一种提高蛋白质在氘代试剂中氢氘原子交换效率的方法
【专利摘要】本发明提供了一种厌氧条件下，利用惰气加压，以同位素辐射提高蛋白质在氘代试剂中氢氘原子交换效率的方法。将待测蛋白溶解于氘代试剂中，溶液体系充惰性气体以增加压力至0.15-1.0MPa。放射源选用钴-60、铯-137等放射性同位素，剂量在5-500kGy范围内。所检测蛋白基本涵括所有蛋白种类，交换率以质谱法检测。
【专利说明】一种提高蛋白质在氘代试剂中氢氘原子交换效率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用厌氧状态下加压，同位素辐射提供额外能量，用以提高蛋白质在氘代试剂中氢氘原子交换效率的方法。本发明属于化学反应热力学领域。
【背景技术】
[0002]处于自然状态的蛋白一般都具有紧致的折叠结构。构成蛋白质的氨基酸主链上的α -位氢原子由于折叠或者螺旋构象，而处于不同的空间位置。在厌氧条件下，放射性同位素可以通过辐射，引发氨基酸片段的α-位氢原子转移，形成α-碳自由基中心。同时，在一定几率上，如果氨基酸片段的Ct -侧链末端也含有氢原子，同样的，在所述α-位侧链末端也可以形成α-位侧链自由基中心。辐射条件下的氘代试剂，在厌氧条件下也会形成氘原子自由基，可与氨基酸片段自由基(α -碳自由基或者α -侧链自由基)成键(例如通过碳原子提供的sp3轨道成键)。这个过程，可以看做是蛋白质主链的氢氘原子交换过程，这是一种自由基反应，与传统的酰胺氢原子交换存在着本质区别。
[0003]氨基酸主链上质子交换作用的有效部位由蛋白的精确构造决定。所述的有效部位主要指蛋白质主链上与酰胺N毗邻的α-碳原子上的氢原子，或者是氨基酸片段的α-位侧链。当蛋白质溶于D2O以及其他一些氘代试剂后，在自由基反应条件下，将发生氢氘原子的交换。当蛋白处于紧密折叠状态下，只有较少数目的α-氢原子或末端氢原子可接触到溶剂并参与质子交换。所述的交换效率取决于α-氢原子处于蛋白质折叠空间内或是否参与蛋白质之间的相互作用。可以通过检测确定蛋白质不同序列片段的氢氘交换速率，从而判断蛋白质结构中哪些部位参与了构象变化并具有形成活性中心的可能以及潜在的蛋白-蛋白相互作用位点。α-氢原子的这种质子交换反应可以用作判断、表征蛋白质结构的探针应用在酶活中心、药物靶点的判定。
[0004]蛋白质主链的同位素交换可由一维或者二维核磁进行表征与测定，但研究者们更倾向于使用质谱法，通过分子量增量和理论值的比值，直接计算氘氢交换率。对于大分子量的蛋白质反应体系，多采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Mald1-TOF)进行测试，对于一般的小分子量蛋白质片段例如酶等，离子阱质谱和三重四级杆质谱均可用来测定。
[0005]上述蛋白质主链上氢氘原子自由基交换的反应体系，一般在和蛋白质样品匹配的PH范围，厌氧环境中，让体系自行反应，直至达到氢氘原子交换的热力学平衡。这种传统的让质子交换自然趋于平衡的反应方法，尽管可以在保持蛋白质样品性质不变的前提下，预测蛋白结构与活性部位，但是反应速度慢(> 30min)，交换率低(< 80% )。一种高效快速的氢氘原子交换方法，具有重要的研发意义并处于长期技术改进中。
[0006]同位素辐射技术的应用将科学上的理论推测在分子水平，甚至原子、原子核水平动态地进行了核实，丰富了研究手段。同位素辐射技术在辐射育种、灭虫杀菌、食品保鲜和水利工程等方面都已经产生了巨大的经济效益和社会效益。在化学反应领域，辐射射线与物质的相互作用，对放射源说，它是一种能量传递和能量损耗过程；对受照射体系来说，它是一种对外来能量的物理性反应和吸收过程。对于蛋白质而言，在接受同位素辐射的情况下，蛋白质结构接受能量而变得更易于改变构象。同时额外的压力，一方面使蛋白质更易溶解于试剂，使蛋白质构象更趋向舒展；另一方面正压使自由基中心在热力学上更易发生；此外，惰气加压过程可促进体系排除氧气，维持厌氧环境。同位素辐射与气体加压联用对蛋白质氣代溶液体系中氢氣交换效率的影响未有报道。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种利用厌氧状态下，充入惰气加压，同位素辐射提高蛋白质在氘代试剂中氢氘原子交换效率的方法。在本发明中，待检测蛋白质溶解于氘代试剂中而无需后步骤蛋白结晶。所述氘代试剂为一种特指的氘代试剂或者几种氘代试剂的混合体系。氘代溶液的pH值，以待检测蛋白的溶解性而定。
[0008]为了使反应体系达到厌氧环境，向所述蛋白质氘代溶液中充入氩气大于20分钟，再向所述蛋白质氘代溶液充入N2O气体大于15分钟，所述蛋白质氘代溶液含氧量小于300ppmo
[0009]溶解蛋白质的同时，向蛋白质的氘代溶液液面施加气体压力。所述施加气体压力方法为，以惰性气体充入含有蛋白质溶液的密闭容器。蛋白质溶液体系压力为
0.15-1.0MPa，优选0.3-0.5MPa。所述惰性气体为氦气、氩气、氮气中的一种或者其中两种气体的混合气体，优选为IS气。
[0010]本发明的检测对象包括为清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、硬蛋白类、核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、色蛋白、金属蛋白、磷蛋白的一种或者几种。针对不同的检测对象，所选用的氘代试剂为重水、氘代乙酸、氘代丙酮、氘代乙腈、氘代甲醇、氘代氯仿、氘代二氯甲烷、氘代正己烷、氘代正辛烷、氘代正戊烷、氘代四氢呋喃、氘代甲苯、氘代二甲苯、氘代苯甲酸中的一种或者其中几种的混合溶液。检测蛋白时，氘代溶剂的选择依据之一是能让待测蛋白完全溶解；氘代溶剂的选择依据之一是不引起待测蛋白变性。
