通过质谱成像表征样品的方法与流程

本发明涉及通过使用质谱成像表征样品的方法。更具体地，本发明提出通过质谱法获得的成像数据用于提取和测定与样品中一种或多种离子的分布相关的形态测定数据和/或纹理数据的用途。本发明还提出这种形态测定数据和/或纹理数据用于鉴定和/或选择样品中一种或多种目标分子的用途。

一般来说，本发明可用于其中样品或样品中的化合物的表征是有用的/必要的任何领域。例如，本发明可用于药学领域中用于在不同生物组织中鉴定分子标记物，或用于医学诊断的领域，从而鉴定样品中组织的类型和/或细胞的类型。此外，本发明可用于质量控制领域，以检查部分实际上具有期望的特性。

背景技术：

质谱法是一种广泛已知并且在化学和生物化学分析中用于检测和鉴定样品中的目标分子的技术。近年来，已经开发了通过质谱法的分子成像，这提供了直接在样品中观察目标分子的分布的可能性。质谱成像(MSI)集合了使用电离源的所有成像技术，这提供了定位来自样品的分子离子的可能性。可以提及多种电离源，如激光，离子，气体，液体，溶剂，等离子体(单独或组合的源)，微波，电子，它们可以用在成像模式中，如DESI(“解吸电喷雾电离”)，LAESI(“激光消融电喷雾电离”)，MALDI(“基质辅助激光解吸电离”)，SIMS(“次级离子质谱分析法”)，MALDESI(“基质辅助激光解吸电喷雾电离”)和LESA(“液体提取表面分析”)，ICP-MSI(电感耦合等离子体质谱成像)。

通过质谱法的成像目前主要用于生物组织的分析。事实上，可以利用MSI直接研究组织的分子组成或组织的切片的分子组成，而无需通过荧光标记且不具有任何放射性。此外，因为其特异性，MSI提供了在样品上直接辨别和鉴定所检测的离子的可能性。因此，现在通常利用MSI来研究或搜索目标生物样品中的内源性分子标记物。更具体地，通过将离子或其质量对电荷比(m/z)作为目标，可以直接分析已知分子的分布。也可以使用统计工具，尤其是ACP(主成分分析)、PLSA、T-检验、ANOVA或其它工具，以比较至少两个目标区域，并由此鉴定对于这些区域中的一个或另一个区域来说特异性的一种或多种分子(J.Stauber等,蛋白质组研究杂志(J Proteome Res),2008.7(3):p.969-78；D.Bonnel等,分析和生物分析化学(Anal Bioanal Chem),2011)。在样品的图像的光谱的分析中使用分割方法也是已知的，以根据所述样品的离子的强度将光谱分类。因此，根据所检测的组织学区域的分子强度属性(profile)，知道生物组织的表征(T.Alexandrov等,癌症研究和临床肿瘤学杂志(J Cancer Res ClinOncol),2012.139(1):p.85-95；T.Alexandrov等,蛋白质组学杂志(J Proteomics),2011.75(1):p.237-45)。于是可以根据组织的完整分子属性而不再仅根据少量标记物的光谱属性来将组织分类。

然而，所有MSI数据分析方法目前都基于与m/z比相关的强度值的研究。更具体地，在通过MSI获取样品的图像期间，利用来自电离源的束分析所述样品以在样品的每个点中记录对应于所检测的离子的平均光谱。所记录的数据的整体表现为具有每个记录值的坐标的矩阵，一种在一列上含有不同m/z比且在第二列中含有相应强度的光谱。随后，对于与特定化合物对应的特定离子(即，给定的m/z比)来说，该离子的强度的测定(或峰的面积的积分)提供了利用图像重建软件包，通过将具有记录坐标的峰的强度考虑在内并通过向每个点分派具有限定的颜色和/或颜色强度的像素，获得该离子的分布(并因此获得相应的化合物)的可能性。可选地，还已知如何将电离源散焦以在单次射击中分析全部或部分样品。然后利用位置检测器获得定位(Luxembourg等,分析化学(Anal.Chem)2004)。

然而，不能辨别具有相同属性或光谱特征的两种生物样品，即使它们显示出不同的组织和/或细胞构造。于是需要将通过MSI的分析与另一种用于分析样品的方法如染色(免疫组织化学，组织射线照相术等)组合，以例如鉴定在两种样品的组织构造中的差异。

技术实现要素：

本发明提出通过质谱法成像常规获得的样品的成像数据(即，位置，m/z比，强度)的用途，其中不再仅考虑与所述样品的离子相关的强度值，也考虑样品中所述离子的空间布置和表征所述空间布置的测量结果。

