组织芯片的RNA-蛋白质-DNA原位多重染色方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种组织芯片的RNA-蛋白质-DNA原位多重染色方法。

背景技术：

经典的免疫组织化学是指在单张组织切片上运用一种已知的第一抗体（一抗）与针对性靶抗原进行特异性结合，然后利用加酶标的第二抗体（二抗）与一抗的多价结合和酶底物显色来实现放大免疫反应，使得在显微镜下可清晰观察到被检抗原/蛋白在组织细胞的分布和表达情况。该方法已成为病理学在基础医学和临床医学领域广泛应用的一个最重要和最具有影响力的实验诊断技术。

近二十年来，随着抗原热修复技术的革命性突破，免疫组织化学染色已由执行单一免疫组织化学法发展到双重乃至多重免疫组织化学法。双重乃至多重免疫组织化学技术的原理是（1）利用不同酶标的抗体和其化学底物的不同显色，从而达到在一张组织切片上同时显现两种靶抗原甚至两种以上靶抗原的目的。此改良法虽解决了经典免疫组织化学的靶抗原单一显色的缺点，但却无法完全确保消除两种以上靶抗原之间的交叉免疫反应的影响，故其染色结果缺乏一定的可信性；（2）在同一张组织切片上，先进行第一种抗体染色，经观察后再去除其显色剂，并破坏抗原和抗体的结合，然后用另一种抗体进行下一轮免疫组织化学染色；此技术方法以单一的免疫组织化学染色为基础，可多次重复，但存在经一定批次染色后特异性抗原的免疫反应减弱或消失，切片组织结构变差或完全脱落的缺点。

自1998年Kononen J等人发明微型组织芯片技术以来，帮助蛋白质组学迈向高通量化和标准化。组织芯片能够在一次实验中准确比对不同部位、不同时期甚至不同来源的组织切片的相关信息，大大提高了实验效率；组织芯片是将来源于不同病变程度、不同病期或不同病种的数十乃至数千个微小组织切片样本，整齐有序地排列固定在一张载玻片上。

此外，对同一张组织芯片进行多重免疫组织化学染色，仅能获得该组织切片上的蛋白层面的信息，所得生物信息不够全面。如果需要获得RNA或DNA层面的分子信息，往往需要在额外的组织芯片，单独进行RNA原位杂交或DNA原位杂交，而组织芯片的制备成本较高，往往限制了相关实验的进行。

因此，需要一种能够在RNA、蛋白质和DNA等三个分子层面对同一组织芯片进行检测并获取相应的生物信息的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种组织芯片的RNA-蛋白质-DNA原位多重染色方法，旨在解决现有技术中不能对同一组织芯片进行RNA、蛋白质和DNA等三个分子层面的检测并获取相应的生物信息的问题。

