技术领域
本公开一般性涉及癌症的诊断、分级、分期和预后的领域。更具体来说，本发明涉及卵巢癌的领域。本公开内容还涉及了包括生物标记物表达的卵巢癌诊断、分级、分期和预后领域。
背景技术：
癌症包括范围广泛的疾病，在世界上大约每4个人中就有1个人受到影响。癌症的负面影响的严重性是深刻的，普遍影响到了医疗保险和程序以及社会。由于多种类型的癌症标志是恶性细胞的快速和不受调控的增殖，因此改善针对癌症的方法的一个决定性难题是对早期检测和诊断的需求。早期检测被广泛认为是降低癌症死亡率的最好方法。因此，已经进行许多尝试以建立准确而可靠地诊断恶性病症存在的标准。具体来说，针对被称为肿瘤相关抗原的血清学定义的抗原性标记物的应用进行了研究，这些肿瘤相关抗原或者仅由癌细胞表达，或者以明显较高的水平存在于患有恶性病症的对象中。
然而，由于肿瘤相关抗原表达的高度异质性，例如癌抗原的极端多样性，因此对癌症诊断中有用的其它肿瘤标记物存在着需求。已知有许多与癌相关抗原具有反应性的单克隆抗体。这些单克隆抗体结合各种不同的癌相关抗原，包括糖蛋白、糖脂和粘蛋白。许多这类单克隆抗体识别在来源于给定细胞谱系或组织类型的某些肿瘤但不是其它肿瘤上表现出受限表达的肿瘤相关抗原。
可用于鉴定特定类型的恶性肿瘤的肿瘤相关抗原的例子相对较少。例如单克隆抗体B72.3，特异性结合高分子量(>106Da)的肿瘤相关粘蛋白抗原，该抗原选择性地表达于许多不同的癌上，包括即便不是所有也是大部分的卵巢癌、绝大多数非小细胞肺癌、结肠癌和乳腺癌。然而，在外科切除肿瘤后检测细胞相关的肿瘤标记物例如被B72.3所识别的粘蛋白抗原，对于诊断筛查来说用途有限，诊断筛查中在实体肿瘤块积累以前对恶性病症的早期检测是优选的。
通过筛查外科切除的样本的肿瘤相关抗原对特定类型的癌症进行诊断时，通常只有在检测到积累的肿瘤块后才进行有创手术，对此的替代方法是提供可用于在得自无创或微创术对象的样本中检测此类抗原的组合物和方法。例如，在卵巢癌、子宫内膜癌和其它癌中，目前有许多可溶性肿瘤相关抗原，它们可在易获得的生物流体样品例如血清或粘膜分泌物中检出。一种此类标记物是CA125，其为一种也散落于血流中的癌相关抗原，可在血清中检出(例如Bast等，1983N.Eng.J.Med.309:883；Lloyd等，1997Int.J.Canc.71:842)。血清和其它生物流体中的CA125水平同其它标记物的水平一起测量，如癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌抗原(SCC)、组织多肽特异性抗原(TPS)、唾液酸化TN粘蛋白(STN)和胎盘碱性磷酸酶(PLAP)，以试图提供卵巢癌、子宫内膜癌和其它癌的诊断和/或预后情况(例如Sarandakou等，1997Acta Oncol.36:755；Sarandakou等，1998Eur.J.Gynaecol.Oncol.19:73；Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):2945；Kudoh等，1999Gynecol.Obstet.Invest.47:52；Ind等，1997Br.J.Obstet.Gynaecol.104:1024；Bell等，1998Br.J.Obstet.Gynaecol.105:1136；Cioffi等，1997Tumori 83:594；Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):2949；Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):3019)。