根据本发明，根据样品中一种或多种离子的分布形态和相关测量结果(形态测定数据)和/或在所述一种或多种离子的纹理上表征样品。与样品中所述离子的存在相关的形状和形状的布置提供了相对于来自光谱强度的信息获得另外的信息(表面，形状，体积，图案，重复，量，分散和来自该信息的值，例如它们的比率等)的可能性。于是可以根据所述样品中至少一种离子的形状和/或在这些形状的尺寸上和/或它们在样品中的布置上表征样品。根据本发明，因此可以区分具有相似或相同分子属性的两种样品。此外，可以在样品的形态测定数据和/或纹理数据的基础上鉴定样品，以例如通过将特定形状和/或纹理等作为目标来鉴定样品中的目标分子。更一般地，本发明提出样品中一种或多种离子的分布的形态测定和/或纹理的表征，以及这些形态测定和纹理数据与光谱成像数据的组合或取代光谱成像数据的用途。根据本发明，该表征可以与例如将强度考虑在内的本发明的成像数据处理方法组合，并且更一般来说，与样品的任何表征方法(包括通过光学、物理处理，通过着色等实现的表征方法)组合。

本发明的目的因此是通过质谱成像(MSI)表征样品的方法，根据所述方法，在形态测定和/或纹理方面，从与所述样品中的至少一种离子相关的成像数据表征所述离子的空间布置。

换句话说，从MSI数据测定和/或定量所述样品中的至少一种离子的空间布置，以鉴定形状、形状的布置、特别是测量结果，并且相应地通过这些形状测定和/或纹理特征表征样品中所述离子的分布。

本发明的目的还是用于鉴定样品中新目标分子的方法，根据所述方法

i)将与所述样品中的多种离子相关的多种形态测定和/或纹理跟与参考样品中的多种离子相关的形态测定和/或纹理数据比较；

ii)鉴定所述样品的至少一种特征性离子；

iii)鉴定与步骤ii)中鉴定的所述离子对应的分子。

本发明还提出通过质谱成像鉴定样品的方法，其中：

i)利用从若干参考样品获得的与多种参考离子相关的形态测定和/或纹理数据建立数据库或模型，所述形态测定和/或纹理数据代表所述参考样品中所述参考离子的空间布置；

ii)记录与待鉴定的样品中的至少一种离子相关的形态测定和/或纹理数据；

iii)将与待鉴定的样品的离子相关的形态测定和/或纹理数据跟与数据库或模型中含有的参考离子相关的形态测定和/或纹理数据比较。

本发明的另一个目的在于计算机可读的数据载体，所述数据载体包含指令，所述指令可以通过计算机执行并且适合于使计算机系统执行本发明的样品表征方法的至少一个步骤，和/或用于鉴定样品的方法的至少一个步骤，和/或用于鉴定样品中的目标分子的方法的至少一个步骤。

附图说明

图1：为两个样品(1A和1B)通过质谱成像获取的数据集的说明性实例，其中白色具有值0而黑色具有最大值；

图2：根据本发明的肺组织样品的质谱成像数据的形态表征的实例，其导致与健康组织(健康气道)相比较的病态肺组织(纤维化气道)的鉴定；

图3：通过将本发明的方法应用至两种纤维化组织的两种气道样品的质谱成像数据集，利用形态测定计数气道的实例；

图4：通过将根据本发明的方法从所述样品的成像数据获得的形态数据外推来分析和确定大鼠的气道的表面；

图5：通过质谱成像获得的在皮肤样品中两种离子的分布的图示和用于鉴定组织(例如，表皮和角质层)的所述离子在样品中的空间布置的表征；

图6：通过将本发明的方法应用至皮氏培养皿上的生物组织的切片中细胞的计数和分型，从来自所述生物组织切片的质谱成像的数据集获得的图案和纹理的示意性图示；

图7：用于靶离子的不同形态测定标准的示意性图示，所述不同形态测定标准可以用于辨别在样品A和B中的对于所述目标离子来说具有相同强度平均值而不能通过它们自身彼此区分的两个目标区域。对于给定离子的相同强度平均值来说，分布因此可以在对象的数目、对象的表面、在目标区域中的分散、形状、从一个对象到另一个对象的表面的变化性等方面变化；

图8：本发明的表征和/或鉴定方法的某些步骤的示意性图示，其导致样品中具有91.5895的m/z的离子的形态测定标准的提取：对分子图像进行分割以获得二值图像，对所述二值图像进行处理以表征所述离子在许多对象中和在所述对象的表面中的分布；

