鼠李糖乳杆菌GG的经间歇灭菌的完整的免疫活性细胞的制造及其定性和定量确定方法与流程

本发明涉及鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的(tyndallized)完整的免疫活性细菌细胞；其制造方法，以及用于定性和定量确定鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的完整的免疫活性细菌细胞的分析方法。

制造经间歇灭菌的孢子或细菌的技术是众所周知的。间歇灭菌是一种分级灭菌方法，其中以间歇模式实施加热至80-100℃的温度30分钟。第一次热处理杀死营养体型(vegetativeform)，之后是24小时的温育期，促进孢子萌发。将如此处理的材料恢复至80-100℃的温度30分钟，以杀死由孢子萌发产生的营养细胞(vegetativecell)。这些程序应重复次。间歇灭菌用于不耐受高温的物质，例如孢子或乳酸菌。

经间歇灭菌的细菌细胞是具有失活的复制能力和失活的酶能力的那些细菌细胞。然而，经间歇灭菌的细胞维持了其未修饰的细胞结构和细胞壁。因此，从其活性的角度来看，经间歇灭菌的细菌细胞可以被定义为生理上完整的细胞，由此它们具有免疫活性。这意味着经间歇灭菌的完整细胞保持了其对galt的特异性免疫刺激活性。

肠相关淋巴组织(gut-associatedlymphoidtissue)，也称为galt，通常是指存在于消化道水平的免疫系统部分。galt是粘膜相关淋巴组织的一个例子，其主要和次要应答都负责保护粘膜免受病原体攻击。实际上，胃肠系统代表与外部环境的沟通途径，并且主要由潜在致病微生物居住(尤其是肠)，从而需要在粘膜水平上强力存在免疫系统以确保对这些群体的控制。

在研究最多的乳酸菌菌株中，毫无疑问，鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)ggatcc53103由于其非凡的免疫刺激性质/活性而被有效地用在人和儿科使用的许多制剂中。然而，迄今为止，不存在含有鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的细菌细胞的制剂。这特别是由于如下事实，即时至今日不可能确定存在于细菌细胞样品中的经间歇灭菌的完整细胞的确切数目。

因此，通过快速可靠和完全可再现的分析方法，能够确定样品中存在的具有完整的免疫活性细胞(具有未修饰的细胞壁的细胞)的经间歇灭菌的细菌细胞的确切数目将是非常有用的。此外，还必须能够确保经间歇灭菌的完整的免疫活性细胞的确定数量对应于在测试的经间歇灭菌的样品中实际存在的数量，以便于其施用，确保使用的剂量的再现性，延长即使在30℃的温度下的保质期以允许将鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的细菌细胞运送到更暖和的国家，并促进将所述细菌细胞加工成最终产品(制剂)。

然而，目前并尚未获得制造具有以快速、准确、可靠和完全可再现的方式确定的细胞数的鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的完整的免疫活性细菌细胞的培养物的方法。

因此，仍然需要一种方法制造鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的完整的免疫活性细菌细胞的培养物；所述培养物具有准确、可靠和完全可再现数量的细胞。此外，仍然需要一种分析方法，其能够以快速、准确、可靠和完全可再现的方式仅计数具有未修饰细胞壁从而保持其免疫系统的固有能力的鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的完整细菌细胞。

本发明的目的是鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的完整的免疫活性细菌细胞的培养物，如所附权利要求所述；所述培养物具有精确、可靠和完全可再现浓度值的经间歇灭菌的细菌细胞。

本发明的目的是用于制备所述鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的完整的免疫活性细菌细胞的方法，如所附权利要求所述；所述方法快速、准确、可靠且完全可再现。

本发明的目的是用于定性和定量地确定在先制备后经间歇灭菌的鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的细菌细胞培养物中存在的鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的完整的免疫活性细菌细胞的分析方法，如所附权利要求中所述。

本发明的一个目的是使用流式细胞荧光测定术来计数存在于鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的细菌细胞的样品中的已死亡但完整的细胞，如所附权利要求中所述。