但是，单独的血清CA125水平升高或与其它已知指标相结合，并不能提供对恶性肿瘤或特定恶性肿瘤如卵巢癌或子宫内膜癌的确定诊断。例如，相对于宫颈癌和生殖道癌来说，阴道液和血清中CA125、CEA和SCC的升高在良性妇科疾病中与炎症最密切相关(例如Moore等，1998Infect.Dis.Obstet.Gynecol.6:182；Sarandakou等，1997Acta Oncol.36:755)。血清CA125升高也可伴有神经母细胞瘤，而CEA和SCC水平升高可伴有结肠直肠癌。另一种标记物，分化抗原间皮素，表达于正常间皮细胞表面还有某些癌细胞上，包括上皮性卵巢肿瘤和间皮瘤。与间皮素(Chang等，1992Canc.Res.52:181；Chang等，1992Int.J.Canc.50:373；Chang等，1992Int.J.Canc.51:548；Chang等，1996Proc.Nat.Acad.Sci.USA 93:136；Chowdhury等，1998Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95:669；Yamaguchi等，1994J.Biol.Chem.269:805；Kojima等，1995J.Biol.Chem.270:21984)和结构相关的间皮素相关抗原(MRA；参见例如Scholler等，1999Proc.Nat.Acad.Sci.USA 96:11531)有关的组合物和方法在本技术领域内是已知的，包括如在WO 00/50900和美国申请系列号No.09/513,597中描述的在癌症检测和治疗中的应用。对于可用于多标记物诊断筛选的其它的标记物存在着迫切的需求。
“四个二硫键核心”蛋白家族包含功能多样的酸-和热-稳定的小分子的异质群组，其包括人类附睾四个二硫键核心蛋白，或“HE4a”(Kirchhoff等，1991Biol.Reprod.45:350-357；Wang等，1999Gene229:101；Schummer等，1999Gene 238:375)。
HE4cDNA首先从人类附睾中分离(Kirchhoff等，1991Biol.Reprod.45:350-357)，随后HE4cDNA以高频率在从卵巢癌构建的cDNA文库中被检出(Wang等，1999Gene 229:101；Schummer等，1999Gene 238:375)。HE4a，“四个二硫键核心”蛋白家族的新成员，描述于美国专利申请公布号No.2003/0108965A1中。HE4a显示出与HE4高度相似但有所不同的序列。HE4a已经描述于美国专利申请No.10/233,150中，在此引为参考，它包括了在本公开中使用的SEQ ID NO名称。对于本公开的意图来说，HE4或HE4a的检测被认为是同义的，检测的任何一个分子都可以用于本文描述的方法中。HE4a是否是与HE4不同的分子、或HE4a的序列是否只是代表了对已公布的HE4序列的校正，并不重要。
技术实现要素：
本公开包括了评估患者(例如出现骨盆肿块的患者)是否患有卵巢癌的方法。该方法包括在从患者获得的样品中评估至少两种标记物，包括HE4标记物和选自SMRP、CA125和CA72-4的另一种标记物。标记物的水平升高与患者患有卵巢癌的可能性增加相关。例如，可以评估样品中的HE4和CA125标记物或HE4和SMRP标记物。这种方法可以用于辨别患者的骨盆肿块是良性的还是卵巢癌。
在另一个实施方案中，本公开涉及了评估患有卵巢癌的患者对治疗的反应的方法。该方法包括对在治疗过程的不同时间从患者获得的样品中的至少两种标记物进行评估，包括HE4标记物和选自SMRP、CA125和CA72-4的另一种标记物。在后来的时间标记物的水平降低表明患者对治疗有反应。治疗可以是例如腹膜内化疗或给患者施用与CA125特异性结合的抗体。
本公开还涉及了在已经进行了卵巢癌治疗的患者中评估疾病复发的方法。该方法包括在从治疗后的患者获得的样品中评估至少两种标记物，包括HE4标记物和选自SMRP、CA125和CA72-4的另一种标记物。标记物的水平升高表明患者卵巢癌复发。可以在治疗后对标记物进行多次评估，标记物水平增加表明患者卵巢癌复发。
在另一个实施方案中，本公开涉及了对患者将发展卵巢癌的可能性进行评估的方法。该方法包括在从患者获得的样品中评估至少两种标记物，包括HE4标记物和选自SMRP、CA125和CA72-4的另一种标记物。标记物水平升高与患者将发展卵巢癌的可能性的增加相关。
在另一个实施方案中，本公开包括在患有卵巢癌的患者中对肿瘤进行分期和/或分级的方法。该方法包括在从患者获得的样品中评估至少两种标记物，包括HE4标记物和选自SMRP、CA125和CA72-4的另一种标记物。标记物水平升高与更晚期的卵巢癌阶段和/或更高等级的卵巢癌相关。