图9：来自在示出分布强度的分子图像处的718.505的m/z的分布的和提出所述m/z的分布表面差异的二值图像的参考组织(对照组织)和目标组织(经处理的组织)的比较。

具体实施方式

本发明的目的因此是通过质谱成像(MSI)表征样品的方法，根据所述方法，在形态测定和/或纹理方面，从与所述样品中的至少一种离子相关的成像数据表征所述离子的空间布置。根据本发明，样品中离子的分布不再根据强度来表征，而且还根据由该分布画出的形状/对象以及根据相关测量结果(表面、体积等)和/或在这些形状/对象在它们之间的布置上表征。于是可以容易地辨别虽然对于给定离子来说具有相同的平均强度，但具有与所述离子相关的不同形态测定和/或纹理特征的两种样品。

本发明的方法可以被应用于任何类型的样品，所述样品可以通过质谱法在真空(MALDI)中或在环境气氛(LAESI,DESI)中分析，不论它是有机或无机的，液体或固体。例如，本发明的方法特别适合于动物或植物来源的生物组织的表征。

“组织”一般是指来源相同且被分组在功能性组合体中以完成相同功能的一组细胞。在特定情况下，组织可以被理解为器官、器官片段或器官的特定区域，其可能组合细胞的若干组合体。例如，组织可以为在器官内的局部肿瘤。

在示例性实施方式中，样品可以在于一种或多种组织的组织学切片，对于所述样品来说，目标区域可能事先已通过染色和/或通过它们的分子特征进行表征。更一般地，本发明的方法可以用于进一步表征通过任何现有技术的方法事先鉴定的样品的所有或一部分目标区域。

本发明的方法还可以用于表征生物液体如血液、血浆、血清、唾液、脑脊髓液、尿等。

在液体样品的情况下，可以将其在表面上干燥以产生干燥样品的MS图像，然后利用所述方法表征该样品。另外，尤其可以利用据称在大气压下的MSI系统来分析液体或溶剂的表面。

本发明的方法还可以用于表征环境样品，如土壤、水、植物样品等。

在示例性实施方式中，本发明的方法被用于表征对象，如电子部件，生物材料，胶囊，高精密零件等。

“表征样品”是指将区别性/特定性质与所述样品关联，所述性质尤其使得能够将所述样品从其它样品中辨别/鉴定出来。

根据本发明，使用成像数据和更特别的光谱，以为给定离子确定其在所述样品中采取的空间布置。在有利情况下，更具体地使用与给定离子的m/z比特性相关的数据。在本发明的上下文中，表述“m/z比”或“质量对电荷比”指示阴离子的物理量特性，其中m表示所述离子的质量而z表示所述离子的价态。在质谱成像中，给定离子可以对应于若干m/z比。

离子或m/z比的“空间布置”或“分布”是指通过样品中所述离子或m/z比的存在绘出的一种或多种形状。

根据本发明，确定所研究的一种或多种离子的空间布置以将其与一种或多种形状、尺寸等关联。与样品中至少一种离子的存在相关的成像数据被用于限定代表样品中所述离子的分布的形态测定和/或纹理数据，而不依赖于与所述样品中所述离子相关的强度的变化。

有利地，用于表征样品中至少一种离子的空间布置的步骤使用形状识别和/或纹理分析方法以在不同的目标区域中分割所述离子的成像数据和/或绘出图案的轮廓。例如，使用数学形态学技术，如水分线技术(water divide line technique)，Hough变换，尤其是以其广义形状，灰色调的空间依赖性矩阵等。

“形态测定数据”或“形态测定特征”是指与以下相关的数据/特征：通过样品中有关离子(或与所述离子相关的m/z比)的存在形成的几何形状或图案，和/或它们的数学尺寸，例如表面、体积、直径、半径、长度、宽度、厚度等。在特定情况下，所述图案可以在于文字要素，如数字、字母、词汇等。

“纹理数据”或“纹理特征”是指与以下相关的数据/特征：样品中图案彼此的布置，例如复现图案的数目，距离，所述图案之间的分散等。

“参考样品”是指与目标样品具有相同的性质和/或来源的样品。例如，在目标受试者的生物组织的研究期间，参考样品在于来自对照受试者的具有相同性质的生物组织。

根据本发明，可以整体或分别地表征所述样品的一种或多种离子或m/z比的空间布置。因此，给定的图案可以与被同时考虑的若干m/z比的存在和分布关联。可选地，可以同时或按序对同一样品中的不同m/z比表征不同的图案。根据本发明，这些不同的m/z比可以代表相同的离子或不同的离子。