为了实现发明目的，本发明提供了一种组织芯片的RNA-蛋白质-DNA原位多重染色方法，所述方法对同一组织芯片依次进行RNA原位杂交、免疫组化染色和DNA原位杂交；

在所述RNA原位杂交、免疫组化染色和DNA原位杂交过程中，采用表位抗原修复蒸锅对组织芯片进行分子交联解链或抗原修复；

在RNA原位杂交、免疫组化染色过程中，在显色后均用明胶甘油封片。

其中，所述免疫组化染色步骤包括对多个蛋白依次进行免疫组化染色。

其中，所述采用表位抗原修复蒸锅对组织芯片进行分子交联解链或抗原修复的具体步骤为：

A1、将抗原修复液加入抗原修复盒中，并将抗原修复盒置于表位抗原修复蒸锅中预热；

A2、然后将组织芯片浸泡于已预热的抗原修复液中，95℃-98℃处理20 min至30 min；

A3、将抗原修复盒取出，室温冷却。

其中，在所述对多个蛋白依次进行免疫组化染色之前，需进行预实验，确定每一次免疫组化染色所用抗体的最佳浓度和反应程度。

其中，所述对多个蛋白依次进行免疫组化染色根据所述多个蛋白对应抗体的信号，由弱到强的顺序依次进行。

其中，在所述对多个蛋白依次进行免疫组化染色过程中，采用相同的显色剂显色。

其中，在所述RNA原位杂交、免疫组化染色和DNA原位杂交过程中，采用相同的显色剂显色。

其中，所述DNA原位杂交为TUNEL原位杂交。

其中，所述RNA原位杂交步骤中采用环保型生物制片透明剂脱蜡。

所述环保型生物制片透明剂包括但不限于：TO型生物制片透明剂、康柏氏ETC环保组织透明剂（长沙康伯恩医疗科技有限公司）、Van-Clear环保透明剂（上海宏兹实业有限公司）、GS环保试剂（哈尔滨格林标本技术开发有限公司）、环保透明剂（珠海贝索生物技术有限公司）、环保型BT生物组织透明剂（佛山市南海钧镒医疗设备有限公司）、Y透明剂（籁盾公司）、环保透明剂（广州市秀威贸易有限公司）、竹叶提取物（四川自贡雷扁村村委会）、西奈山环保组织透明液（杭州西奈山生物科技有限公司）。

其中，当所述组织芯片为乳腺癌组织芯片时，所述对多个蛋白依次进行免疫组化染色所使用的一抗依次为CD68抗体、ET-IgG抗体、HIF-2a抗体、STAT-3抗体、MTC02抗体；

当所述组织芯片为结直肠癌组织芯片时，所述对多个蛋白依次进行免疫组化染色所使用的一抗依次为HIF-2a抗体、LT-IgG抗体、OS-IgG抗体、IgG抗体、CT-IgG抗体、MTC02抗体；或CD68抗体、LT-IgG抗体、OS-IgG抗体、CT-IgG抗体2。

其中，所述显色剂为AEC显色液。

其中，在所述依次进行RNA原位杂交、免疫组化染色和DNA原位杂交之前还包括验证组织芯片质量的步骤。

进一步的，所述验证组织芯片质量的步骤可直接用RNA原位杂交步骤替代，也可为免疫组化染色步骤。

更进一步的，当所述免疫组化染色步骤包括对多个蛋白依次进行免疫组化染色时，所述验证组织芯片质量的步骤优选采用所述多个蛋白中抗体信号最弱的蛋白所对应的免疫组化染色实验。

由上可知，本发明通过表位抗原修复蒸锅技术对组织芯片进行分子交联解链或抗原修复，并结合明胶甘油封片实现了对同一组织芯片在RNA、蛋白质和DNA等三个分子层面的检测，能够获得更加全面的生物信息，并降低获得这些生物信息的成本。

附图说明

图1是本发明一个具体实施例的方法流程图。

图2是本发明一个具体实施例中的组织芯片经RNA原位杂交染色后的部分实验结果。

图3是本发明一个具体实施例中的组织芯片经6重免疫组化染色后的部分实验结果。

图4是本发明一个具体实施例中的组织芯片经TUNEL原位杂交染色后的部分实验结果。

图5是本发明另一个具体实施例中对同一组织芯片采用表位抗原修复蒸锅技术进行7轮CD68检测的部分结果图。

图6是本发明另一个具体实施例中对同一组织芯片采用微波抗原修复技术进行5轮CD68检测的部分结果图。

图7是本发明的另一个具体实施例中比较表位抗原修复蒸锅技术与微波抗原修复技术对组织结构形态的影响的实验结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

本发明提出第一实施例，一种组织芯片的RNA-蛋白质-DNA原位多重染色方法，所述方法对同一组织芯片依次进行RNA原位杂交、免疫组化染色和DNA原位杂交；

在所述RNA原位杂交、免疫组化染色和DNA原位杂交过程中，采用表位抗原修复蒸锅对组织芯片进行分子交联解链或抗原修复；

在RNA原位杂交、免疫组化染色过程中，在显色后均用明胶甘油封片。

需要说明的是，表位抗原修复蒸锅能够有效修复经多聚甲醛固定过的组织芯片上的组织切片内形成的“分子面罩”，充分暴露抗原决定簇，与其他的分子交联解链或抗原修复方法（例如：微波修复、酶消化法、高温高压法）相比，表位抗原修复蒸锅对组织切片中组织形态的影响更小，有利于实验结果的观察、比较和分析；另外，表位抗原修复蒸锅技术操作简单，对实验操作者要求低，适用于几乎所有类型抗原的修复（如：膜蛋白、胞浆蛋白、核蛋白），有利于本方法在基础科学研究、临床检验等方向推广时的质量控制。

另外，针对采用明胶甘油封片的组织芯片，脱片时，仅需将其浸泡于60℃-80摄氏度的水中，待甘油明胶溶解后，盖玻片会自然脱落；因此，采用明胶甘油封片，有利于简化后续的实验过程中的脱片步骤，并减少脱片步骤对组织芯片上的组织切片中组织形态的影响。

