用于光学检测流体样品中的纳米粒子的方法和设备与流程
本发明涉及用于光学检测流体样品(例如液体样品或空气)中的纳米粒子的方法和设备，通常用于30nm至200nm的纳米粒子。该方法更具体地用于检测存在于水生环境中的游离病毒，特别是用于对海水或河水中的病毒的计数和表征。
背景技术：
病毒是尺寸通常在30nm和200nm之间的纳米物体。它们通常特定针对一定的宿主细胞，因此它们为一个物种(甚至是该物种的变种或菌株)所特有。仅自1989年以来，得益于挪威团队的工作(见k.j.
根据水生生态系统、季节甚至采样深度，游离病毒的浓度通常在每毫升106至109个粒子之间。有许多已知的方法用于对水生培养基中的病毒进行表征和计数。
例如，我们知道透射电子显微镜(或tem)，其允许我们以非常好的精度对病毒进行计数并对其形态进行表征。然而，这种破坏性技术需要庞大而昂贵的设备。
在对水生环境中的病毒表征的光学技术中，我们知道荧光显微镜，其在用荧光标记物将核酸染色后，使得可以对游离病毒进行计数(参见例如，bettarel等,“acomparisonofmethodsforcountingvirusesinaquaticsystems”,applenvironmicrobiol,66:2283–2289(2000)。然而，这种技术需要对标记物进行固定的阶段，这被证明对于分子生化分析的后期阶段是麻烦的。
由于病毒表现得像电介质纳米粒子，其折射率在可见光谱中接近1.5，与水的折射率(1.33)明显不同，同样也已知如何检测它们的存在并通过确定这些纳米粒子在入射电磁场中引起的扰动来潜在对它们进行表征。
因此，已经描述了基于由于病毒粒子悬浮引起的光散射的方法(参见例如wmbalch等,“lightscatteringbyviralsuspensions”,limnoloceanogr,45:492–498(2000))。然而，这些方法由于检测灵敏度差而仅限于对病毒的均质溶液的分析，并且它们仅能够确定给定尺寸和形状的病毒浓度；因此，它们不适合于识别多样性病毒，而在自然环境中通常是多样性病毒。
为了提高灵敏度，已将干涉测量方法用于检测液体环境中的病毒。因此，mitra等人的文章(“real-timeopticaldetectionofsinglehumanandbacterialvirusesbasedondark-fieldinterferometry”,biosensbioelectron.2012january15；31(1):499–504)描述了一种用于观察纳米流体导管中的一个接一个地运动的纳米粒子干涉检测方法。被入射激光束照射的纳米粒子所散射的低光强度被高强度的基准光束放大。此外，结构化照明消除了由导管接口上的寄生反射(在黑色背景上的检测)引起的噪声。然而，除了使用相干光源(激光)之外，这种技术还需要复杂的纳米流体布局。
本发明提出了一种用于检测在诸如水的流体中运动的纳米粒子的干涉技术，其以空间上不相干的照射来操作，避免了对激光的需求。此外，所描述的技术不需要针对被检查的流体的特定布局。然而，本说明书中描述的技术具有非常好的灵敏度，并且可以检测直径小至几十纳米的纳米粒子。
技术实现要素：
根据第一方面，本发明涉及一种用于通过透射以光学检测在流体样品中运动的纳米粒子的设备，包括：
-光源，用于发射用于照射样品的空间非相干光束；
-包括显微镜物镜的成像光学系统；
-二维光学检测器，所述二维光学检测器包括通过所述成像光学系统与所述显微镜物镜的物焦平面共轭的检测平面，并且允许获取所述样品的分析体积的一系列图像，每个图像通过入射到所述样品上的所述照射光束和在不到1毫秒的预设时间段内由所述分析体积中的每个纳米粒子散射的光束之间的光学干涉产生；
-图像处理装置，所述图像处理装置允许取得所述一系列图像的平均值，并且从每个图像中减去所述平均值，从而针对所述分析体积中的每个纳米粒子确定所述散射光束的振幅。