[0011]本发明的放射源来自于放射性同位素镅-241、钡-133、镉-109、锎-252、钴-57、钴-60、铯-137、铕-152、铁-55、钆-153、氪-85、钠-22、镍-63、钷-147、钌-106、硒-75、锶-90、镱-169、铱-192中的一种或者几种。优选为钴-60和铯-137。放射性同位素使用齐U量为lX10_4-lX104kGy，优选为5_500kGy。检测蛋白时，放射性同位素使用剂量的选择依据之一是不会导致待测蛋白质变性。
[0012]本发明中所述加压条件下，同位素辐射提高蛋白质在氘代试剂中氢氘原子交换效率的方法，氢氘原子转换率在2min内超过99%，所述交换效率以质谱法检测。其中，分子量大于5，000的蛋白质样品用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Mald1-TOF)进行测试，分子量小于5，000的蛋白质样品用离子阱质谱或者三重四级杆质谱测定。交换率用如下公式计算，E= [ ) / (Hi100O7l; ~m0%) ] X 100 % ;其中E为氢氣原子交换率，m为即时取样所得蛋白质样品分子质量，Hic^为蛋白质样品初始分子量，为蛋白质样品α -位氢原或者α-位侧链末端氢原子完全被氘原子取代后的分子量。
【专利附图】
【附图说明】
【具体实施方式】
[0013]用具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限制于此。
[0014]实施例1
[0015]在连有数显压力计的耐压玻璃反应容器中，将牛血红蛋白溶解于重水(99.9%原子D)、氘代乙酸(98%原子D)和氘代甲醇(99.5%原子D)的混合溶液(体积比为95: 2: 3)中。充入氩气30分钟，再向所述蛋白质氘代溶液充入N2O气体20分钟，所述蛋白质氘代溶液含氧量=200ppm。溶液浓度为0.lmol/L,向体系充氩气以使体系压力达到
0.15MPa。放射源为钴-60，剂量为5kGy。反应2min，所得测试样以基质辅助激光解析电离飞行时间质谱表征。由公式E = [ (m-m0.^ ) / (Hi100O7l; ~m0%) ] X 100%计算得到,氢氣原子交换率为99.2%。
[0016]实施例2
[0017]在连有压力计的四氟接口耐压玻璃反应容器中，将缓激肽溶解于重水(99.9%原子D)和氘代乙酸(98%原子D)的混合溶液(体积比为99: I)中，溶液浓度为0.2mol/L。充入氩气25分钟，再向所述蛋白质氘代溶液充入N2O气体25分钟，所述蛋白质氘代溶液含氧量=150ppm。向体系充氩气以使体系压力达到0.4MPa。放射源为铯-137，剂量为500kGy。反应2min,所得测试样以离子讲质谱表征。由公式E = [ ) / (m1QQ%-mQ% ) ] X 100%计算得到，氢氘原子交换率为99.5%。
【权利要求】
1.一种提高蛋白质在氘代试剂中氢氘原子交换效率的方法，其特征在于，蛋白质氘代溶液处于厌氧状态下，并同时处于加压条件下，通过放射性同位素的辐射提供额外能量，促进蛋白质主链上的氢原子与氘原子的交换。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质氘代溶液含氧量小于300ppm。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，向所述蛋白质氘代溶液中充入氩气大于20分钟，再向所述蛋白质氘代溶液充入N2O气体大于15分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白质的氘代溶液处于的压力范围为0.15-1.0Mpa0
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用非金属导管向含有蛋白质的氘代溶液的容器内充入惰性气体。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，向含有蛋白质的氘代溶液的容器内充入的惰性气体为氦气、氩气、氮气中的一种或者其中两种气体的混合气体。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述放射性同位素为镅-241、钡-133、镉-109、锎-252、钴-57、钴-60、铯-137、铕-152、铁-55、钆-153、氪-85、钠-22、镍-63、钷-147、钌-106、硒-75、锶-90、镱-169、铱-192中的一种或者几种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，放射性同位素辐射剂量为lX10_4-lX104kGy。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，放射性同位素辐射剂量为5-500kGy。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质为清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、硬蛋白类、核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、色蛋白、金属蛋白、磷蛋白的中一种或者几种。
【文档编号】G01N30/06GK104198631SQ201410394622
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月11日 优先权日:2014年8月11日
【发明者】贾明宏 申请人:贾明宏