以上，第一实施例中的方法能够有效的实现对同一组织芯片进行RNA、蛋白质和DNA等三个分子层面的检测并获取相应的生物信息。另外，通过相关图形软件（例如photoshop），可将这三个分子层面的检测结果放在同一张图片中进行分析，即共定位分析，这可大大提高实验结果分析效率和准确性。

在第一实施例的基础上，本发明针对所述免疫组化染色步骤，提出第二实施例，所述免疫组化染色步骤包括对多个蛋白依次进行免疫组化染色。

本方案可进一步提升对同一组织芯片所获得蛋白质层面的生物信息数据量，可广泛应用于科学研究和临床检验，且基于得到的生物信息，可通过相关软件，对这些不同蛋白在组织芯片上的分布情况进行共定位分析，这可大大提高实验结果分析效率和准确性。

其中，在所述对多个蛋白依次进行免疫组化染色之前，可进行预实验，确定每一次免疫组化染色所用抗体的最佳浓度和反应程度。

本方案可保证免疫组化染色实验过程中每一次显色的实验效果。

进一步的，所述对多个蛋白依次进行免疫组化染色根据所述多个蛋白对应抗体的信号，由弱到强的顺序依次进行。

在本发明的一个实施例中，所述预实验包括以下步骤：

A1、确定各待检测蛋白是否在该类型组织切片中表达；

A2、确定各待检测蛋白对应的最佳抗体稀释比，及比较各待检测蛋白的阳性信号表达强弱；

A3、确定待检测组织芯片质量是否符合要求。

在本发明一个具体实施例中，所述步骤A2具体为：取与组织芯片上的样本同一类型的石蜡包埋组织块（1～3个），进行连续切片，按照抗体说明书给予的抗体稀释度范围选取2-3个的稀释比，在两张连续切片组织片，同时同条件进行免疫组化染色（还需设置阳性对照及阴性对照），以确定最佳的抗体稀释比，同时根据其染色可得出待检测蛋白的阳性信号表达强弱。

在本发明另一个具体实施例中，所述步骤A3具体可为：用上述步骤A3所确定的最佳条件，对待检测组织芯片按照上述条件进行一次上述免疫组化染色实验，只要其脱片率低于5%，组织平整无气泡，即可认为该待检测组织芯片质量合格。

在本发明另一个具体实施例中，所述步骤A3具体可为：对待检测组织芯片按照上述条件进行一次RNA原位杂交实验，只要其脱片率低于5%，组织平整无气泡，即可认为该待检测组织芯片质量合格。

需要说明的是，本方案中所述多个蛋白对应抗体的信号值的高低可由上述预实验获知。在重复多次免疫组化实验后，特异性抗原的免疫反应可能会减弱，因此，本方案能够有效保证对多个蛋白依次进行免疫组化染色实验时，有效实验结果的获得，避免因为某个蛋白原本的信号值太低，而出现假阴性的现象。

此外，需要进一步说明的是，所述多个蛋白对应抗体的信号值的高低与各蛋白的种类、组织芯片中切片的来源（例如组织来源）相关。

其中，当所述组织芯片为乳腺癌组织芯片时，所述对多个蛋白依次进行免疫组化染色所使用的一抗依次为CD68抗体、ET-IgG抗体、HIF-2a抗体、STAT-3抗体、MTC02抗体。其中，所述ET-IgG抗体为人食管癌组织来源IgG抗体。

其中，当所述组织芯片为结直肠癌组织芯片时，所述对多个蛋白依次进行免疫组化染色所使用的一抗依次为HIF-2a抗体、LT-IgG抗体、OS-IgG抗体、IgG抗体、CT-IgG抗体、MTC02抗体；或CD68抗体、LT-IgG抗体、OS-IgG抗体、CT-IgG抗体。其中，所述LT-IgG抗体为人肺癌组织来源IgG抗体；所述OS-IgG抗体为人宫颈癌患者血来源IgG抗体；所述CT-IgG抗体为人结肠癌组织来源IgG抗体；所述LT-IgG抗体为人肺癌组织来源IgG抗体；所述OS-IgG抗体人宫颈癌患者血来源IgG抗体；所述CT-IgG抗体为人结肠癌组织来源IgG抗体。

