用于检测样品中的目标成分的生物传感器的制作方法

本发明涉及用于检测生物样品中的目标成分的方法和生物传感器系统。

背景技术：

已经在文献中描述了包括磁毛细管阀门的微流体设备（Remco C. den Dulk, Kristiane A. Schmidt, Gwénola Sabatté, Susana Liébana, Menno W. J. Prins：“Magneto-capillary valve for integrated purification and enrichment of nucleic acids and proteins”，Lab Chip，2013，13，106）。在所述设备中，诸如核酸和蛋白质之类的目标成分结合到磁珠，其然后通过磁毛细管阀门被输送至相邻的腔室中。

技术实现要素：

基于该背景，本发明的目的是提供允许对样品中的目标成分的可替换的且优选地更加鲁棒的检测的手段。

该目的通过根据权利要求1的生物传感器系统和根据权利要求2的方法来解决。在从属权利要求中公开了优选实施例。

根据第一方面，本发明的实施例涉及用于检测样品中的目标成分的生物传感器系统，其中所述样品可以可能地包括可能干扰目标成分的检测的干扰成分。样品将典型地为生物来源的流体，例如血液、唾液或尿液的液滴。“目标成分”将典型地为诸如核酸或蛋白质之类的感兴趣的生物分子。类似地，“干扰成分”将典型地为偶尔或总是存在于相应样品中的分子，其中它们可能具有自然来源（例如身体物质）或人造来源（例如污染物）。该生物传感器系统包括以下组件：

– 第一腔室，其在下文中称为“纯化腔室”并且包括用于样品的引入的入口。

– 第二腔室，其在下文中称为“废物腔室”并且通过（第一）磁毛细管阀门连接到前述纯化腔室。

– 第一颗粒，其在下文中将称为“纯化颗粒”并且可以结合纯化腔室中的样品的干扰成分（如果存在的话）。

– 第二磁性颗粒，其在下文中将称为“检测颗粒”并且可以结合样品的目标成分（如果存在的话）。

生物传感器系统典型地被设计为用于小量流体（样品和试剂）的容纳和处理的微流体设备，其中所述设备典型地包括，除以上提到的组件之外，另外的腔室、通道、入口、出口、阀门和/或泵浦元件等。生物传感器系统可以特别地被设计为旨在用于生物样品中的目标成分的单个检测的一次性药筒。

“纯化颗粒”和“检测颗粒”可以包括永久磁性颗粒和/或可磁化颗粒，例如超顺磁珠。这些磁性颗粒的尺寸的范围典型地在3nm和50μm之间。

纯化颗粒与干扰成分之间和/或检测颗粒与目标成分之间的结合可以是物理结合（例如通过粘附）或优选地是化学结合（例如通过杂化或特异性共价结合）。

（第一）“阀门”一般为两个腔室或隔室之间的连接，物质以及特别地纯化颗粒（具有或没有经结合的干扰成分）可以通过该连接可控地移动。它为“磁毛细管阀门”，即设置在两个腔室之间并且磁性颗粒可以通过其由磁力移动的元件或组件。该磁毛细管阀门的中心区域典型地对被处理的流体是排斥的（例如是疏水的，如果处理含水液体的话）。邻近腔室的流体将因而不跨过阀门而混合，但是磁响应物质，例如磁珠，可以通过磁力的施加而被主动输送通过阀门。关于“磁毛细管阀门”的更多细节可以例如在WO2009083862、WO2010041174、WO2010070461、WO2010140128、WO2011007310、WO2011042828中、在文章“Magneto-capillary valve for integrated purification and enrichment of nucleic acids and proteins”（上文）中和在博士学位论文“Magneto-Capillary Valve for Integrated biological sample preparation”（R.C. den Dulk，ISBN：978-90-286-2487-7，2011）中找到。

根据第二方面，本发明的实施例涉及用于检测样品中的目标成分的方法，该样本可能包括可以干扰目标成分的检测的干扰成分，所述方法包括以下步骤：

– 向样品添加“纯化颗粒”，其可以结合干扰成分。

– 通过（第一）磁毛细管阀门将纯化颗粒（具有或没有经结合的干扰成分）从它们与邻近的样品一起容纳在其中的纯化腔室输送到废物腔室中。

– 向样品添加磁性“检测颗粒”，其可以结合目标成分。

– 检测结合到目标成分的检测颗粒。

生物传感器系统和方法基于相同的概念，即干扰成分通过在通过阀门的纯化颗粒的帮助下输送它们而从样品的移除。针对生物传感器系统描述的解释和实施例因而对于方法是类似有效的并且反之亦然。