在一个实施方式中，本发明的方法包括用于获取成像数据的准备步骤，从所述准备步骤确定至少一种m/z比的形态测定和/或纹理特征。

本发明的方法可以利用任何已知质谱成像技术来应用，尤其是MALDI、LDI、DESI、LESA、LAESI(激光消融电喷雾电离)、DART(实时直接分析)、SIMS、JEDI(喷射解吸电喷雾电离)、LAMMA(激光微探针质量分析)、SMALDI(扫描微探针基质辅助激光解吸电离)成像，它们与不同类型的分析仪组合，例如TOF(飞行时间)、轨道阱、FTICR(傅里叶变换离子回旋共振)、四极杆(“简单或三重”)、ICP MS分析仪等。

在本发明的特别实施方式中，例如通过使用MALDI成像，可以直接在样品的离子图像上观察与至少一种离子相关的形态测定和/或纹理特征。更具体地，与所分析的离子相关的形态测定和/或纹理特征可以被生成为重现所述样品的图像，使得可以在其中观察它们的空间布置。当然，可以叠加样品的不同图像，以同时观察若干离子的数据，甚至通过其他分析方法如光学显微术、组织学染色等获得的组织学数据或其它数据。

在一个实施方式中，本发明的表征样品的方法包括以下步骤：

c)利用MSI获取样品中至少一种离子的数据；然后

d)根据形态测定和/或纹理特征，从与所述至少一种离子的位置相关的数据表征样品中所述至少一种离子的空间布置。

从目标样品中离子的空间布置，通过对所述样品来说特异性的形态测定和纹理特征来表征所述离子。相同的离子在另一种样品中可以具有不同的形态测定和纹理特征，即使两种样品的分子属性是相同的。

因此，本发明的方法提供了为样品中的离子获取另一水平的信息的可能性，其可以被单独考虑或与样品和/或相关离子的任何其它数据/特征组合考虑。例如，不仅可以同时或按序分析目标离子的形态测定和纹理特征，而且可以同时或按序分析全部或部分的光谱特性(质谱的峰的强度，信噪比(S/N)，峰面积等)。

有利地，本发明的方法提供了直接在样品的相同离子图像上同时观察所有这些数据/特征的可能性。

在另一实施方式中，本发明的用于表征样品的方法包括以下步骤：

e)将样品的成像数据分割成代表样品的分子强度属性的目标区域；并且

f)根据形态测定和/或纹理特征表征目标区域的分子属性的离子的空间布置。

步骤c)在于在相同样品中根据分子属性分割样品。每个目标区域对应于从样品的质谱获得的分子属性。不同光谱特性可以常规地用于获得所述样品的分子属性，尤其是质谱的峰的强度，信噪比(S/N)，峰面积等。

一旦样品中一个或多个目标区域被鉴定后，就对与选择的目标区域相关的成像数据进行处理，以表征所述选择的目标区域的离子的整体的空间布置。它们是目标区域中离子的整体的数据，所述数据被考虑在内并对所述数据进行分析以鉴定所述目标区域的特征性图案和纹理。同样地，根据本发明，可以从这些数据重建样品的数字图像，以直接在样品图像上观察结果。

根据本发明，步骤c)和d)的应用可以独立于步骤a)和b)，即，不应用步骤a)和b)。在另一个特别实施方式中，可以连续应用步骤a)和b)，然后是c)和d)，反之亦然，以在相关样品上的一种或多种相关离子的形态测定和纹理方面获得不同水平的信息。此外，可以将步骤d)应用于步骤c)中鉴定的若干或全部目标区域。

在本发明的另一个实施方式中，表征方法包括以下步骤：

e)制作包含来自所述样品中的多种离子的形态测定和/或纹理数据的数据库(DB)。

可选地，所述表征方法包括以下步骤：

f)生成包含所述样品中多种离子的形态测定和/或纹理数据的模型。

在本发明的上下文中，“多种”是指两种以上。

“模型”是指数据集，所述数据集在本发明的情况下具有来自样品的特性，尤其是强度数据、形态测定和/或纹理数据等，所述数据已被建模，尤其是为了限定所述数据之间的依赖性和/或关系，并且所述数据代表相关样品。至于“数据库”是指其中存储有原始数据集的基础(base)。

因此，可以获得数据集的组合体，即，对样品或样品类型来说特异性的图案、尺寸、布置等的组合体，或者模型。根据本发明，该数据库(DB)或该模型可以利用所述样品中至少一种离子的光谱MSI数据，和/或对所述样品来说特异性的物理化学、生理学和/或生物学数据来实现(步骤g)。例如，数据库(DB)或模型利用通过样品或相同样品的组织学、化学研究或其它研究获得的数据来实现，以限定不同的目标区域。