检测设备用于检测纳米粒子，即直径小于几百纳米的粒子，更具体地，直径在30nm和200nm之间的纳米粒子。
如此描述的设备，非常容易实现并且无需将样品以特定形式放置，使得，由于当纳米粒子被“冻结”时在很短的时间内，通过由光源发射的信号和由每个纳米粒子散射的信号之间的干涉所得到的散射信号的放大，可以检测直径小至几十纳米的纳米粒子。
在入射照明光束和由每个纳米粒子散射的光束之间直接产生的干涉不需要基准波和照射样品以用于形成干涉的波之间的初始物理分离，例如使用分隔器的干涉仪。
通过空间不相干光束的照射使得可以将空间相干性限制于“体素”(voxel)的水平，“体素”的截面与显微镜物镜的数值孔径成反比。因此，干涉只能在纳米粒子所在的体素内部进行；因此干涉在几乎同心的球面波之间发生。
根据一个或多个样品实施方式，所述光源是脉冲源，使得能够顺序地发射所述预设时间段的光脉冲，并且所述设备还包括将所述二维光学检测器和所述脉冲光源同步以获取所述一系列图像的装置。所使用的二维检测器可以是以100hz操作的标准相机。
或者，可以使用连续的光源和高速摄像机，通常具有每秒多于几千个图像的频率。
光源是空间不相干的光源，例如led，并且能够避免在检测区域中可能产生寄生背景的任何斑点效应。
根据一个或多个样品实施方式，所使用的显微镜物镜具有大于或等于1的数值孔径，从而增加由每个纳米粒子散射的光信号的强度，并且使得能够检测较小直径的纳米粒子。
根据第二方面，本发明涉及一种用于通过透射以光学检测在流体样品中运动的纳米粒子的方法，包括：
-发射空间不相干的光束以照射样品；
-通过包括显微镜物镜的成像光学系统，在二维光学检测器的检测平面上，形成位于所述显微镜物镜的物焦平面附近的所述样品的分析体积的图像；
-通过所述二维检测器获取所述样品的分析体积的一系列图像，在不到1毫秒的预设时间段内，每个图像通过入射到所述样品上的所述照射光束和由所述分析体积中的每个纳米粒子散射的光束之间的光学干涉产生；
-处理图像以取得所述一系列图像的平均值，并从每个图像中减去所述平均值，从而针对所述分析体积中的每个纳米粒子确定所述散射光束的振幅。
根据一个或多个样品实施方式，光束的发射是所述预设时间段的光脉冲的顺序发射，图像的获取与光脉冲的发射同步。
根据一个或多个样品实施方式，该方法还包括从以这种方式处理的所述一系列图像的开始确定所述纳米粒子的轨迹。
附图说明
在熟读以下附图所示的说明书时，将明白本发明的其它优点和特征：
-图1是示出根据本说明书的针对流体样品中的纳米粒子的检测设备的示例的图；
-图2更详细地图示出了图1所示类型的设备中的液体样品支座的示例；
-图3图示出在例如图1所示设备的示例中来自位于显微镜物镜的物焦平面之前和之后的纳米粒子的球形波的图；
-图4a和4b分别图示出了在位于显微镜物镜的物焦平面之后和在位于显微镜的物焦平面之前的粒子的情况下，透射波和由纳米粒子散射的波之间的干涉原理；
-图5a图示出了透射波和由位于显微镜物镜的物焦平面之前或之后的多个纳米粒子中的每个散射的波的之间的干涉原理，且图5b示出了在检测器的检测平面中得到的干涉图案。
-图6a至图6c分别图示出通过去除平均值处理后获得的液体样品的图像、与对应于“噬菌体λ”型病毒的粒子相关联的所述图像的干涉图案的变焦和作为在检测器的检测平面中的像素数量的函数的、在所述粒子的区域中测量的光强度分布。
-图7示出了不同纳米粒子(t4型噬菌体病毒)的轨迹的曲线，所述轨迹由两个连续图像之间的一系列跃迁表示。
为了一致性，在不同附图中，相同的元件由相同的数字指示。
具体实施方式
图1以示意性方式示出了根据本说明书的用于检测在流体样品中运动的纳米粒子的设备的示例，图2示出了图1所示类型的设备中的样品布置的具体示例。
