一种视黄醇结合蛋白免疫比浊法检测试剂盒的制作方法

本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种视黄醇结合蛋白免疫比浊法检测试剂盒。

背景技术：

视黄醇结合蛋白是血液中特异结合维生素A的结合蛋白，在维生素A的代谢中起重要作用，参与血清及胞内视黄醇及视黄酸的转运，是一类疏水的小分子结合蛋白。视黄醇结合蛋白是由肝脏分泌的一种分子量较低的蛋白质，广泛分布于人体血清、脑脊液、尿液及其他体液中，主要功能是将视黄醇从肝细胞转运到周围组织的上皮细胞。

血液中视黄醇结合蛋白与视黄醇、前白蛋白的复合物形式存在，形成高分子蛋白复合物，此复合物可降低视黄醇结合蛋白在肾脏的分解及肾小球的过滤。但当复合物中的视黄醇与靶蛋白结合后，视黄醇结合蛋白便与前白蛋白分离，从肾小球滤出后，由近端肾小管的上皮细胞吸收，并被分解供组织利用，仅有少量从尿液中排出。视黄醇结合蛋白在尿液中稳定性强，不易分解，不受pH、血压等外环境的干扰。血液中视黄醇结合蛋白的水平因性别、年龄不同而有一定的差异，男性高于女性，成人高于儿童，但儿童体内视黄醇结合蛋白的水平没有性别差异。当体内锌、铁缺乏及感染严重疾病时，视黄醇结合蛋白的生物合成降低。

目前血液及尿液中视黄醇结合蛋白的检测方法较多，主要有放射免疫扩散法、免疫比浊法、免疫电泳法、放射免疫分析法及酶联免疫吸附法。放射免疫分析法、免疫比浊法、酶联免疫吸附法的灵敏度较高，放射免疫分析法成本较高，酶联免疫吸附法只能用来定性，免疫比浊法成为最实用的检测方法。其成本低，可利用全自动生化分析仪定量测定，是值得推广的一种方法，但是免疫比浊法对抗体的纯度和特异性要求较高。

近年来研究表明，视黄醇结合蛋白含量改变能敏感地反映近端肾小管功能、肝功能的损伤程度，是反应肾脏、肝脏及营养性疾病发展的敏感指标。血清视黄醇结合蛋白浓度降低常见于维生素A缺乏，患有肝、胆管疾病，此外，吸收不良综合症、阻塞性黄疸、肝硬化及重症感染、甲亢等时，血清视黄醇结合蛋白浓度也会降低；血清视黄醇结合蛋白浓度升高常见于引起肾小球滤过率降低的肾脏疾病，除此之外，引起血清视黄醇结合蛋白浓度升高的疾病较少见。测定血清中的视黄醇结合蛋白对临床许多疾病的诊断和疗效观察都有非常重要的临床意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种稳定的用于检测视黄醇结合蛋白的试剂盒，该试剂盒采用免疫比浊法进行检测。该试剂盒与常规的试剂盒相比，稳定性、线性相关性比常规的检测试剂盒好，有利于试剂在临床上的推广应用。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种视黄醇结合蛋白免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，它包含试剂R1和试剂R2。试剂R1组成为：50mmol/L pH为6.5甘氨酸缓冲液、10%聚乙二醇6000、50mmol/L氯化钠、10mmol/L叠氮钠；试剂R2组成为：50mmol/L pH为6.5甘氨酸缓冲液、2%胶乳颗粒、1mg/mL羊抗人视黄醇结合蛋白抗体、100mmol/L EDTA、10mmol/L叠氮钠。

所述的视黄醇结合蛋白免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，使用全自动生化分析仪采用终点法进行测定，检测主波长为570nm。

所述的视黄醇结合蛋白免疫比浊法检测试剂盒，试剂R1和试剂R2在使用时的比例为R1：R2=3：1。

本发明的试剂盒在具有双试剂功能的全自动生化分析仪上进行，其具体使用方法如下：

R1:试剂1 R2:试剂2 S:校准品 U:样本

生理盐水、U或S: 读取吸光度A1， 读取吸光度A2

8μl;R1:225μl R2:75µl 计算ΔA

加入生理盐水、样本或校准品8μl，再加入225μl 的R1试剂预，孵育5min后读取吸光度A1，之后再加入75μl的R2试剂，反应5min后读取吸光度A2，并计算ΔA。