几个表格的简述
表1包含了通过在设定的特异性水平下比较标记物的灵敏度而归纳出的实施例1的结果。
表2包含了实施例2中描述的患有和未患有恶性肿瘤的对象中的年龄分布。
表3包含实施例2中描述的患有良性疾病的对象的临床诊断。
表4包含了实施例2中描述的患有卵巢癌的对象的组织学和阶段分布。
表5包含了实施例2中描述的卵巢癌和良性肿瘤的标记物平均值和中值的比较。
表6包含了实施例2中描述的在设定的特异性水平下标记物组合的灵敏度值的比较。
表7包含了实施例2中描述的患有I期卵巢癌或良性疾病的对象中肿瘤标记物的比较。
表8包含了实施例2中描述的患有良性和I期卵巢癌的对象在特异性水平设置为90％、95％和98％的情况下肿瘤标记物组合的灵敏度的比较。
表9概括了实施例3中描述的患有良性疾病的对象在特异性水平设置为90％、95％和98％的情况下单个标记物和标记物组合的灵敏度值。
发明详述
本公开的主题总的来说涉及使用生物标记物的组合在女性中对卵巢癌进行评估。对HE4单独地或与一种或多种其它的卵巢癌标记物(特别是标记物CA125、SMRP和CA72-4)组合在一起进行评估，可以用于诊断在人类患者中发生的卵巢癌，以及评估癌症对各种不同类型的治疗(例如腹膜内化疗或用抗CA125抗体例如Edmonton,Alberta,Canada的ViRexx公司的产品进行治疗)的反应。此外，这些标记物的评估可用于监测患者卵巢癌的复发，或评估患者将发展卵巢癌的可能性。
定义
本文中使用的术语“样品”是指可以与患者特定有关的材料，从中可以确定、计算或推断出与患者有关的特定信息。样品可以全部或部分由来自患者的生物材料构成。样品也可以是以某种方式与患者接触的材料，这种方式使得对样品进行的测试提供了与患者有关的信息。样品也可以是已经与其它材料接触过的材料，这种其它材料不是患者的，但是能够使第一材料随后被测试以确定与患者有关的信息。样品可以接触患者之外的生物材料源，只要本技术领域的专业人员仍然能够从样品确定与患者有关的信息就行。还可以理解的是，不是样品的外来材料或信息也可用于将患者与样品结论性地联系在一起。举一个非限制性的例子，双盲实验需要图表或数据库以将样品与患者相匹配。
本文中使用的术语“患者”是指作为确定与生物体有关的信息的分析对象的生物体。尽管在本文描述的方法的大部分实施方案中患者是人类，但那些方法不限于用于人类个体。患者可以是一组人类。患者也可以是人的一部分。这种实施方案的非限制性例子是，患者可以是与人体不相连的组织样品，或转化的细胞系。在某些实施方案中，患者也可以是非人类的生物体。
本文中使用的术语“参比值”是指当与分析结果相比时，与特定结果统计学相关的值。在优选实施方案中，参比值是根据比较HE4a表达与已知临床结果的研究的统计学评论来确定的。在本文的实施例部分中显示了一些这样的研究。但是，来自文献的研究和本文描述的方法的用户的经验也可用于产生或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的医疗史、遗传学、年龄和其它因素特别相关的情况和结果来确定。
本文使用的术语“体液”是指从患者获得的稠度基本为流体的材料，但是可以有固体或颗粒物质与其结合。体液也可以含有不是来自于患者的材料和部分。例如体液可以用水稀释，或可以含有防腐剂例如EDTA。体液的非限制性例子是血液、血清、浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、脑脊液、唾液、分泌组织和器官的粘膜分泌液、阴道分泌物、乳汁、眼泪、以及腹水液例如与非实体肿瘤有关的腹水液。其它的例子包括胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它体腔的流体等。生物流体还可以包括与患者或生物源接触的液体溶液，例如细胞和器官培养基，包括细胞或器官条件培养基、灌洗液等。
如果样品是在治疗性组合物或方法的施用前、施用时或施用后或在其后进行的后续随诊过程中获得的，那么样品是“在治疗过程中”从患者获得的。该术语的使用明确地包含了样品在进行治疗之前和之后(即为了评估治疗的有效性或复发)被获得的情况，以及在较长期的治疗过程中间断地获取多个样品的情况。