此外，需要说明的是，上述一抗的种属来源可谓鼠或兔，相应的二抗可为PV9000（中杉金桥）；另外，上述一抗的种属来源还可以是羊，相应的二抗可谓PV9003（中杉金桥）。另外，需要说明的是，上述一抗均含有相应的标记，用于与二抗特异性结合。当一抗上的标记为Biotin时，二抗可为链酶亲和素-HRP抗体。

对于表位抗原修复蒸锅技术，需要说明的是，所述采用表位抗原修复蒸锅对组织芯片进行分子交联解链或抗原修复的具体步骤可为：

A1、将抗原修复液加入抗原修复盒中，并将抗原修复盒置于表位抗原修复蒸锅中预热；

A2、然后将组织芯片浸泡于已预热的抗原修复液中，95℃-98℃处理20 min至30 min；

A3、将抗原修复盒取出，室温冷却。

本方案将温度控制在95℃-98℃，对大部分抗原具有较好修复效果；且有效的节约了抗原修复的时间，提高了实验效率。

对于RNA原位杂交、免疫组化染色和DNA原位杂交过程中的显色系统，需要说明的是，因为需要进行多次显色和脱色，因此，所使用的显色剂既要有较好的显色效果，又要能够在显色观察之后，能够被有效的洗去。

在本发明的一个实施例中，所述RNA原位杂交、免疫组化染色和DNA原位杂交过程中所使用的二抗含有辣根过氧化物酶标记，相应的显色剂可为AEC，相应的脱色剂为80%乙醇。当然，二抗含有辣根过氧化物酶标记时，相应的显色剂可为DAB，不过DAB无法脱色，因此仅能使用在DNA原位杂交过程中。

在本发明的另一个实施例中，所述RNA原位杂交、免疫组化染色和DNA原位杂交过程中所使用的二抗含有碱性磷酸酶标记，相应的显色剂可为NBT-BCIP，相应的脱色剂为二甲基甲酰胺。

以上，脱色剂的选择取决于酶标二抗及相应的显色剂。

另外，在所述RNA原位杂交、免疫组化染色和DNA原位杂交过程中，采用相同的显色剂显色，能有效的简化整个方法过程中的实验种类，使操作更为简单，实验稳定性更高。而对多个蛋白依次进行免疫组化染色过程中，采用相同的显色剂显色的方案，具有上述同样的效果，此外，还能使对多个蛋白的免疫组化实验结果相互之间具有更好的对比性，避免因为显色剂显色特性的不同，干扰实验结果的分析。

对于DNA原位杂交，优选采用TUNEL原位杂交。

在本发明的一个实施例中，所述RNA原位杂交步骤中采用环保型生物制片透明剂脱蜡。与目前常见的采用苯类试剂脱蜡的方案相比，本方案的脱蜡效果无明显差异，但是能够有效防止实验操作者苯类中毒，减少对实验操作者的危害。

所述环保型生物制片透明剂包括但不限于：TO型生物制片透明剂、康柏氏ETC环保组织透明剂（长沙康伯恩医疗科技有限公司）、Van-Clear环保透明剂（上海宏兹实业有限公司）、GS环保试剂（哈尔滨格林标本技术开发有限公司）、环保透明剂（珠海贝索生物技术有限公司）、环保型BT生物组织透明剂（佛山市南海钧镒医疗设备有限公司）、Y透明剂（籁盾公司）、环保透明剂（广州市秀威贸易有限公司）、竹叶提取物（四川自贡雷扁村村委会）、西奈山环保组织透明液（杭州西奈山生物科技有限公司）。

在本发明的一个实施例中，在所述依次进行RNA原位杂交、免疫组化染色和DNA原位杂交之前还包括一验证组织芯片质量的步骤。该步骤可采用上述预实验中所述步骤A3的任一种方法。

经本发明人多次实验验证发现，待检测组织芯片按上述方法进行一次上述免疫组化染色实验后，或按上述方法进行一次RNA原位杂交实验后，在上述第一次实验中未发生脱片的，可按上述方案至少重复进行9次显色-脱色实验，且不再发生脱片。上述显色-脱色实验可为按上述条件依次进行的RNA原位杂交实验、免疫组化染色实验、DNA原位杂交实验的总次数。