图1所示的检测设备100包括适于发射通过液体或气体样品20的入射光束的光源10。该光源是空间不相干光源，例如热源或led(发光二极管)。光源10照射通常大于1的大数值孔径的显微镜物镜31的场。图1中所示的设备100还包括通常称为管透镜的光学器件32，其与显微镜物镜31一起形成光学成像系统30，适于在二维光学检测器40的检测平面上形成显微镜物镜的物焦平面的图像。物镜是例如标准油浸式显微镜物镜，并且二维检测器是例如相机，例如ccd或cmos，通常以最小约100hz量级的频率和大的阱容量(例如至少十万个电子量级)操作。阱容量设定信噪比，从而设定最小的可测病毒尺寸。在图1的示例中，检测设备100还包括连接到检测器40和屏幕60以及在本示例中连接到光源10的控制单元11的处理装置50，从而提供在脉冲模式下工作和检测之间的光源的同步。
如图2更详细所示，样品20例如是体积为微升量级的液体样品；体积由厚度大约等于一百微米的塑料膜23中的圆形孔(例如，半径为毫米数量级)形成，放置在2个显微镜盖玻片22之间，整体形成样本保持器21。除了不定期进行初步过滤以分离非常大的粒子并且仅保留直径小于几百纳米(例如，有利地小于一百纳米)的粒子之外，对于液体样品的分析不需要特别的准备。然而，在特别“干净的”样品(低浓度病毒)的情况下，可能须通过已知方法“浓缩”病毒样品。
尽管对于液体样品的情况进行了描述，但是根据本说明书的纳米粒子的检测方法也可以应用于在气体例如空气中运动的纳米粒子；在这种情况下，设备100可以直接安装在正在分析空气的环境中。还可以进行初步过滤以将检测限制在直径小于几百纳米的粒子中。
本发明的原理通过针对与物场的一个“像素”或“体素”对应的体积的图3示出；图3以示意方式示出了来自分别位于显微镜物镜的物焦平面之前和之后的物场中的两种纳米粒子的球形波。
物场的像素或“体素”是指在显微镜物镜31的物空间中对像场的像素的定义的基本体积vi，该像场由检测器40的有效检测表面限定。
物场中的体素vi可以通过由显微镜物镜31的景深所限定的长度l和由显微镜物镜的衍射斑所限定的截面s的圆柱体积表示。景深l和截面s的直径φ由下式给出：
其中na是显微镜物镜的数值孔径，n是物空间的介质指数(indexofthemedium)(例如，在油浸式显微镜物镜的情况下介质指数为≈1.5的介质)，λ为由光源10发射的光波的工作波长。
因此，可以通过体素vi的总和来定义样本的分析体积va；分析体积va表示：能够在其中能被检测到在流体中运动的粒子的体积。分析体积具有由物场的尺寸限定的横向尺寸(即，检测表面的尺寸与成像系统30的放大倍数的倒数的乘积)，以及由景深l限定的轴向尺寸。
如图3所示，来自显微镜物镜31的焦平面f的点fi的波是具有中心fi的球面波w0，显微镜物镜将其转换成平面波w'0。平面波w'0(下文中称为“基准波”)遇到显微镜管透镜(图3中未示出)。在检测器40的检测平面中，该平面波形成直径作为显微镜物镜的数值孔径和成像系统30的放大倍数的函数的衍射斑点。
在体素vi内，当被来自光源10的光波照射时，亚波长纳米粒子p1和p2(即，具有小于工作波长的尺寸，并位于点fi附近，但在景深的界限处)各自发射散射的球面波，其被显微镜物镜31转换成准平面波，分别表示为图3中的w'1，w'2。纳米粒子太小而不能产生相移。另一方面，在纳米粒子的存在下，体素内的空间相干性在分别来自照明光束和由纳米粒子散射的光束的近似同心球形波之间产生干涉。
根据本说明书的检测方法基于通过二维检测器40获取样品分析体积的一系列图像，每个图像通过在相对于纳米粒子的运动时间足够短的预设时间段(通常不到1毫秒)期间发射的入射光和由从入射光束形成的分析体积中存在的每个纳米粒子散射的光束之间的光学干涉产生。因此，在图3的示例中，光波w'1，w'2中的每个与基准波w'0相干。可以示出(参见下文)，取决于纳米粒子是位于显微镜的物焦平面的下游(例如，粒子p1)还是上游(例如，粒子p2)，干涉将是相长的或相消的。这种差异是由于“gouy相”，这是来自位于焦点之前或之后的点的球面波之间的180°相移的原因。