这种数据库(DB)或模型可以特别用于快速且以自动方式鉴定组织、组织的区域、细胞类型、组织的生理学条件例如健康或病态的、等等。此外，所述数据库或模型可以用于细胞鉴定和计数，或在生物样品中的编号。

本发明的目的还是通过质谱成像鉴定样品的方法，其中：

i)利用从若干参考样品获得的与至少一种参考离子相关的形态测定和/或纹理数据建立数据库或生成模型，所述形态测定和/或纹理数据代表所述参考样品中的所述至少一种参考离子的空间布置；

ii)记录与待鉴定样品中至少一种离子相关的形态测定和/或纹理数据(表面、体积、形状、图案、重复等)；

iii)将步骤ii)的形态测定和/或纹理数据跟步骤i)的数据库或模型中含有的形态测定和/或纹理数据比较。

根据本发明，在步骤ii)中，将离子对应于来自数据库或来自模型的离子进行分析。有利地，所述数据库或模型包含与多种参考离子相关或无关的形态测定和/或纹理数据。

上面结合表征样品的方法所描述的特性和定义的整体在细节上作必要的修改后被应用至所述鉴定方法。

有利地，对于每种参考样品来说，对若干离子建立形态和纹理数据的集以尽可能可靠地表征每种参考样品。

根据本发明，在步骤iii)中，在不同的参考数据集和待鉴定的样品的数据集之间继续进行相似性和/或差异的分析，以选择具有相似或相同形态测定特征的一种或多种参考样品，并由此鉴定样品。

本发明的方法例如可以提供鉴定生物组织的性质和/或来源、细胞类型、疾病的发展阶段等的可能性。

本发明的目的还是用于鉴定样品中的目标分子的方法，根据所述方法

i)将与所述样品中多种离子相关的形态测定和/或纹理数据跟与参考样品中多种离子相关的形态测定和/或纹理数据比较；

ii)鉴定样品的至少一种特征性离子，所述特征性离子有利地不存在于参考样品中；

iii)鉴定与前述步骤中鉴定的所述离子对应的分子。

这种方法提供了发现和鉴定目标样品中的新分子的可能性。

在实施方式中，用于鉴定目标样品中的新目标分子的方法事先包括用于获取对所述样品来说特异性的MSI数据并通过形态测定和/或纹理特征表征一种或多种离子的分布的步骤。

上面结合表征样品的方法所描述的特性和定义的整体在细节上作必要的修改后被应用至用于鉴定分子的本方法。

根据本发明的该实施方式，样品的性质是已知的并且期望鉴定对所述样品来说特异性的一种或多种标记物，即，在参考样品中不存在的那些标记物，或者相对于那些在参考样品中存在的标记物表现出不同的形态测定和/或纹理特征的标记物(图7)。对于给定离子来说被考虑的形态测定特征可以为例如对象的数目，对象的表面的平均值，分散，形状，表面的变化性等。因此优先使用与目标样品具有相同性质和/或相同类型的参考样品。

有利地，步骤i)可以通过查询编译参考样品的多种参考数据集的数据库(DB)来应用，或通过将样品的数据跟编译参考样品的多种参考数据集的模型比较来应用。

一旦目标样品的区别性形态测定和/或纹理数据被鉴定后，则将相应的一种或多种离子与其关联，从而回到与每种离子相关的分子。

该方法在制药或医学领域中，尤其是对于鉴定新型生物标记物来说是特别有用的。

本发明的目的还是计算机可读的数据介质，所述数据介质包含用于计算机的可执行指令，所述指令适合于使计算机系统执行本发明的用于鉴定样品的方法的至少一个步骤，和/或本发明的用于鉴定样品或样品中的目标分子的方法的至少一个步骤。

因此，本发明提出如下计算机程序，所述计算机程序包含当所述程序在计算机上执行时用于执行上述全部或部分步骤的程序代码指令。

有利地，所述计算机程序包含至少用于执行表征目标样品中一种或多种离子的空间布置的步骤的程序代码指令。

有利地，本发明的计算机可读的数据介质或程序包含数据库或模型，所述数据库或模型包含至少一种样品中的至少一种离子、优选多种样品的多种离子的形态测定和/或纹理数据。

标记物的搜索

本发明的方法可以用于鉴定标记物，尤其是分子标记物。事实上，在生物样品的情况下，可以鉴定在两种条件(例如，病态的相比于健康的，经处理的相比于载体，暴露的相比于未暴露的，等等)之间存在的形态变化。尤其，根据本发明，可以更特别地研究在例如通过样品的结构的宏观和/或微观研究事先鉴定的目标区域中特异性存在的离子。