本发明的有益效果：

1）试剂R1和试剂R2采用新的缓冲体系，改善了试剂的稳定性；

2）试剂R2添加EDTA，增强了试剂的稳定性，而且不会对试剂的准确度产生影响；

3）试剂的准确度和稳定性良好，价格便宜，使用方便，有利于该试剂在市场中进一步的推广。

附图说明

图1为两种试剂的相关性曲线图，

图2为两种试剂效期稳定性曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

一种常规的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2。

其中试剂R1组成为：

pH 6.5甘氨酸缓冲液 50mmol/L

聚乙二醇6000 10%

氯化钠 50mmol/L

叠氮钠 10mmol/L

试剂R2组成为：

pH 6.5甘氨酸缓冲液 50mmol/L

胶乳颗粒 2%

羊抗人视黄醇结合蛋白抗体 1mg/mL

EDTA 100mmol/L

叠氮钠 10mmol/L

本实施例所述试剂R1和试剂R2，配置时需先加入缓冲物质甘氨酸，用盐酸调到适当pH值后，再添加其它物质。本实施例所述试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的迈瑞800全自动生化分析仪，利用终点法进行测定，检测主波长为570nm，操作如下：

加入生理盐水、样本或校准品8μl，再加入225μl 的R1试剂预孵育5min后读取吸光度A1，之后再加入75μl的R2试剂反应5min后，读取吸光度A2，并计算ΔA。

视黄醇结合蛋白含量（mg/L）＝（∆A测定÷∆A标准）×C标准。

实施例2

准确度验证试验：将实施例1的视黄醇结合蛋白检测试剂作为实验组，市场上获得认可的一种准确度好、稳定性好的视黄醇结合蛋白检测试剂盒作为对照组进行检测，对20个临床血清样本进行检测，检测结果如表1所示。获得了两种试剂的相关性曲线（如图1所示），结果表明，两组试剂盒的相关系数为0.9989，说明两者相关性比较好。证明本发明试剂盒添加及更改的组分对其准确性不会造成影响，试剂盒依然保持较好的准确度。

表1 实施例1试剂与市场认可的视黄醇结合蛋白检测试剂盒对比检测结果

实施例3

线性相关性验证试验：选取视黄醇结合蛋白含量为250mg/L的高值样本，用生理盐水进行系列稀释，配制6个不同浓度的样本，浓度依次为250mg/L、200mg/L、150mg/L、100mg/L、50mg/L、0mg/L。分别利用实施例1试剂及对照组试剂进行检测，每个浓度的样本分别测定三次，分别取平均值，检测结果如表2所示。

表2 实施例1试剂线性相关验证实验检测结果

如上表所示，实施例1与对照组试剂检测结果相关系数均大于0.990，且实施例1试剂检测结果的相关系数略大于对照组试剂检测结果的相关系数，这表明本发明试剂具有更好的线性相关性。

实施例4

稳定性验证实验：在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂，检测实施例1及对照组试剂的稳定性。两组试剂每月选取同一样本测定质控品（靶值 46.8mg/L），测定三次取平均值，检测数据如表3所示。

表3 实施例1试剂稳定性验证实验检测结果

实验结果显示，实施例1试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定，而对照组试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存10个月后开始不稳定，说明本发明试剂更换缓冲液及添加EDTA后稳定性增强。

综上所述，本发明提供的视黄醇结合蛋白免疫比浊法检测试剂盒，试剂R1与试剂R2中的缓冲液更换为50mmol/L pH为6.5的甘氨酸缓冲液，同时在试剂R2中添加EDTA，提高了试剂盒的稳定性，线性相关性较好，试剂的准确度也较好。因此，本发明提供的视黄醇结合蛋白免疫比浊法检测试剂盒有利于在市场中进一步的推广使用。