具体实施方式
卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤。据估计，在2005年将有超过22,000名女性将得以诊断并有超过16,000人将死于疾病(Murray等，2005.Ca.Cancer.J.Clin.2005；55(1):10-30)。这些女性中大部分表现出附件肿块，在上腹部中具有或不具有疾病的征象。但是，在美国，所有女性中的20％将被诊断出在某些点具有附件肿块或囊肿，而其中仅有很少百分比表现为恶性肿瘤。
卵巢癌通过外科手术进行分期，研究显示，由妇科肿瘤医生进行手术的患者比由非妇科肿瘤医生进行手术的患者更经常适当分期和去除肿块。与由良性妇科医生进行手术相反，对于何时应该将有附件肿块的患者托付给妇科肿瘤医生进行外科探查必须频繁地进行临床决定。CA125肿瘤标记物可用于帮助预测哪些有骨盆肿块的患者可能患有卵巢癌。不幸的是，许多良性的妇科和非妇科症状也能升高CA125，这降低了它的特异性；在多达一半的患有早期卵巢癌的患者中也发现了CA125正常。需要更精确的测试来确定出现附件肿块的患者中恶性肿瘤的风险，从而帮助妇科肿瘤医生对患者大致分诊。
卵巢癌的存活率低部分是由于在疾病的早期阶段缺少症状并缺少有效的筛查。结果是，70％的患者在诊断时已患有III期或IV期疾病，5年存活率大约为44％(Murry等，同上)。对于早期疾病(I期)来说，5年存活率在74％到90％的范围内(Averette等，1995,Cancer76(6):1096-1103；Young等，1990N.Engl.J.Med.,322(15):1021-1027)。不幸的是，目前还没有卵巢癌的有效的筛选筛查检验，因此需要灵敏度和特异性增加的肿瘤标记物。能够将良性与恶性肿块充分区分开的标记物或标记物的组合，也将是作为有潜力的筛查检验用于评估的良好候选者。
在卵巢癌中使用最广泛的标记物是血清肿瘤标记物CA125，但是对于早期疾病的检测来说，它既不够灵敏也不够特异(Einhorn等，1992,Hematol.Oncol.Clin.North.Am.6(4):843-850；Campbell等，1990,Br.J.Obstet.Gynaecol.97(4):304-311；Jacobs等，1993,BMJ 306(6884):1030-1034；DePriest等，1993,Gynecol.Oncol.51(2):205-209)。令人失望的是，在高风险患者的评估中组合使用超声成像和血清CA125水平，还没有显示出降低了该疾病的死亡率(Jacobs等，1990,Br.J.Obstet.Gynaecol.97(10):922-929；Karlan等，1993Am.J.Obstet.Gynecol.169(3):494-501；Bourne等，1993,BMJ 306(6884):1025-1029；Schwartz等，1991,Yale J.Biol.Med.64(6):557-571)。也已经评估了几种新的肿瘤标记物以确定它们在鉴定卵巢癌中的用途。
最近已经发现在患有卵巢癌的女性中，可溶性间皮素相关肽(SMRP)和HE4的水平升高(Schaner等，2003,Mol.Biol.Cell 14(11):4376-4386；Hough等，2000,Cancer Res.60(22):6281-6287；Scholler等，1999,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(20):11531-11536；Hellstrom等，2003,Cancer Res.63(13):3695-3700)。可溶性间皮素相关肽是巨核细胞增强因子家族的成员，在患有卵巢癌的患者的血清和尿液中都已经检测到14。在初步研究中，在92％的患有卵巢癌的女性中血清SMRP的水平升高了，与此相比在患有良性疾病的女性中只有10％升高。使用尿液进行分析，在患有卵巢癌的女性中有67％的SMRP水平升高了，与此相比是健康志愿者为14％，而患有良性妇科疾病者为20％(Bones等，2003,美国临床化学联合会第55届年会，American Association for Clinical Chemisty,55th Annual Meeting)。