一旦获得形态测定和/或纹理特征后，并且如果在统计分析后，与所研究的离子相关的形状被认为显著不同，则以常规方式回到相关的一种或多种目标分子量是足够的。在查询专门数据库后，可以鉴定相应的一种或多种分子。为此，可以使用微分(differential)统计检验，从而基于分子分布要素的形态而不仅基于强度。尤其可以使用Fischer检验，z检验，Student检验，Welch检验，成对Student检验，ANOVA，Dunett检验，Tukey检验，Kruskal-Wallis检验，Wilcoxon-Mann-Whitney检验，Wilcoxon符号秩检验，MANOVA等。

过滤和分子分类

本发明的方法可以用于分子过滤目的。

例如，可以以或不以任意方式选择特定形态测定(例如，最小表面积的X mm2的星形)以进行样品中的分子过滤。因此，仅选择进入所限定的一个或多个标准的离子。然后可以鉴定与所寻找的那种分子具有相同的形状影响的分子。

这种过滤也可以允许样品的分类。因此，利用本发明的方法，基于关于强度和形状的信息可以获得相似性分数。可以自动在样品例如生物组织中认出例如为生理状况特征性的给定形状的存在。于是变得可以在与仅基于强度标准的分数相比更精确和可靠的分数的基础上确立分类，所述强度标准与不管所选方案如何都被保留的形态测定和纹理特征不同，其本身可以根据样品的制备(基质的沉积、干燥时间、冷冻、组织的类型等)而变化。

根据本发明，可以有利地构建数据库(DB)或模型，所述数据库(DB)或模型编译来自相同种群的若干样品的规格，所述若干样品例如为来自相同生物组织或来自相同来源/性质的生物组织的若干样品。从这种数据库中，或从这种模型中，容易鉴定相同种群的新样品或确定无疑地鉴定种群中的样品。

例如，可以相对于健康肺组织的样品表征纤维化的肺组织样品。图2更特别地示出从为健康肺组织样品和纤维化肺组织样品获得的成像数据集的形态测定表征获得的结果。根据本发明的方法，在椭圆形中鉴定两种形态测定，其中一种在短轴和长轴之间的比率倾向于1(纤维化组织)。这些形态测定特征的使用提供了分别表征两种形状的健康(椭圆类型1)和纤维化(椭圆类型2)的气道的可能性。

相似地，可以表征无机样品，例如电子部件，汽车零件或其它部件，尤其是为了进行质量控制。

细胞计数和形态测定分选

本发明的方法也可以用在细胞或细菌计数的领域中，尤其是在环境或健康评价的范围内。出于该目的，可以在质谱成像中选择细胞壁的特异性分子(例如脂类)，以提高待计数的对象。

利用本发明的方法，利用分子因子分离形状，虽然到目前为止，这是利用光学信号，尤其是利用光学显微术或流式细胞术来实现的。本发明提供了超过利用光学信号获得的检测灵敏度限制的可能性，以及具有精确性(较少假阳性事件)的工作速度，并同时提高了所分析的参数的数目。根据本发明，细胞可以在它们的形态的基础上编号和认出，同时指示分子属性如所鉴定的细胞的代谢活性。因此可以将多种细胞、生物学或组织学类型和它们的生理学活性编号。

图3描述了在为两种纤维化组织的气道的样品获得的成像数据集上通过形态测定进行的自动计数。椭圆形的自动检测提供了在与相邻组织学染色没有任何关系的情况下鉴定并编号目标组织学结构(此处为气道)的可能性。

形态测定的动力学研究

本发明的方法也可以用于形状的动力学研究，尤其是用于追踪样品中目标要素(分子、离子、m/z)的形态测定(形状、表面、体积……)的时间依赖性变化。尤其可以显示形态测定的变化，例如目标区域随着时间的扩大或缩小。

也可以设想生物样品中形状的时间依赖性变化的阶段，其与生物样品的阶段的其它研究一致。例如，可以通过本发明的方法获得取决于一种或多种目标质量的随着时间变化的表面曲线。如果鉴定到特定的稳定期或阶段(形态测定变化、稳定期、形状的波动)，则它们可以潜在地与生物样品的已知阶段(例如，致癌组织的等级的变化)相关联。

图4示出了本发明的方法在纤维化组织中的气道的收缩的时间依赖性变化的研究中的应用。如图所示，可以利用本发明的方法来确定气道的随着时间变化的表面积并且因此追踪纤维化对气道的收缩的影响。

细胞或组织分型

本发明的方法可以用于鉴定植物或动物生物样品中的细胞类型或组织亚结构。通过各种细胞的对于它们来说特异性的形态测定，可以进行该细胞分型。因此，取决于所获得的细胞形态测定，可以确定一种或多种样品中含有的一种或多种细胞类型。