以下本发明通过数个具体实施例，进一步说明本发明所记载技术方案的技术效果及优越性。

在本发明的一个具体实施例中，对同一组织芯片依次进行mRNA原位杂交实验、单色多重免疫组化染色实验和TUNEL原位杂交染色实验，该实验的技术流程图如图1所示。具体步骤如下。

一、mRNA原位杂交实验。

1、组织芯片置于TO型生物制片透明剂中脱蜡3遍，10分钟/遍；100%乙醇水化2遍，5分钟/遍；95%乙醇水化1遍，5分钟；90%乙醇水化1遍，5分钟；70%乙醇水化1遍，5分钟；其中，梯度乙醇用DEPC水配制。

2、TBST（DEPC处理水配制，含0.1% 吐温-20）洗3遍，5分钟/遍。

3、组织芯片置0.2N HCl（DEPC处理水配制）中酸处理，室温孵育15分钟。

4、1×蛋白酶 K处理组织芯片消化碱性蛋白，37℃孵育30分钟。

5、TBST洗3遍，5分钟/遍；终止酶反应。

6、组织芯片置于已预热20分钟的表位抗原修复蒸锅进行分子交联解链25分钟，然后自然冷却至室温（约20分钟）。

7、TBST洗3遍，5分钟/遍。

8、4%多聚甲醛后固定组织，室温20分钟。

9、TBST洗3遍，5分钟/遍。

10、滴加预杂交液，55℃2小时，以封闭组织上探针的非特异性结合位点。

11、U6寡核苷酸探针（广州外显子生物公司）置85℃变性5分钟，37℃保持2分钟。

12、去除预杂交液，滴加含探针的杂交液（阴性对照滴加不含探针杂交液），加盖盖玻片，在ThermoBrite原位杂交仪中42℃杂交16小时。

13、5×SSC（DEPC处理水配制），37℃，洗10分钟；然后2×SSC（含50%去离子甲酰胺，DEPC处理水配制），37℃，洗3遍，5分钟/遍；再用TBST洗5分钟。

14、滴加封闭液（含1%羊血清，3%BSA，TBST配），37℃封闭1小时；以封闭组织上二抗的非特异性结合位点。

15、去除封闭液，滴加Anti-Dig-AP-Conjugate二抗（1:1000，TEST配制），37℃孵育2小时。

16、TBST洗3遍，5分钟/遍。

17、根据NBT-BCIP显色试剂盒（索莱宝）配制显色液，根据组织芯片大小滴加显色液，37℃避光孵育，显微镜观察出现蓝紫（黑）色阳性信号即可终止显色，自来水洗2-5分钟。

18、用甘油明胶封片。

19、显微镜下观察，并运用Leica LAS V4.2软件选采组织切片中阳性区域照相，或用全自动数字切片扫描系统对组织芯片进行高通量扫描照相分析。

需要说明的是，上述步骤3中，通过稀酸处理组织能使碱性蛋白变性，防止探针与碱性蛋白的静电结合导致非特异性染色。步骤4用于膜打孔，使核酸暴露，使探针易于结合至靶位点。步骤6中的分子交链解链步骤能够有效的对多聚甲醛固定后的组织中形成分子交联进行解链，便于探针的结合，同时保证组织芯片上各切片的组织结构，不易使切片脱片。步骤11能够有效破坏单链探针自身形成的二聚体或发卡结构。步骤17中，若进行核染可自选核固红或甲基绿，当RNA表达为胞核时也可选择不核染。

部分实验结果如图2所示。图2中，NBT-BCIP显蓝紫（黑）色阳性信号，RISH组A图（放大倍数400×）为a图（放大倍数200×）框中的放大区域，PC与NC为同批另张阳性对照与阴性对照组织切片染色（放大倍数为400×）。