生物传感器系统和方法具有以下优点：它们允许以高精度、可靠性和鲁棒性检测生物样品中的目标成分。这是因为可以可能地存在于样品中的干扰成分在将它们结合到纯化颗粒之后通过阀门被安全地移除。

在下文中，将描述各种优选实施例，其可以利用生物传感器系统和方法二者实现（即便仅针对其中的一个而详细地解释它们）。

在样品中可能出现和/或相关的干扰成分的类型取决于所述样品的来源、预处理步骤和旨在用于目标成分的检测的化验。在优选实施例中，纯化颗粒适于结合以下干扰成分（和/或其部分和/或聚合体）中的至少一个：蛋白质和/或其部分和/或聚合体（例如糖蛋白、白蛋白、IgG、IgM、C1Q、纤维蛋白、肽），特别地抗体，诸如人类抗物种抗体（例如HAMA）；脂质（例如甘油三酯）；核酸和/或其片段和/或聚合体（例如DNA、RNA、适体）；细胞（例如血细胞）和/或其部分（例如血红蛋白）；细菌；酶（例如蛋白酶）；可能交叉反应的与目标分析物有某种相似性的分子；药物；以及可能干扰免疫测定的其它成分。

在简单情况中，纯化颗粒可以是没有特定表面涂层等以用于干扰成分的特异性结合的珠体。实验示出，甚至这样的非特异性纯化颗粒由于干扰成分的一些非特异性结合而可能已经改进检测结果。然而，最优选地，纯化颗粒可以包括干扰成分可以结合到的或者它们可以以另一方式与其反应的以下表面分子或原子（和/或其部分和/或聚合体）中的至少一个：蛋白质和/或其部分和/或聚合体，特别地，特异性地结合到干扰成分的链霉亲和素和/或抗体；核酸和/或其片段和/或聚合体（例如DNA、RNA、适体）；酶（例如蛋白酶）；非特异性地结合到带相反电荷的干扰成分的带电荷的分子或原子；二氧化硅分子；金属原子，诸如金原子；可以与干扰因子反应以修改其性质而使得干扰程度降低的分子；与目标分析物有某种相似性的分子；具有针对可能干扰免疫测定的成分的亲和性的捕获分子。

在样品引入到纯化腔室中之前，纯化颗粒可以已经被添加到样品并且与其混合。

此外或可替换地，纯化颗粒的至少部分（优选地它们的全部）可以在样品引入到纯化腔室中之前被提供在所述腔室中或者可以在样品引入到纯化腔室中之前被提供在附加腔室中，该附加腔室被称为“纯化颗粒存储腔室”。纯化颗粒可以例如以干燥形式存储在那里直到它们被使用。

前述纯化颗粒存储腔室可以优选地经由（第二）阀门，特别地（第二）磁毛细管阀门，耦接到纯化腔室。这允许纯化颗粒在它们被要求在那里时（典型地在样品的引入之后）受控输送到纯化腔室中。在磁毛细管阀门和磁性纯化颗粒的情况下，相同的磁场生成器（例如可移动永磁体）可以可选地用于将纯化颗粒从它们的存储腔室移动到纯化腔室中并且此后（具有经结合的干扰成分）从纯化腔室移动到废物腔室中。

在本发明的另一实施例中，磁性检测颗粒在其引入到纯化腔室中之前被添加到样品并且与其混合。

此外或可替换地，磁性检测颗粒中的至少一些（优选地它们中的全部）可以在样品引入到纯化腔室中之前被提供在纯化腔室中，或者它们可以在样品引入到纯化腔室中之前被提供在分离的腔室中，该分离的腔室被称为“检测颗粒存储腔室”。检测颗粒可以例如以干燥形式存储在纯化或存储腔室中。

前述检测颗粒存储腔室优选地经由（第三）磁毛细管阀门耦接到纯化腔室。同样地，同一个磁性设备可以可选地用于磁性纯化颗粒和磁性检测颗粒通过相应磁毛细管阀门的移动。

纯化颗粒可以特别地为可以在用户或装置的控制之下主动移动的颗粒。纯化颗粒可以例如是可以通过磁性、电学、声学、热学和/或光学效应或构件移动的颗粒，其中这样的构件优选地由生物传感器系统所包括。