近年来，仪器发展已经提供了将MALDI成像的空间分辨率降低到低于10μm的可能性。至于SIMS技术，其提供了通常获得低于1μm的分辨率的可能性。考虑到细胞的平均尺寸为10-15μm，可以认为质谱成像获得了使得它们在分子数据集中被分辨的细胞分辨率。

图5示出了本发明的方法在皮肤组织切片上的组织分型的范围内在没有任何组织学相关性的情况下的应用。组织的区域(角质层和表皮)通过它们在MSI获取(MSI acquisition)后获得的特定形态测定进行鉴定。

此外，图6示意性示出了本发明的方法在直接在生物样品上/中编号和细胞分型的范围内在没有任何组织学相关性的情况下的应用。样品(组织、细胞溶液或培养物)的细胞借助于它们在MSI获取后获得的特定形态测定进行分型。

实施例

现在将借助于具体实施例更详细地描述本发明。这些实施例是作为说明给出的并且绝不作为本发明的限制。

实施例1：通过将光谱和空间信息组合来表征样品或目标区域的程序。

本实施例的目的是示出可能来自为样品获取的同一成像数据集的信息片的差异，这取决于是仅仅考虑了所述样品中与给定m/z比的强度相关的数据，还是考虑了与该m/z比相关的形态测定和纹理特征。

一旦获取样品的质谱成像数据(位置、m/z比、强度)后，则通过任何已知方法，例如根据以下步骤继续进行：

1/加载从成像数据获得的图像；

2/例如通过使用Otsu法，为将图像二值化而确定阈值；

3/通过未经优化的算法将对象标记并计数；

4/在变量中恢复非零位置的数目；

5/在一个变量中恢复对象或图像的像素的数目；

6/在一个变量中计算平均强度；

7/试验以确定对象是否至少具有某些形状性质。

以简单化的方式，步骤3可以通过以下算法来应用：

“只要图像未被完全覆盖：

一行一行地覆盖图像

如果遇到非零像素(或非零像素属于对象)

覆盖其邻居和连续8个相邻的邻居，以将对象的像素设置为0增加对象计数器

邻居覆盖的结束

非零像素的结束

行覆盖的结束

算法的结束”

试验步骤7可以例如通过制作含有具有一种或多种待测性质的结构元素(SE)的开口(侵蚀ε，随后扩张δ)来应用。如果通过SE的开口的像素的添加是非零的，那么该图像/区域具有该性质。

开口：

侵蚀：

扩张：

结果

将上述步骤应用至为各具有6个像素的长度并在这6个像素上具有相同的平均强度的2个片段(图1)常规获取的成像数据，所述6个像素是连续的(图1A)或具有碎片(图1B)。

虽然考虑单独的强度并不提供区分这两个片段的可能性，但是通过本发明的方法获得的形态和纹理表征提供了示出在这两个片段之间的差异的可能性(表1)。

表1：来自成像数据的特性

实施例2：用于鉴定目标峰和来自形态测定数据的相关生物标记物的程序

材料和方法

动物：

将5个大鼠肺用于该研究。三个来自利用博来霉素(ApolloScientific公司,UK)通过气道(口咽吸入途径)以1mg/kg的剂量处理7天的大鼠，两个来自以相似的方式接受盐溶液处理相同的时间段的动物。所有大鼠为Sprague Dawley,Crl:CD(SD)雄性大鼠。两组在实验开始后22天处死。利用琼脂糖使肺膨胀，设置在具有10％甲醛的中性缓冲溶液中，并冰冻至-80℃。该动物实验符合1986年的动物(科学程序)法(Animals(Scientific Procedures)Act of 1986)。

用于获取质谱(MS)图像的制备物：

为获取图像，从Delta Technologies公司(Loveland,USA)购买ITO玻片并利用9-氨基吖啶(9AA)将其涂布。

通过使用microm HM560低温恒温器(赛默科技(Thermo Scientific)公司，德国)在-35℃下获得厚12μm的新鲜组织切片并将其放置在ITO玻片上。此外，将10μm厚的用药物掺杂的大鼠肾的匀浆物的切片沉积在相同玻片上以用作用于评估重复性和可变性的质量控制。一小时后从低温恒温器取出玻片，然后干燥20分钟，接着最终储存在-80℃下直到使用。