最近通过微阵列技术鉴定出骨桥蛋白是有潜力的卵巢癌标记物，并且已经发现它在卵巢癌患者的血清中升高了(Kim等，同上)。Kim等已经表明在卵巢癌患者中骨桥蛋白的组织表达增加以及血清水平增加；但是，为了获得80％的灵敏度，将特异性降低到了只有80％(Kim等，同上)。CA72-4是最早在1980年代早期被描述的蛋白，当用作单标记物并当与CA125组合时(Negishi等，1993,Gynecol Oncol.48:148-154；Skates等，2004,J.Clinical Oncology 22(20):4059-4066；Fayed等，1998,Disease Markers 14:155-160)，已经被显示出在各种癌症中升高(Colcher等，Proc.Nat.Acad.Sci.78(5):3199-3203)，包括卵巢癌。激活素和抑制素也已经作为可能的标记物得以研究，尽管在上皮癌中灵敏度还不高(Robertson等，2002,Molecular and Cellular Endocrinology 191(1):97-103；Robertson等，2004,Endocrine-Related Cancer,11:35-49)。
HE4是一种11kDa的蛋白，是附睾分泌蛋白E4的前体，其基因最初是通过微阵列技术鉴定的。在正常的卵巢组织中仅有极小量基因表达，在卵巢癌中表达升高5。在卵巢癌女性中有88％的血清HE4水平升高了，相比较而言在患有良性妇科病症的女性中为5％(Kim等，2003,JAMA 287(13)1671-1679)。有趣的是，SMRP和HE4分析水平的升高不依赖于疾病的阶段和绝经状态。使用尿液分析，在50％的I期患者和79％的II期患者中SMRP的水平升高了，提高了增加早期疾病检测的可能性(Bones等，同上)。
本文描述的方法涉及HE4a，是本文描述的“四个二硫键核心”蛋白家族的成员，其表现出与HE4高度相似但是有所不同的序列(Kirchhoff等，1991Biol.Reproduct.45:350-357)。正如本文描述的那样，HE4a(不是HE4)令人意外地显示出在某些恶性肿瘤中的过表达，例如在子宫内膜癌中以及许多其它人类组织中，这与人类附睾上皮细胞中HE4的受限制的表达模式形成了鲜明的对比(Kirchhoff等，1991)。本文描述的方法还部分涉及了组合物和方法，用于检测对象中天然存在的细胞表面和/或可溶形式的HE4a，包括在患有某些癌症(例如子宫内膜癌)的对象中这类多肽的升高的水平。因此，本公开提供了通过特异性检测这些细胞表面和/或可溶的HE4a多肽，检测和诊断对象中恶性肿瘤病症的有用的组合物和方法。
按照本文描述的方法，可以在来自对象或生物来源的生物样品中检测可溶性人类HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)。生物样品可以通过从对象或生物来源获得血液样品、活检样品、组织外植体、器官培养物、生物流体或任何其它的组织或细胞制备物来提供。对象或生物来源可以是人类或非人类的动物、原代细胞培养物或改造的培养物细胞系，包括但不限于可以含有染色体整合的或游离的重组核酸序列的遗传工程的细胞系、永生化的或可以永生化的细胞系、体细胞杂交细胞系、分化的或可以分化的细胞系、转化的细胞株系等。在本文公开的方法的某些优选实施方案中，对象或生物来源可以被怀疑患有恶性肿瘤病症或有恶性肿瘤病症的风险，该病症在某些其他优选实施方案中可以是子宫内膜癌症例如子宫内膜癌，在本文公开的方法的某些其它的优选实施方案中，对象或生物来源可以已知没有这些疾病的风险或存在。
