂混合物饱和，展开剂混合物为4:1 (V/V)的氯仿:三乙胺。然后将硅胶薄玻璃板置于层析缸中展开，混合物从盘的底部升到一定高度(整体迁移约17.5cm)后，将硅胶薄玻璃板在通风橱中干燥；
[0054](4)显色:在凝胶电泳分析成像系统的紫外光下进行显色，找到黄酒样中目标生物胺显色的斑点，定性分析黄酒样中生物胺的种类。
[0055](5)定量:采用薄层色谱扫描仪在254nm条件下对色谱板进行扫描，得到不同衍生时间下黄酒样中各生物胺斑点的峰值，将其带入不同生物胺的标准曲线，即可算出不同衍生时间下黄酒样中各生物胺的含量及生物胺的总量。[0056](6)总结:根据实验结果分析，衍生时间为30min最佳，在该时间下能检测到最高的生物胺含量。
[0057]实施例4检测不同比例展开剂展开后黄酒中的生物胺
[0058]用薄层色谱法检测不同比例展开剂展开后黄酒中生物胺的方法，包括以下步骤:
[0059](I)分别取不同浓度的黄酒样于不同的塑料离心管中，先加入与样品溶液等体积的饱和NaHCO3溶液使之呈碱性，再加入1-5倍样品溶液体积的丹磺酰氯衍生溶液(1-1Omg/mL丙酮)，在涡流混合器上涡旋混匀Imin后，分别置于黑暗30°C -60°C恒温水浴锅中衍生10-60min时间后，取出，在室温下放置几分钟后，加入1/2样品溶液体积的饱和NaCl溶液，再加入与样品溶液等的体积有机溶剂萃取，待分层后用进样针取上层有机相在硅胶玻璃板上点样；
[0060](2)在硅胶薄玻璃板上进行衍生样品的分离，样品从距板的底部IOmm开始点样且等分试样之间的距离需要至少是15mm ；
[0061](3)在分析之前，层析缸需要用展开剂混合物饱和，展开剂混合物分别为2:1(V/V)的氯仿:三乙胺、6:1:1的氯仿:乙醚:三乙胺和6:1(V/V)的氯仿:三乙胺。然后将硅胶薄玻璃板置于层析缸中展开，混合物从盘的底部升到一定高度(整体迁移约17.5cm)后，将硅胶薄玻璃板在通风橱中干燥；
[0062](4)显色:在凝胶电泳分析成像系统的紫外光下进行显色，找到黄酒样中目标生物胺显色的斑点，定性分析黄酒样中生物胺的种类。
[0063](5)定量:采用薄层色谱扫描仪在254nm条件下对色谱板进行扫描，得到不同比例展开剂展开后黄酒样中各生物胺斑点的峰值，将其带入不同生物胺的标准曲线，即可算出不同比例展开剂展开后黄酒样中各生物胺的含量及生物胺的总量。
[0064](6)总结:根据实验结果分析，6:1(V/V)的氯仿:三乙胺展开的效果最佳，在该比例展开剂的条件下能检测到最高的生物胺含量。
[0065]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一种使用薄层色谱板检测黄酒中生物胺的方法，其特征在于，是利用衍生化试剂对黄酒样品中的生物胺进行衍生化处理，使其带上发光基团，然后采用薄层色谱分析仪对生物胺进行分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生化是将黄酒样置于离心管中，再向离心管中加入饱和NaHCO3溶液使之呈碱性，再加入衍生化试剂，在涡流混合器上涡旋混匀，于黑暗恒温条件下衍生，然后取出在室温下放置几分钟后，加入1/2样品溶液体积的饱和NaCl溶液，再加入与样品溶液等体积的有机溶剂萃取，待分层后取上层有机相用于分析；所述衍生化试剂是丹磺酰氯，溶解于丙酮，浓度为I?10mg/mL，用量为1_5倍样品溶液体积，衍生温度为25°C?60°C,衍生时间为IOmin?60min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物胺包括尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺、腐胺、色胺。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，采用薄层色谱分析仪对生物胺进行分析时，展开剂为按体积比2:1?6:1混合的氯仿:三乙胺或按体积比2:1:1?6:4:1混合的氯仿:乙醚:三乙胺。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，主要包括以下步骤: (1)衍生:分别取一定量的待衍生标准溶液或黄酒样于塑料离心管中，在每个离心管中加入一定体积的饱和NaHCO3溶液使之呈碱性，再加入1-5倍样品溶液体积的衍生化试齐U，在涡流混合器上涡旋混匀，置于黑暗25°C?60°C衍生IOmin?60min，取出；在室温下放置几分钟后，加入1/2样品溶液体积的饱和NaCl溶液，再加入与样品溶液等体积的有机溶剂萃取，待分层后取上层有机相在薄层硅胶板上点样； (2)点样、分离:在硅胶薄层玻璃板上进行衍生样品的分离，样品从距板的底部IOmm处开始点样，试样之间的距离至少15_ ； (3)展开:在分析之前，层析缸需要用展开剂混合物饱和，然后将点样后的硅胶薄层玻璃板置于装有展开剂的薄层室中展开，混合物从盘的底部升到约19cm处停止，干燥； (4)显色:在紫外灯下显色，与混合标准样品进行比对，定性分析黄酒样品中的生物胺种类。 (5)定量分析:采用薄层色谱仪在254nm条件下对色谱板进行扫描，根据样品中斑点对应的的峰面积定量计算黄酒中各生物胺含量及黄酒中生物胺的总量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中有机溶剂为异己烷、乙醚或乙酸乙酯。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中展开剂为按体积比2:1?6:1混合的氯仿:三乙胺或按体积比2:1:1?6:4:1混合的氯仿:乙醚:三乙胺。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中展开时间为I?2h。
【文档编号】G01N30/90GK103983733SQ201410217792
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】毛健, 黄桂东, 魏晓璐 申请人:江南大学