因此，图4a和图4b分别示出了分别位于显微镜物镜的物焦平面的下游和上游的但总是在景深中的纳米粒子的相长和相消干涉的机制。在这些图中，仅示出了光源10和显微镜物镜31。
图4a的示例示出了位于显微镜物镜31的物焦平面下游的纳米粒子p1的情况。纳米粒子p1位于由检测器的场(图4a中未示出)和显微镜物镜31的景深l限定的分析体积中。纳米粒子由光源10照射，光源10有利地是空间和时间上不相干的光源，例如led，从而避免形成可能阻碍干涉信号判读的斑点。
我们这里将来自焦点fi并由显微镜物镜的孔径截取的基准波表示为w0，将由纳米粒子p1散射的同样被显微镜物镜的孔径截取的波表示为w。在图4a的情况下，基准波和散射波是同相的球面波。在波之间产生了相长干涉，其在显微镜物镜的孔径的区域中转化为亮的干涉图案i。纳米粒子的位置与焦点之间的相移小于景深，波w和w0对于在显微镜物镜的孔径中散射的所有角度(即在显微镜物镜的光轴和物镜的最大孔径之间形成的所有角度，或者对于油浸物镜通常为54°)的光线是同相的。因此，在图4a的干涉场中看不到环。
另一方面，图4b的示例示出了位于显微镜物镜31的物焦平面下游但仍处于宽度由显微镜物镜31的景深限定的分析体积中的纳米粒子p2的情况。在该示例中，由于引入gouy相，基准波w0和散射波w异相。在波之间产生相消干涉，在显微镜物镜的孔径区域中转化成暗的干涉图案i。如前所述，纳米粒子的位置与焦点之间的相移小于景深，波w和w0针对所有角度都是异相的，且看不到任何环。
如根据图4a和图4b所述，非常弱的信号(例如由每个纳米粒子散射的信号)和来自光源的强信号之间的干涉现象中，观察到通过干涉的放大，其使得能够检测非常小的散射信号，因此能够识别直径小于几十纳米的纳米粒子。
因此，将由光源的光子直接诱导的光电子数量指定为ns，并将由散射纳米粒子产生的光电子数量指定为nd，可以通过这些两种波之间的干涉获得许多光电子n，使得：
其中φ是光源光束和散射光束之间的相移。
这里，散射纳米粒子产生的光电子数量nd与光源发射的光电子数ns相比非常少(通常为1/106)。此外，在这种情况下，由于粒子在显微镜物镜的景深中的位置，根据散射粒子和焦点的相对位置，相移φ接近零或180°；因此，cos(φ)等于+1或-1。
因此，如果取大量图像的平均值，考虑到粒子的运动，通常由于尺寸非常小的粒子的布朗运动，在所有图像的范围内所取的平均值将表示背景(ns)，因为与粒子相关联的信号被降低到噪声水平。为了获得仅包含与纳米粒子相关联的信号的图像，可以从所获取的每个图像中减去平均值。然后，获得干涉项
用每像素能够存储160000个电子的检测器对信噪比进行计算表明，在通过减去平均值的处理之后，残留的测量噪声对应于由直径为20纳米的粒子生成的信号。
此外，使用大数值孔径na(通常na等于或大于1)的显微镜物镜将不仅能够增加光采集的立体角，而且还将能够使由每个纳米粒子散射的信号的强度增加，因此减小了可观察到的纳米粒子的最小直径。事实上，由纳米粒子散射的强度随σ/s变化，其中σ是纳米粒子的有效散射横截面，s是衍射斑点的表面；因此，根据上述等式(2)，由纳米粒子散射的强度随着数值孔径na的平方而变化。
图5b示意性地示出了在给定时刻获得的用于观察在诸如图5a中所示的流体介质中移动的多个纳米粒子的图像。
图5a示出了表示为p1至p4的4个纳米粒子，纳米粒子p1、p3、p4位于显微镜物镜的焦平面的下游，而粒子p2位于显微镜物镜的焦平面的上游。所有的粒子位于由检测器的场和显微镜物镜的景深l限定的分析体积va中。