以下将在本说明书中描述本发明的优选实施方式。

本发明首先考虑了例如以固体形式的鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的细菌细胞培养物，例如浓度为1×10⁶至1×10¹⁰ufc/g，优选为1×10⁷至1×10⁹ufc/g的干燥、脱水或冷冻干燥的培养物的制备。根据本领域技术人员已知的技术和装置制备培养物。一旦制备细菌细胞培养物，根据本领域技术人员已知的技术，将其进行间歇灭菌处理，以获得经间歇灭菌的细菌细胞培养物。

然后，为了定量经间歇灭菌的完整的免疫活性细菌细胞，申请人开发了一种创新的分析计数方法以用于定性和定量确定经间歇灭菌的细菌细胞，其有效应用于鼠李糖乳杆菌gg(53103)并基于细胞荧光测定术的使用。

申请人将流式细胞荧光测定术应用于鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的完整细菌细胞的样品，所述样品是通过已知的间歇灭菌技术和装置获得的。

所要求保护的方法可用于鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的细菌细胞的快速准确计算，所述鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的细菌细胞在通过本领域技术人员已知的技术和装置进行制备后，用本领域技术人员已知的技术和装置进行间歇灭菌处理，这使其复制能力和酶能力失活。

该方法是由申请人开发的，因为传统的计数方法不允许定量存在于经间歇灭菌的生物样品中的鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的死细菌细胞，并且同时不允许确保细菌细胞样品具有良好建立和可再现的生物活性(刺激免疫系统和/或生物活性肽)。有利地是，该方法成功应用于不能复制但具有细胞壁水平的结构完整性的鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的细菌细胞。

本发明的方法设计了一系列步骤，这将在以下说明书中更详细地描述。

首次应用流式细胞荧光测定术以计数鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的完整细菌细胞。

因此，本发明的一个目的是使用细胞荧光测定法来产生、计数和确定鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的细菌细胞数量及其在经间歇灭菌的样品中的生物学活性。

流式细胞仪提供了一种快速可靠的方法来定量细菌悬液中存在的活细胞/死细胞。通过细胞荧光测定分析，可以利用专门研究细胞壁完整性的“bd^tm细胞活力”(bd^tmcellviability”)试剂盒(由bectondickinson公司出售)中所含的特定染料的组合，在生物样品例如细菌细胞培养物中区分活细胞和死细胞。

可商购的试剂盒包含第一染色试剂如噻唑橙(to)，其能够标记所有细胞(活细胞和死细胞)，以及第二染色试剂如碘化丙啶(pi)，其针对死细胞具有特异性。

对于定量细胞确定，必须与上述试剂盒，由bectondickinson公司出售的荧光小珠“bd^tm液体计数小珠”(“bd^tmliquidcountingbeads”)的悬浮液相关联。所述小珠悬浮液是荧光聚苯乙烯微球在0.1％叠氮化钠溶液中的悬浮液。

加入10至100μl，优选为40至60μl的已知量的小珠，这允许通过外推收集的数据来确定绝对细胞计数。

具有完整细胞质膜的活细胞对于染料，如碘化丙啶(pi)不可渗透。相反，诸如碘化丙啶(pi)等染料可以进入具有受损的细胞质膜的细胞。噻唑橙(to)是能够进入所有细胞(活细胞和死细胞)的染料。这两种染色试剂的组合提供了一种快速可靠的方法来区分具有结构完整性的活细菌细胞和死细菌细胞。

重要的是执行对试剂和测试样品进行调理(conditioning)的初步步骤。

因此，程序如下：

·使用前将所有试剂盒试剂置于室温。

·将含有细菌细胞的生物样品在室温下放置1-6小时，优选当储存在-20℃的温度时1.5至3小时，例如2至2.5小时，当储存在+4℃时约60分钟，例如30分钟。

·在缓慢轻柔搅拌下放入含有小珠的悬浮液。

接下来，进行制备鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的细菌细胞培养物，随后对其间歇灭菌，以获得经间歇灭菌的细菌细胞的培养物，例如为固体形式，如干燥、脱水或冷冻干燥培养物，所述培养物具1×10⁶至1×10¹⁰ufc/g，优选为1×10⁷至1×10⁹ufc/g的浓度。