在某些实施方案中，生物样品包括至少一种来自于对象或生物来源的细胞，在其它某些优选实施方案中，生物样品是含有另一种肿瘤标记物例如CA-125或可溶性人类间皮素相关抗原多肽的生物流体。生物流体典型为生理温度下的液体，并可以包括在对象或生物来源中存在、从中抽取、表达或以其他方式从中提取的天然存在的流体。某些生物流体源自于特定的组织、器官或定位的区域，而某些其它生物流体可以更为整体或全身地存在于对象或生物来源中。生物流体的非限制性例子包括血液、血清和浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、脑脊液、唾液、分泌组织和器官的粘膜分泌液、阴道分泌物、乳汁、眼泪、以及腹水液例如与非实体肿瘤有关的腹水液。其它的例子包括胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它体腔的流体等。生物流体还可以包括与对象或生物源接触的液体溶液，例如细胞和器官培养基，包括细胞或器官条件培养基、灌洗液等。在其它的优选实施方案中，生物样品是无细胞的液体溶液，例如血清、血浆或离心的尿液的上清液。
在某些其它的优选实施方案中，生物样品含有完整的细胞，在某些其它的优选实施方案中，生物样品含有包含了核酸序列的细胞提取物，该核酸序列编码具有SEQ ID NOS:11或13中显示的氨基酸序列的HE4a抗原多肽、或其片段或变异体。在本文所述的方法的其它实施方案中，需要在进行分析以前，对细胞进行物理或化学的破碎或裂解，以提供分析用细胞内容物。
样品中的“以可溶形式天然存在的分子”可以是可溶性蛋白、多肽、肽、氨基酸或其衍生物；脂类、脂肪酸或类似物、或其衍生物；碳水化合物、糖类或类似物、或其衍生物；核酸、核苷酸、核苷、嘌呤、嘧啶或相关的分子、或其衍生物等；或其任何组合，例如，糖蛋白、糖脂、脂蛋白、蛋白脂或本文提供的生物样品的可溶性或无细胞组分的任何其它生物分子。“以可溶形式天然存在的分子”也指溶液中或存在于生物样品中、包括本文提供的生物流体中的分子，并且它们不与完整细胞的表面结合。例如，以可溶形式天然存在的分子可以包括但不是必须限于溶质；大分子复合物的成分；从细胞脱落、分泌或输出的物质；胶体；微粒或纳米粒子或其它细悬浮颗粒等。
对象中存在恶性肿瘤病症是指对象中存在发育异常的、癌性的和/或转化的细胞，包括例如赘生的、肿瘤的、非接触性抑制的或致癌转化的细胞等。出于说明而不是限制，在本文所述的方法中，恶性肿瘤病症还可以是指对象中存在能够分泌、脱落、输出或释放HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)的癌细胞，以至于在来自对象的生物样品中可以检测到这种多肽的水平升高。例如在优选实施方案中，这样的癌细胞是恶性上皮细胞例如腺癌细胞，在特别优选的实施方案中这样的癌细胞是恶性间皮瘤细胞，它们是在例如内胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它体腔中发现的鳞状细胞上皮或间皮细胞的转化变异体。
在本文所述的方法的大多数优选实施方案中，其存在表明了存在恶性肿瘤病症的肿瘤细胞是子宫内膜癌细胞，包括原发和转移的子宫内膜癌细胞。将恶性肿瘤分类为子宫内膜癌的标准在本技术领域中是众所周知的，来自原发和转移肿瘤的人类子宫内膜癌细胞株的建立和表征也是同样。在其它实施方案中，恶性肿瘤病症可以是间皮瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌或其它形式的癌症，包括任何各种不同的癌症例如鳞状细胞癌和腺癌，也包括肉瘤和血液恶性肿瘤(例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等)。这些以及其它恶性肿瘤病症的分类对于熟悉本技术领域的人来说是已知的，本公开提供了在这样的恶性肿瘤病症中无需过多试验就确定HE4a多肽存在的方法。
在本文包含的实施例中提供了参比值。这些值适合于本文所述方法的实践。但是应该注意的是，本文所述方法的使用并不限于那些参比值或数据。本技术领域的专业人员可以根据他们的具体需要获得参比值。这样的参比值可以在患者因为疑似恶性肿瘤的子宫或子宫内膜肿块而进行活检程序时，通过分析患者的HE4a表达来获得。获得这类参比值的方法被包含在本文中并在实施例中提供。本文所述方法的使用者可能将获得与本文提供的参比值不同的参比值，以集中于特定的患者类型。可以预见到这样的类型可以包括年龄、遗传背景、癌症风险、医疗史、血型、生理特征例如体重，以及其它的类型。