前述“声学构件”可以特别地包括声音生成器，例如可以利用其在包括纯化颗粒的介质中生成驻波的超声换能器。

上述“热学构件”可以特别地包括可以利用其在包括纯化颗粒的介质中生成局部温差的加热器和/或冷却器。

上述“光学构件”可以特别地包括可以利用其在包括纯化颗粒的介质中照射斑点的光源，诸如激光器或LED。

纯化颗粒可以特别地包括磁性颗粒，诸如可磁化珠体。磁性纯化颗粒可以通过磁性构件而可控地移动，例如通过诸如永磁体之类的磁场生成器而可控地移动。

此外或可替换地，纯化颗粒可以包括电学相互作用的颗粒，例如离子和/或具有电极化的颗粒（例如偶极子）。这样的电学相互作用的纯化颗粒可以通过电学力或电学构件可控地移动，该电学构件例如是电场生成器，诸如带电电极和/或根据介电泳的原理。

在本发明另外的实施例中，在纯化腔室的内表面和/或分离的“检测腔室”的内表面处提供至少一个“结合点”，其中具有经结合的目标成分的磁性检测颗粒可以结合在所述结合点处（典型地结合到结合部位或构成该点的分子）。表面特异性检测过程然后可以应用于所述经结合的检测颗粒的检测（因而允许所附着的目标成分的隐含检测）。这样的过程的示例是受抑全内反射（公开在例如WO 2008/115723 A1中，其通过引用合并到本文本中）或利用结合点处的例如楔状光学结构的“双折射检测”（参见例如WO 2009/125339 A2，其通过引用合并到本文本中）。其它示例包括单个珠体的光学检测（参见例如WO 2011/036634A1，其通过引用合并到本文本中）。

根据另一实施例，生物传感器系统包括经由（第四）磁毛细管阀门耦接到纯化腔室的“检测腔室”，所述（第四）磁毛细管阀门允许磁性检测颗粒从纯化腔室到所述检测腔室的输送。因此可以实现附加纯化步骤，即结合到检测颗粒的目标成分输送到检测腔室中，其中为了检测颗粒的摄取可以提供洁净的基质流体。

附图说明

本发明的这些和其它方面根据以下描述的实施例将是明显的并且将参照以下描述的实施例进行阐述。

在附图中：

图1示意性地图示了在纯化和检测过程之前的具有纯化腔室、废物腔室和检测颗粒存储腔室的生物传感器系统的实施例；

图2图示了样品到图1的系统的纯化腔室中的引入；

图3图示了具有经结合的干扰成分的纯化颗粒到图1的系统中的废物腔室中的输送；

图4图示了检测颗粒到图1的系统中的纯化腔室中的输送；

图5示意性地图示了另外包括检测腔室的生物传感器系统的另一实施例；

图6图示了具有经结合的目标成分的检测颗粒到图5的系统中的检测腔室中的输送；

图7示意性地图示了另外包括检测腔室和纯化颗粒存储腔室的生物传感器系统的另一实施例；

图8示意性地图示了磁性颗粒跨过磁毛细管阀门的输送。

通过100的整数倍区分的相似的一个或多个参考标号在图中指代相同或类似的组件。

具体实施方式

本发明的方案可以例如应用在利用可以通过磁力操纵的磁性颗粒的一般生物传感器化验中。在下文中，将关于诸如由申请人开发的Magnotech®生物传感器技术之类的示例性生物传感器技术来说明本发明的某些实施例。在该技术的一个应用中，在全血中进行测量。对该血液进行过滤以获取通过毛细作用填充一次性药筒的等离子体。磁性纳米颗粒以干燥形式集成在药筒中。当样品流体进入反应腔室时干燥的珠体开始再次溶解在流体中。

当测量大量患者的血液样品时，它们中的大多数与独立参考系统良好地相关。然而，一些样品可能显示出偏离行为。结果比人们基于参考结果将预期到的明显更高或更低。基于他们的调查，本发明的发明人料想到若干机制可能是这些未预期到的结果的根源：

– 由于血液样品中的干扰成分所致的磁性纳米颗粒的聚集。典型地这导致低得多的信号。

– 血液样品中的一些成分可能干扰孵化反应。

– 血液样品中的一些成分可能干扰结合反应（例如人类抗鼠抗体（HAMA）将磁性颗粒和传感器表面上的抗体结合在一起，甚至在没有目标分子存在时）。

在所有情况中，解决方案将是在不同化验步骤中消除干扰成分。这可以通过添加诸如鼠-IgG之类的清除剂来完成。然而，这些可能在化验中还具有其它影响（例如polyMAK和类风湿（Rheumatoid）因子示出导致假阳性的干扰）。因而在此提出另一解决方案，其包括两个方向：

A. 通过使用磁性分离将干扰成分从样品耗尽。在该方案中，在第一步骤中向样品流体添加第一类型的磁性纳米颗粒（“纯化颗粒”）。这些纯化颗粒可以涂覆有功能化层以从样品捕获任何干扰成分。在第二步骤中，这些纯化颗粒应当被移除并且由需要用于实际目标化验的第二类型的磁性纳米颗粒（“检测颗粒”）取代。