然后，进行试验样品的制备。

·在液体形式的样品的情况下，在0.1％无菌蛋白胨盐水中连续稀释1:10，直至达到约10⁵-10⁷个细胞/ml的浓度。

·在无水样品的情况下，在无菌袋中以1:10复建样品，然后将其整齐(stomachingthewhole)，以使制剂匀质化。然后，如同在液体形式的样品的情况下，进行随后的1:10稀释。

接下来，通过使用细胞荧光测定术对活细胞/死细胞的量进行分析。

关于染色步骤，程序如下：

·向0.5ml适宜稀释液加入2.5μl噻唑橙to和1.5μl碘化丙啶pi，在室温下搅拌并温育2分钟；和

·加入50μl含有小珠的悬浮液，并对样品进行细胞荧光测定分析。

然后，执行数据的获取和分析。

建立细胞图，其中x轴表示正向散射(fsc)和y轴表示侧向散射(ssc)，以限定待分析的群体(r2，参见图1)。

为了将基于所使用的染料的内在化而区分的细胞亚群正确地可视化，建立第二细胞图，其中x轴表示fl-1(to，参见图2)和y轴表示fl-3(pi，参见图2)。

图1涉及fsc对ssc细胞图，而图2涉及fl1对fl3细胞图。

接下来，执行结果的计算和表达。

为了确定样品中死细菌细胞的数目，使用下列公式。

(*)待应用的数值是在所使用的小珠包装上注明的数值，并在批次间不同；d.f.＝稀释因子

对于液体形式的样品结果表示为细胞数/ml，或对于无水形式的样品表示为细胞数/g。

通过使用上述公式和由区域(r6)限定的细胞事件，获得样品中存在的死细胞数。

已死亡但具有结构完整性的细胞对于液体形式的样品以细胞数/ml表示，或者对于无水形式的样品以细胞数/g表示。

一个实施方式涉及用于计数在鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的细菌细胞的样品中具有完整细胞膜的死细胞数目的方法；所述方法包括：

-通过连续稀释制备含有浓度为10⁵至10⁷个细胞/ml的鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的细菌细胞的样品；

-向所述样品中加入第一试剂噻唑橙和第二试剂碘化丙啶，以获得溶液；

-向所述溶液中加入荧光微球在叠氮化钠中的悬浮液，以获得测试样品；

-通过流式细胞荧光测定术对所述测试样品进行总细胞计数，包括活细胞和死细胞，以及单独死细胞计数；

-计数在经间歇灭菌的样品中存在的死细胞。

优选地，所述方法进一步设想，向0.5ml含有浓度为10⁵至10⁷个细胞/ml的鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的细菌细胞的样品加入2.5微升所述第一试剂和1.5微升所述第二试剂以获得溶液。

优选地，所述方法进一步设想，荧光微球在叠氮化钠中的悬浮液包含聚苯乙烯微球，优选小珠悬浮液是荧光聚苯乙烯微球在0.1％叠氮化钠溶液中的悬浮液。

优选地，所述方法还设想加入10-100μl，优选40-60μl的已知量的小珠，用于允许细胞计数测定。

另一个实施方式涉及制造具有完整细胞壁的鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的细菌细胞的方法；所述方法包括：

-制备浓度为1×10⁶至1×10¹⁰ufc/g的鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的细菌细胞培养物；

-使所述培养物进行间歇灭菌处理以获得经间歇灭菌的细菌细胞的培养物；

-应用上述计数方法。

另一个实施方式涉及通过如上所述的制造细菌细胞的方法获得的鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的完整的免疫活性细菌细胞的培养物。

另一个实施方式涉及流式细胞荧光测定术用于计数在鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的细菌细胞的样品中具有完整细胞膜的鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的死细菌细胞的数目的用途。

优选地，所述用途设想用如上所述的计数方法计数具有完整细胞膜的鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的经间歇灭菌的死细菌细胞。

以下示出了对鼠李糖乳杆菌gg(atcc53103)的细菌细胞进行的实验实施例(值以bn/g表示)：

图3涉及所述样品的fsc对ssc细胞图，而图4涉及所述样品的fl1对fl3细胞图。

使用的细胞荧光计和试剂盒具有以下规格。

·配有488nm激光激发的流式细胞仪facscalibur3ca(bectondickinsonitalia，目录号343020)及其cellquest^tm软件。

·具有bd液体计数珠的bd^tm细胞活力试剂盒(目录号34948)。