本文提供的用于在对象中筛查恶性肿瘤病症存在的方法，其特征可以是使用特异性针对HE4a抗原多肽的抗体或特异性针对HE4a多肽的抗体。
特异性针对HE4a抗原多肽(或HE4a多肽)的抗体可以容易地产生为单克隆抗体或多克隆抗血清，或可以使用本技术领域众所周知的方法产生为被设计成具有所需的性质的遗传工程免疫球蛋白(Ig)。例如，作为说明而不是限制，抗体可以包括重组IgG、具有免疫球蛋白衍生序列的嵌合融合蛋白或“人源化的”抗体(参见例如美国专利No.5,693,762、5,585,089、4,816,567、5,225,539、5,530,101，在此引为参考)，它们都可以按照本文所述的方法用于检测人类HE4a多肽。这样的抗体可以如本文所提供的制备，包括下面描述的用HE4a多肽进行免疫。例如，象本文提供的那样，公开了编码HE4a多肽的核酸序列，因此本技术领域的专业人员可以常规制备这些多肽用作免疫原。例如，下文将更详细描述的单克隆抗体如2H5、3D8和4H4，可用于根据在本文所述的方法中实践某些方法。
术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、其片段例如F(ab')2和Fab片段、以及作为与HE4a多肽特异性结合的分子的任何天然存在或重组产生的结合配偶体。抗体，如果以Ka大于或等于大约104M-1、优选大于或等于大约105M-1、更优选大于或等于大约106M-1、更优选大于或等于大约107M-1与HE4a多肽结合，它们就被定义为是“免疫特异性的”或特异性结合。结合配偶体或抗体的亲和性可以使用常规技术容易地确定，例如在Scatchard等，Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660(1949)中描述的那些技术。确定其它蛋白作为HE4a多肽的结合配偶体，可以使用鉴定和获得与其它蛋白或多肽特异性相互作用的蛋白的许多已知方法中的任何一种来进行，例如酵母双杂交筛选系统，如在美国专利No.5,283,173和美国专利No.5,468,614中所述，或其等同物。本文描述的方法也包括了使用HE4a多肽和基于HE4a多肽的氨基酸序列的肽来制备与HE4a多肽特异性结合的结合配偶体和抗体。
总的来说，抗体可以通过本领域普通技术人员所熟知的各种不同技术中的任何一种来制备(参见例如Harlow和Lane,《抗体：实验室手册》Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。在一种这样的技术中，首先将含有HE4a多肽的免疫原，例如在表面上具有HE4a多肽的细胞或分离的HE4a多肽，注射到适当的动物中(例如小鼠、大鼠、兔、绵羊和山羊)，优选按照预定的计划加入一次或多次增强免疫，然后定期从动物取血。然后可以从这些抗血清中通过例如使用与适当的固相支持物偶联的多肽的亲和层析方法纯化出特异性针对HE4a多肽的多克隆抗体。
特异性针对HE4a多肽或其变异体的单克隆抗体可以使用例如Kohler和Milstein的技术(1976Eur.J.Immunol.6:511-519)及其改进技术来制备。简单来说，这些方法包括制备能够产生具有所需特异性(即与目的间皮多肽具有反应性)的抗体的永生细胞系。这样的细胞系可以从例如从上述免疫的动物获得的脾细胞来产生。然后通过与骨髓瘤细胞融合伴侣、优选为与被免疫的动物同种同源者进行融合来使脾细胞永生化。例如，可以使用膜融合促进剂例如聚乙二醇或非离子去污剂将脾细胞和骨髓瘤细胞结合几分钟，然后以低密度接种在支持杂交细胞生长但不支持骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上。优选的筛选技术使用HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶)进行筛选。经过足够的时间，通常为大约1到2周之后，观察到杂交体的集落。选出单菌落并测试与多肽的结合活性。具有高反应性和特异性的杂交瘤是优选的。本文公开的方法中考虑到了产生与HE4a多肽特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤。
