一种定量检测L-半胱氨酸的方法与流程

本发明涉及一种生理物质的检测方法，具体是指一种利用葡萄糖/氧气生物燃料电池定量测定L-半胱氨酸的方法。

背景技术：

L-半胱氨酸是一种重要的氨基酸，存在于许多蛋白质、谷胱甘肽中。它在许多生物过程中具有非常重要的功能，并且其含量水平异常与肝脏损伤、皮肤损害、老年痴呆症和心血管疾病等许多重要的疾病有联系。另外L-半胱氨酸在食品加工业中被广泛使用，主要用于焙烤制品，作为面团改良剂的必需成分。因此L-半胱氨酸的定量检测不论对生理过程和临床诊断，还是对食品加工业，均具有十分重要的意义。

目前，定量检测L-半胱氨酸的常用方法有分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和电化学方法等。但是这些方法均有其不足之处，例如，分光光度法、高效液相色谱法和气相色谱-质谱法尽管检测的精度比较高，但其仪器昂贵，样品处理繁琐，技术要求高。近年来发展起来的电化学传感器，如氧化石墨烯/金纳米颗粒修饰的电极检测L-半胱氨酸的线性范围和检出限分别为0.5-20μM和0.02μM，氧化锌纳米颗粒修饰的电极检测L-半胱氨酸的线性范围和检出限分别为0.2-20μM和0.05μM。尽管这种电化学传感器采用了相对廉价的仪器，但是其技术要求较高的缺陷不可避免。而且电化学工作站难以实现微型化。因此，建立一种简单、灵敏、特异的L-半胱氨酸检测方法势在必行。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种基于葡萄糖/氧气生物燃料电池高灵敏度定量检测L-半胱氨酸的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种定量检测L-半胱氨酸的方法，利用葡萄糖/氧气生物燃料电池的自供电性，同时在Cu²⁺存在下抑制电池的开路电位，并在L-半胱氨酸与Cu²⁺形成Cu-S键，根据开路电位随L-半胱氨酸浓度的变化实现对待测样品中L-半胱氨酸的定量检测。所述葡萄糖/氧气生物燃料电池以黄素腺嘌呤二核苷酸依赖的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)作用于生物阳极，漆酶作用于生物阴极。

本发明技术方案进一步优选是，在Cu²⁺的存在下，利用Cu²⁺抑制生物阳极FAD-GDH的活性，降低葡萄糖/氧气生物燃料的开路电位，而后再利用待测样品中L-半胱氨酸与Cu²⁺形成Cu-S键，并降低其抑制作用，通过L-半胱氨酸加入前后开路电位的变化，从而达到定量检测L-半胱氨酸的目的。

所述葡萄糖/氧气生物燃料电池的生物阳极采用维生素K₃为电子介体，生物阴极则采用2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为电子介体。

本发明的效果是：

1.本发明利用基于FAD-GDH的生物阳极和基于漆酶的生物阴极，而生物阳极和生物阴极分别采用维生素K₃和ABTS为电子介体，从而构筑了高性能葡萄糖/氧气生物燃料电池。同时利用该电池定量的对L-半胱氨酸的检测；其中，电池最大功率密度为98μW cm^-2，开路电位0.78V。测定L-半胱氨酸的方法灵敏度高，具有较宽的检测范围(20nM-3μM)和较低的检出限(10nM)。并且非巯基的氨基酸对检测几乎没有干扰。

2.本发明利用L-半胱氨酸和Cu²⁺之间形成Cu-S键的作用，降低Cu²⁺对电池开路电位的抑制作用，同时利用生物燃料电池的自供电实现L-半胱氨酸的间接定量检测。可以明显提高检测的灵敏度。

3.通过本发明构筑的葡萄糖/氧气生物燃料电池建立了高灵敏检测L-半胱氨酸的方法。此方法灵敏度高、特异性好、操作简单、成本低，可用于食品行业、生理过程以及临床医学诊断等领域中L-半胱氨酸的监测。

附图说明

图1为本发明实施例提供的葡萄糖/氧气生物燃料电池及L-半胱氨酸的检测机理图。其为L-半胱氨酸与Cu²⁺作用后，可有效回复电池开路电位，实现L-半胱氨酸的间接定量检测。

图2为本发明实施例提供的葡萄糖/氧气生物燃料电池的功率密度曲线图。

图3为本发明实施例提供的L-半胱氨酸检测的标准曲线图。

具体实施方式

本发明目的、功能及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

实施例1

葡萄糖/氧气生物燃料电池的构筑

1.生物阳极的制备

将4μL多壁碳纳米管(2mg/mL)、5μL维生素K₃和10μLFAD-GDH溶液(5mg/mL)依次滴涂在玻碳电极上，干燥后滴加5μLNafion溶液(0.05wt％)。室温干燥，制得基于FAD-GDH的生物阳极。

2.生物阴极的制备

4μL多壁碳纳米管(2mg/mL)和10μL漆酶溶液(5mg/mL)依次滴涂在玻碳电极上并干燥。然后滴加2μL戊二醛溶液(2wt％)，并与4℃下干燥制得基于漆酶的生物阴极。

将生物阳极和生物阴极插入5mL醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.5)中组装生物燃料电池，30mM葡萄糖作燃料，并加入2mM ABTS作为电子介体,利用CHI660E型电化学工作站，采用线性扫描伏安法(LSV)，以1mV/s扫速从开路电位扫描到0V得出i-E曲线，换算后得到电池的功率密度曲线(参见图2)，即电池最大功率密度为98μW cm^-2，开路电位0.78V。

实施例2

利用构筑的葡萄糖/氧气生物燃料电池，在Cu²⁺的存在下，实现L-半胱氨酸的高灵敏度检测：

在上述实施例的电池中加入4μM的Cu²⁺，然后用万用表检测电池的开路电位。随后加入不同浓度的L-半胱氨酸并记录相应开路电位值。最后以L-半胱氨酸浓度为横坐标，开路电位的变化量为纵坐标，绘制标准曲线，可得一条直线，求出其斜率，即为L-半胱氨酸的工作曲线斜率，开路电位的变化量与L-半胱氨酸浓度的线性关系(参见图3)。

L-半胱氨酸的工作曲线如图2所示，由图可知，该工作曲线的R²值达到0.997，线性拟合度很好。

即检测范围为20nM-3μM，较低的检出限为10nM。

实施例3

当地某品牌L-半胱氨酸复合片中L-半胱氨酸含量的测定：

1.样品处理：取适量当地某品牌的L-半胱氨酸复合片，研磨并溶于超纯水中，用0.22μm的一次性滤膜进行过滤处理，用100mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.5)进行稀释定容。

2.L-半胱氨酸的检测过程：以含有30mM葡萄糖、2mM ABTS的5mL醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.5)为底液组装燃料电池，并在底液中加入4mM Cu²⁺测得体系的开路电位OCP₁，然后在底液中相继加入不同体积的L-半胱氨酸样品，并分别测其开路电位OCP₂。

3.L-半胱氨酸浓度的计算：取开路电位的变化量(OCP₂–OCP₁)在标准曲线范围内的稀释比例来进行计算，代入标准曲线得出的计算公式，最后乘以相应的稀释倍数，从而得到某品牌的L-半胱氨酸复合片中L-半胱氨酸的含量为43.1±2.8(w/w,％)。L-半胱氨酸含量计算公式为：

上面结合附图对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细的说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。