二、单色多重免疫组化染色实验。

按下述步骤依次对Ab1-Ab6这6中抗体所对应的蛋白进行检测。

1、将组织芯片浸泡于预热至60℃～80℃双蒸水中，待甘明胶溶解，盖玻片自然脱落。

2、置组织芯片于二甲基甲酰胺中，50℃水浴浸泡5-10分钟，显微镜下检查，待蓝紫（黑）色阳性信号完全褪色；1×PBS洗3遍，共15分钟。

3、组织芯片置于预热20分钟的抗原修复液中，再置于表位抗原修复蒸锅中持续25分钟，自然冷却至室温（约20分钟）；然后1× PBS洗3遍，共15分钟。

4、组织芯片置于3%H₂O₂（1×PBS配制）30分钟；以封闭内源性过氧化氢酶造成的非特异性背景染色；然后1×PBS洗3遍，共15分钟。

5、用一抗稀释液适度稀释一抗加到组织芯片上，即先做免疫组化染色第一轮的一抗孵育。4℃湿盒过夜；1×PBS洗3遍，共15分钟。

6、V9000（或PV9003）试剂盒（中杉金桥）的试剂一加到组织芯片上(二抗孵育)，室温20分钟；1×PBS洗3遍，共15分钟；PV9000（或PV9003）试剂盒的试剂二再加到组织芯片上，室温30分钟；1×PBS洗3遍，共15分钟；（Streptavidin-HRP根据不同公司抗体说明书决定二抗孵育的时间和温度）。

7、按试剂盒说明配制AEC显色液（中杉金桥），加到组织芯片上，室温避光孵育，显微镜下观察（视抗体显色红色阳性信号，决定终止显色时间，5～20分钟）。自来水洗5-10分钟终止显色。

8、组织芯片置于苏木素液中核染，室温5～8秒，自来水洗5-10分钟终止显色。

9、用明胶甘油封片。

10、显微镜下观察，在组织芯片上运用Leica LAS V4.2软件选采组织切片中阳性区域照相，或用全自动数字切片扫描系统对组织芯片进行高通量扫描照相分析。

以上完成第一轮免疫组化染色，更换实验过程中所使用的一抗、二抗，按上述1-10步骤进行后续5轮的免疫组化染色实验。其中，后续5轮中，第2步因为需要脱色的对象与第1轮不同，第2步需进行适应性调整，具体可为：置组织芯片于80%乙醇中浸泡，显微镜下检查，红色阳性信号需完全消失，然后1×PBS洗3遍，共15分钟。

需要说明的是，步骤5中一抗的稀释度可通过预实验获得，所述预实验的具体步骤方法可采用上述的预实验方法进行。

其中，部分实验结果如图3所示。图3中AEC显红色阳性信号，Ab1-Ab6为6种不同抗体染色，NC为同批次另张阴性对照组织切片染色（放大倍数均为200×）。注：Ab1：HIF-2a抗体，Ab2：LT-IgG-1（人肺癌组织来源IgG抗体1），Ab3：OS-IgG-2（人宫颈癌组织来源IgG抗体2），Ab4：IgG抗体；Ab5：CT-IgG-1（人结肠癌组织来源IgG抗体1），Ab6：MTC02抗体。

三、组织芯片上TUNEL原位杂交实验。

1、将组织芯片置于预热至60℃～80℃双蒸水中，待甘油明胶完全溶解，盖玻片自然脱落。

2、置组织芯片于80%乙醇中浸泡，然后显微镜下检查，待红色阳性信号完全褪色；1×PBS洗3遍，共15分钟。

3、组织芯片置于预热20分钟的表位抗原修复蒸锅，持续25分钟，自然冷却至室温（约20分钟）；1×PBS洗3遍，共15分钟。

4、内源性过氧化氢酶封闭：组织芯片置于3%H₂O₂ 20分钟；1×PBS洗3遍，共15分钟。

5、根据TUNEL试剂盒（南京凯基）说明书配制TdT酶反应液：45μL Equilibration buffer加入1μL Biotin-11-dUTP和4μL TdT Enzyme；根据组织芯片样本大小滴加TdT酶反应液产生连接反应，湿盒中37℃避光60分钟；1×PBS洗3遍，共15分钟；（Biotin-11-dUTP在TdT酶的催化下与断裂DNA片段的3’OH结合）

6、根据TUNEL试剂盒（南京凯基）说明书配制Streptavidin-HRP反应液：49.5μL 1×PBS加入0.5μL Streptavidin-HRP 湿盒中37℃避光反应30分钟；1×PBS洗3遍，共15分钟。