使用的基质为5mg/mL的9AA在MeOH/H₂O(4:1v:v)溶剂中的溶液；利用自动沉积装置Suncollect(SunChrom GmbH公司,Friedrichsdorf,德国)以10个连续层的方式将其沉积。以10μL/min的流速施加第一层，以20μL/min的流速施加第二层，并且以30μL/min的流速施加剩下的层。

MS图像的获取：

将装配有以80％的输出能量和1000Hz的重复率使用的SmartBeam II激光器的质谱仪MALDI-FTICR(7T Solarix,BrukerDaltonics公司,Brême,德国)用于对于在100和1000之间的m/z以30μm的空间分辨率在负模式中获取呈“全扫描”模式的质量过滤器。各质谱对应于在相同位置的500个连续激光射击的积累。通过使用9AA基质以及在200和900的m/z之间的磷脂质进行内部校准。通过使用FTMS Control 2.0和FlexImaging 4.0软件包(BrukerDaltonics,Brême,德国)来控制质谱仪。

被选择用于获取的区域为肺气道，因为博来霉素应该在其中引起变化。

峰的检测：

从超过阈值的条件转换的平均光谱的最大值被认为是峰。所使用的转换为减去没有零值的信号的中值，除以来自没有零值的信号的中值的绝对偏差，乘以1.4826。这给出在各点中信噪比的近似值。在噪点或多或少遵从正态分布且实际信号在平均光谱中以小于合计测量结果的一半存在的观点下，实现零值的抑制，因为信号似乎通过FTMSControl 2.0通过破坏性小波而经历了压缩。测试了接近噪点的其它方式(例如，局部完成的相同测量，或从一个峰到假设代表它的高斯分布的距离)，但对低阈值没有给出更好的结果。对于该研究来说保持的阈值为1，以具有尽可能少的假阴性警报并排除尽可能多的噪点。

输出的图像：

对于每个对应于潜在生物标记物的检测到的峰来说，并且对于每个成像区域来说，将峰窗口中最大强度的图像在具有8位的深度的灰度的范围中拉伸，然后在没有任何压缩的情况下输出为JPEG格式。选择仅使用单通道以便于结果的目检。获得了在12个区域(在条件1中6个，且在条件2中6个)上的待成像的约2000个离子。

形态表征：

对于各图像：

为了从图像除去噪点，通过使用尺寸为2x 2的结构元素以灰度在图像上制造开口，随后使用相同的结构元素进行闭合：O为灰度的原始图像，在我们的情况下B₁＝B₂＝B，结构元素，值的布尔值在右下角中在中心变化，缺少的值通过复制最近的行或列获得。

然后通过应用Otsu法将图像二值化(在我们的情况下具有单一阈值)：对于含有N个像素、L个灰度且n_i为采取灰度i值的像素的数目的图像来说，的最大值，其中其中ω₁＝1-ω₀，

在此之前或之后，计算像素图像的表面积；

然后，通过使用用于以4连通方式如Rosenfeld和Pfaltz(1996)中描述的那样生成标记图像的标签的整体的基数，对在二值化图像中的对象的数目进行计数。

最后，确立每单位表面的对象的平均表面积。

比较：

在两种条件下进行两个Welch t检验，一种基于每单位表面的对象的数目，另一种基于每单位表面的对象的平均表面积。保留Welch t检验，因为其很好地适用于小尺寸的非配对样品，且不确定两个总体的差异是相等的。否则能够使用Mann-Whitney-Wilcoxon检验。

在使用形态测定标准的基础上将200个生物标记物鉴定为在对照条件和未处理条件之间显著不同的，其中特定生物标记物仅通过使用形态测定标准来鉴定。

如在图9中示出的，能够鉴定细胞凋亡中涉及的膜成分(m/z718.505)，其仅通过考虑强度是不可检测的(NS：不显著；*：显著差异)。

建模：

在经处理条件的潜在的鉴定的生物标记物的基础上制作数学模型。将该模型用于探索目的以在提取的形态测定特征的基础上对试验样品进行分类。

可以对以下继续进行本研究：

-将数据标准化；

-进行峰鉴定以将分子与峰关联；

-进行生物学解读；

-例如通过使用云平台进行分类/机器学习。

实施例3：其它应用

可以设想非常多的应用，并且尤其可以通过使用实施例1或实施例2中描述的步骤来应用。例如，如以上所讨论的，本发明可以用在医学和制药领域，以鉴定新型生物标记物，用于分子过滤和分类、细胞和形态测定计数、疾病或治疗的随时间变化的发展的研究、细胞或组织分型等。根据本发明，也可以从样品中离子的分布表面和/或体积相对或绝对地定量所述样品中的所述离子。当然，本发明可用于其它领域例如质量控制、艺术、比较的和自动的对象分析，材料的组成的研究等。