B. 利用洁净（缓冲）流体对样品的替换。在该方案中，在第一步骤中，向样品添加需要用于实际目标化验的第二类型的磁性纳米颗粒（检测颗粒）。然后允许一段时间以用于孵化，由此目标分析物被磁性纳米颗粒（检测颗粒，例如涂覆Ab）捕获。检测颗粒然后被输送到存在于在其中完成结合步骤的第二化验腔室（“检测腔室”）中的洁净化验流体。在该情况下，解决了结合步骤期间的潜在干扰（例如人类抗鼠（HAMA）相互作用的消除，由此珠体经由基于鼠的目标抗体而非特异性地（a-specifically）耦合到传感器表面）。

根据方案A）的实验的确示出在向药筒添加样品之前向样品添加（裸露的）磁珠改进聚集和相关。显然，已经裸露的珠体捕获干扰成分，否则该干扰成分将引致聚集或化验干扰。

图1示意性地示出到根据以上的一般概念的第一实施例的生物传感器系统100或药筒上的顶视图。生物传感器系统100包括衬底（典型地，透明材料，诸如玻璃或塑料），其中形成以下微流体组件：

– 可以在其中处理要分析的样品的“纯化腔室”110。在所示示例中，纯化腔室110包括其内表面之一上的一个或多个结合点BS。结合点BS包括具有经结合的目标成分的磁性检测颗粒可以结合到的结合部位。而且，纯化腔室110连接到包括通道和样品可以通过其被引入的外部注孔的入口113。类似地，它连接到包括具有外部注孔的通道的出口114，其中流体停止115被提供在相关联的通道中以防止样品的不期望的流出。另外，磁性纯化颗粒PP优选地以干燥形式存储在纯化腔室110中。

– 邻近于纯化腔室110定位的“废物腔室”120。废物腔室120包括指向纯化腔室110的镜面对称凸起112的凸起121，其中所述凸起经由疏水通道区段连接。因此（第一）磁毛细管阀门MCV1构成在纯化腔室110与废物腔室120之间。

– 可以在其中提供磁性检测颗粒DP的检测颗粒存储腔室130。该腔室连接到入口133和具有流体停止135的出口134。它可以在生物传感器系统的制造期间和/或在化验开始时通过入口133填充有磁性检测颗粒DP。另外，该存储腔室130包括指向纯化腔室110的镜面对称凸起111的凸起131。如以上解释的，另一磁毛细管阀门MCV3因而形成在检测颗粒存储腔室130与纯化腔室110之间。该图图示了检测化验的第一阶段，其中磁性纯化颗粒PP以干燥形式存储在纯化腔室110中并且其中检测颗粒存储腔室130已经填充有磁性检测颗粒DP。

图2图示了化验的下一步骤，其中包括目标成分TC（例如核酸）和（可能地）干扰成分IC的生物样品已经通过入口113被引入到纯化腔室110中。在孵化时间期间，干扰成分IC现在结合到磁性纯化颗粒PP。

图3图示了化验的随后阶段，其中磁性纯化颗粒PP（具有或没有经结合的干扰成分IC）通过第一磁毛细管阀门MVC1被主动输送到废物腔室120中。剩余样品因而基本上没有干扰成分IC。

图4图示了化验的最终步骤，其中磁性检测颗粒DP通过其它磁毛细管阀门MCV3被输送到它们可以在其中结合到目标成分TC的纯化腔室110中。具有经结合的目标成分的磁性检测颗粒然后进一步结合在纯化腔室110中的结合点BS处。该结合可以进而利用诸如受抑全内反射之类的适当的表面特异性检测过程（未示出）来检测。

图5示出到检测化验的第一阶段中的生物传感器系统200的第二实施例上的顶视图。如在第一实施例中那样，生物传感器系统200包括其中提供磁性纯化颗粒PP并且经由磁毛细管阀门MCV1连接到废物腔室220的纯化腔室210，以及经由另一磁毛细管阀门MCV3连接到纯化腔室210的检测颗粒存储腔室230。出于简化的目的，腔室的入口和出口未详细示出。

与第一实施例相比，提供经由另外的磁毛细管阀门MCV4耦接到纯化腔室210的附加检测腔室240。现在检测腔室240包括结合点BS。

化验的下一阶段类似于图2-4中图示的那些：样品到纯化腔室210中的引入、具有经结合的干扰成分IC的纯化颗粒PP到废物腔室220中的输送、检测颗粒DP从相应存储腔室230到纯化腔室中的添加。