7、显色液按TUNEL试剂盒（南京凯基）说明书配制DAB新鲜混合试剂，加到组织芯片上，室温显色反应0.5-5分钟；1×PBS洗3遍，共15分钟。

8、组织芯片置于苏木素液中，室温5-8秒，自来水洗5-10分钟终止显色。

9、用明胶甘油封片。

10、显微镜下观察，在组织芯片上运用Leica LAS V4.2软件选采组织切片中阳性区域照相，或用全自动数字切片扫描系统对组织芯片进行高通量扫描照相分析。

部分实验结果如图4所示，图4示出了在同一组织芯片上进行1次RNA原位杂交、6次免疫组化重染后，再进行TUNEL原位杂交染色的部分结果。其中，NBT-BCIP显棕色阳性信号，TUNEL组A图（放大倍数400×）为a图（放大倍数100×）框中的放大区域，PC与NC为同批另张阳性对照与阴性对照的组织切片染色结果（放大倍数400×）。

如图1-4所示，本发明成功的对同一组织芯片进行了mRNA原位杂交实验、单色多重免疫组化染色实验和DNA原位杂交实验。

其中，在步骤二、三中的内源性过氧化氢酶封闭步骤可不用每一次都进行，只要之前进行过一次内源性过氧化氢酶封闭步骤，后续的免疫组化染色或DNA原位杂交实验中，均可不在进行此步骤。在步骤二、三中重复进行内源性过氧化氢酶封闭步骤，可有效保证每一次染色实验的背景值处于较低的水平。

另外，上述具体实施例中的二抗、显色剂和脱色剂，以及相关的实验步骤，均可能根据需要进行调整。

另外，本发明还提供了另外一个具体实施例，在该实施例中，具体比较了表位抗原修复蒸锅技术与微波抗原修复技术对免疫组化染色结果的影响。

在本具体实施例中，对相同来源的组织芯片，分别进行表位抗原修复蒸锅技术与微波抗原修复技术为基础的免疫组化染色实验。其中，表位抗原修复蒸锅技术为基础的免疫组化染色实验与上述具体实施例相同，微波抗原修复技术为基础的免疫组化染色实验具体为用微波抗原修复技术替换上述具体实施例中的表位抗原修复蒸锅修复步骤，具体为：组织芯片置于适量（约200mL）0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中，微波加热3分钟。然后每间隔2分钟加热20秒，持续加热15-20分钟（约6-7次），自然冷却到室温（约1小时），即完成抗原修复。在本具体实施例中，采用相同的抗原修复技术，对相同的蛋白，例如CD68或TAF1L，重复进行检测，部分结果如图5、6所示。

如图5所示，其示出了采用表位抗原修复蒸锅技术进行抗原修复的组织芯片进行7轮CD68检测的部分结果图。由图5可知，在第1至7轮中，各轮的染色结果比较相似，颜色相差不大；同时，比较第1至7轮免疫组化染色后的阳性细胞百分比，也可知悉，它们的比例差别也不大。

而如图6所示，其示出了采用微波抗原修复技术进行抗原修复的组织芯片进行5轮TAF1L检测的部分结果图。由图6可知，第1轮和第5轮中的染色结果差异较大，尤其表现在颜色深浅上；另外，通过比较第1轮和第5轮免疫组化染色后的阳性细胞百分比，也可知悉，它们的比例差别比较大。

以上，采用表位抗原修复蒸锅技术较微波修复技术，更适用于多重免疫组化染色，并且能够在多重实验中，更好的保证实验结果的一致性，能够对相同的样品获得更多的实验结果数据。

另外，本申请人还提供了另外一个具体实施例，在该实施例中，具体比较了表位抗原修复蒸锅技术与微波抗原修复技术对组织结构形态的影响。

在本实施例中，对相同来源的组织芯片，分别进行表位抗原修复蒸锅技术与微波抗原修复技术为基础的6次苏木精-伊红染色，其中，表位抗原修复蒸锅技术为基础的抗原修复步骤条件同上一具体实施例，微波抗原修复技术为基础的抗原修复步骤条件同上一具体实施例。具体实验结果如图7所示。其中，steamer修复表示为表位抗原修复蒸锅技术进行抗原修复。由图7可知，采用表位抗原修复蒸锅技术进行6次抗原修复的组织芯片的组织形态，在第6次染色后与第1次基本相同，而采用微波抗原修复技术进行6次抗原修复的组织芯片的组织形态，在第6次染色后的组织结构形态与第1次染色后的组织结构形态存在非常明显的区别，已经完全不能继续使用了。

以上，采用表位抗原修复蒸锅技术较微波修复技术，能够更好的在多次免疫组化后，保证组织结构的形态，对实验结果的干扰小，也使得更多次的免疫组化实验成为可能，能够对相同的样品获得更多的实验结果数据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。