纳米粒子在流体介质中运动。例如，它们可以是数十纳米到几百纳米的纳米粒子，例如水生环境中的病毒。在根据本说明书的检测方法的实施期间，获得了一系列图像，每个图像通过在分析体积中发射的入射光束和由每个纳米粒子在给定的足够短的时间(以“冻结”粒子的运动)期间散射的光束之间的光学干涉产生。
已知，经历布朗运动的半径为r的球形纳米粒子的散射能力由下式给出：
d＝kbt/6πηr(4)
其中kb是玻尔兹曼常数，η是在温度t下浸入有纳米粒子的流体的粘度。
对于时间间隔t，在相机上以2维成像的粒子的跳跃l由下式给出：l＝√4dt其中d是由等式(4)给出的散射能力。
因此，实际上，尝试在足够短的时间t内形成图像，使得纳米粒子尚未覆盖大于衍射斑点的一部分的距离。通常，显示图像将在不超过1毫秒的时间段内形成。
根据第一变型，可以通过检测来冻结运动，利用具有非常高的采集速率的相机，通常每秒钟超过几千幅图像。
或者，可以使用持续时间小于1毫秒的脉冲源，与在检测器上获取每个图像同步。在这种情况下，例如，检测器可以是采集速率为一百赫兹的标准相机。半径为几十纳米(例如约40nm)纳米粒子经历的且在2个连续图像之间测量的“跃迁”大于1微米，这在所使用的显微镜物镜的分辨率下容易测得。
如上文通过图4a和图4b所解释的，位于显微镜物镜焦平面下游的纳米粒子将引起相长干涉，得到在图5b所示的检测平面41上的亮衍射斑点(p'1，p'3，p'4)。另一方面，位于显微镜物镜的焦平面上游的纳米粒子将引起相消干涉，导致检测平面上的暗衍射斑点(p'2)。
实际上，如上所述，根据干涉是相长的还是相消的，在检测平面41上观察到实质背景，其上叠加有比背景更亮或更暗的衍射斑点。有利地，根据本说明书的检测方法，记录一系列图像(例如数百个)，并且取其平均值。为了获得仅包含与纳米粒子相关联的信号的图像，可以从获取的每个图像中减去平均值。
图6和图7示出了使用根据本说明书的检测方法分析的液体样品获得的第一实验结果，以检测和识别潜在存在的病毒。这分别涉及含有噬菌体λ型病毒的样品和含有噬菌体t4型病毒的样品，该样品正是代表在布列塔尼海岸发现的样品。
图6a是通过去除平均值处理之后从液体样品获得的图像。用于获得该图像的设备是图1所示的那种设备，其具有
图6b示出了与隔离的纳米粒子相关联的图6a的图像的干涉图案的变焦，图6c示出了在所述粒子的区域中测量的光强度分布(以借助于已知尺寸的纳米粒子校准的单位)，其作为在检测器的检测平面中的像素数的函数并对应于由纳米粒子散射的光束的振幅。
用所获得的图像不仅可以确认病毒的存在，还可以鉴别它们，特别是根据其尺寸；在目前的情况下，对散射光强度的测量可以推测出与“噬菌体λ”病毒对应的直径为60nm的纳米粒子。
图7示出了在十分之一秒量级的时间段期间测量的一定数量的粒子的轨迹，用类似于用于形成图6a所示的图像的设备那样的设备。在该示例中，通过由大约十五个纳米粒子在两个连续图像之间进行的一系列跃迁形成每个轨迹，它们中的每一个在图7中通过图例中所示的符号识别。
从这些实验测量开始，可以(如前所述)确定散射光振幅(在图例中与每个符号相对的任意单位表示的值)。这里，所有纳米粒子的散射振幅基本相同，并且可以推断直径为90纳米的“噬菌体t4”型病毒的均质群体的存在。
对轨迹的分析使得可以将补充信息提供给散射强度的测量值。事实上，对布朗运动的分析也使得可以推导出关于纳米粒子的具体信息，例如，它们的尺寸、存在的扰乱布朗运动的尾部等。
尽管通过一定数量的样品实施方式进行了描述，但根据本发明的用于检测流体环境中的纳米粒子的光学方法和用于实施所述方法的设备具有不同的变型、修改和改进，这对本领域技术人员将是显而易见的，应当理解为这些不同的变型、修改和改进是由所附权利要求限定的本发明的范围的一部分。
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