然后，图6中图示的化验的最终步骤是不同的，因为具有或没有经结合的目标成分TC的磁性检测颗粒DP经由另外的磁毛细管阀门MCV4被磁性输送到检测腔室240中。在那里可以提供诸如缓冲液之类的洁净基质（例如通过打孔集成贮袋），并且具有经结合的目标成分TC的检测颗粒DP可以结合到结合点。

图7示意性地图示了生物传感器系统300的第三实施例。如第二生物传感器200那样，该第三系统包括纯化腔室310、经由第一磁毛细管阀门MCV1连接到纯化腔室的废物腔室320、经由另一磁毛细管阀门MCV3连接到纯化腔室的检测颗粒存储腔室330以及经由另外的磁毛细管阀门MCV4连接到纯化腔室的检测腔室340。

此外，提供“纯化颗粒存储腔室”350并且其经由附加的磁毛细管阀门MCV2耦接到纯化腔室310。在该生物传感器系统中的典型化验期间，执行以下步骤：

1. 要分析的样品到纯化腔室310中的引入。

2. 纯化颗粒PP从其存储腔室350经由相关联的磁毛细管阀门MCV2到纯化腔室310中的输送。

3. 纯化颗粒PP（具有或没有经结合的干扰成分IC）从纯化腔室310经由相关联的磁毛细管阀门MVC1到废物腔室320中的输送。

4. 检测颗粒DP从其存储腔室330经由相关联的磁毛细管阀门MCV3到纯化腔室310中的输送。

5. 检测颗粒DP（具有或没有经结合的目标成分TC）从纯化腔室310经由相关联的磁毛细管阀门MCV4到检测腔室340中的输送。

6. 具有经结合的目标成分TC的磁性检测颗粒DP到检测腔室340中的结合点BS的结合以及对这些经结合的颗粒/成分的检测。

生物传感器系统的所描述的实施例已经通过利用微毛细管阀门（MCV）实现。MCV技术的示意性图示在图8中示出。在这里，磁珠（例如磁性纯化颗粒PP）可以在主动移动的磁体M的帮助下在疏水屏障X之上从一个流体腔室（例如纯化腔室110）移动到下一个流体腔室（例如废物腔室120）。一般而言，MCV大致磁性地输送结合到磁珠的成分，从一个腔室通过疏水阀门到另一个腔室。关于该技术的更多细节例如公开在WO2009083862、WO2010041174、WO2010070461、WO2010140128、WO2011007310或WO2011042828中。

总结来说，已经描述了实现以下步骤中的至少一些的用于目标分子的检测的生物传感器系统的实施例：

（1）提供具有带有干扰成分的样品的第一腔室以及第二腔室，二者通过第一MCV彼此分离。

（2）在第一腔室中提供布置成捕获样品中的干扰成分的磁珠/颗粒。

（3）将第一磁性颗粒（结合到或不结合到干扰成分）从第一腔室磁性输送到第二腔室。

（4）提供功能化成捕获第一腔室中的目标成分的第二磁性颗粒。

可选地可以另外实现以下特征中的一个或多个：

– 第二磁珠可以存储在第三腔室中并且通过分离第一和第三腔室的第2MCV提供。

– 生物传感器还包括功能化成捕获目标成分或第二磁珠并且被提供在第一腔室的表面上或通过另外的MCV与第一腔室分离的另外的腔室的表面上的结合点。

所描述的实施例可以以各种方式修改和扩展。例如，取代于磁性纯化颗粒PP，可以例如通过电学、声学、热学和/或光学力或手段被可控地操纵/移动的其它颗粒也可以用作纯化颗粒。

此外或可替换地，连接不同隔室的阀门不需要是磁毛细管阀门，特别是如果非磁性纯化颗粒将被移动通过这些阀门的话。

虽然已经在附图和前述描述中详细图示和描述了本发明，但是这样的图示和描述要被视为是说明性或示例性而非限制性的；本发明不限于所公开的实施例。本领域技术人员在实践所要求保护的发明时，通过研究附图、公开内容和随附权利要求，可以理解和实现对所公开的实施例的其它变型。在权利要求中，词语“包括”不排除其它元件或步骤，并且不定冠词“一”或“一个”不排除多个。单个处理器或其它单元可以履行权利要求中叙述的若干项的功能。在相互不同的从属权利要求中叙述某些措施的仅有事实不指示这些措施的组合不能用于获益。计算机程序可以存储/分布在合适的介质上，诸如光学存储介质或固态介质，其与其它硬件一起供应或作为其部分，但是还可以以其它形式分布，诸如经由因特网或其它有线或无线电信系统。权利要求中的任何参考标记不应当解释为限制范围。