单克隆抗体可以从生长的杂交瘤集落的上清液中分离。此外，各种不同的技术可以用于增加产率，例如将杂交瘤细胞系注射到适合的脊椎动物宿主例如小鼠或其它适合的宿主的腹膜腔中。然后可以从腹水液或血液中收获单克隆抗体。可以通过常规的技术例如层析、凝胶过滤、沉淀和抽提从抗体中除去污染物。例如，抗体可以使用标准技术通过在固定化的蛋白G或蛋白A上进行层析来纯化。
在某些实施方案中，使用抗体的抗原结合片段可能是优选的。这样的片段包括Fab片段，它可以使用标准技术来制备(例如通过用木瓜蛋白酶消化来产生Fab和Fc片段)。Fab和Fc片段可以通过亲和层析(例如在固定化的蛋白A柱上)使用标准技术来分离。这样的技术在本技术领域中是众所周知的，参见，例如Weir,D.M.,《实验免疫学手册》Handbook of Experimental Immunology,1986,Blackwell Scientific,Boston。
利用与编码各种不同效应蛋白的序列按阅读框架连接的DNA序列编码的免疫球蛋白V区结构域而对于预先选定的抗原具有特异结合亲和性的多功能融合蛋白，在本技术领域中是已知的，例如在EP-B1-0318554、美国专利No.5,132,405、美国专利No.5,091,513和美国专利No.5,476,786中公开的那些。这样的效应蛋白包括多肽结构域，其可以通过本技术领域的专业人员熟悉的各种技术中的任何一种用来检测融合蛋白的结合，这些技术包括但不限于生物素模拟序列(参见，例如，Luo等，1998J.Biotechnol.65:225，在此引为参考)、用可检测的标记部分进行的直接共价修饰、与特异性标记的报告分子的非共价结合、可检测的底物的酶法修饰或固定在(共价或非共价地)固相支持物上。
用于本文公开的方法的单链抗体也可以通过例如噬菌体展示的方法来产生和筛选(参见例如美国专利No.5,223,409；Schlebusch等1997Hybridoma 16:47；在此引为参考)。简单来说，在该方法中，DNA序列被插入到丝状噬菌体例如M13的基因III或基因VIII基因中。已经开发了几种用于插入的带有多克隆位点的载体(McLafferty等，Gene128:29-36,1993；Scott和Smith,Science 249:386-390,1990；Smith和Scott,Methods Enzymol.217:228-257,1993)。插入的DNA序列可以随机产生，或可以是结合HE4a多肽的已知结合结构域的变异体。使用这种方法可容易地产生单链抗体。一般来说，插入片段编码6到20个氨基酸。插入序列编码的肽展示在噬菌体的表面上。表达了HE4a多肽的结合结构域的噬菌体通过与结合固定化的HE4a多肽来进行筛选，例如使用本技术领域中熟知的方法和本文公开的核酸编码序列制备的重组多肽。未结合的噬菌体通过清洗液除去，清洗液一般含有10mM Tris、1mM EDTA，并且不含盐或含有低浓度的盐。结合的噬菌体用例如含有盐的缓冲液洗脱。NaCl的浓度逐步增加，直到所有的噬菌体都被洗脱。一般来说，以较高亲和力结合的噬菌体将被较高的盐浓度所释出。将洗脱的噬菌体在细菌宿主中繁殖。可以进行附加轮次的筛选以选自几个高亲和力结合的噬菌体。然后测定结合的噬菌体中插入片段的DNA序列。一旦知道了结合肽的预测的氨基酸序列，就可以通过重组手段或合成来制备足够的在本文中用作特异性针对HE4a多肽的抗体的肽。当抗体以融合蛋白形式产生时使用重组的方法。肽也可以被产生成两个或多个相似的或不相似肽的串联排列，以最大化亲和力或结合。
为了检测与特异性针对HE4a多肽的抗体反应的抗原决定簇，检测试剂一般为抗体，它可以按照本文的描述制备。对于本技术领域的专业人员来说，使用抗体检测样品中的多肽已知有各种不同的分析方式，包括但不限于酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫荧光、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散以及其它的技术。参见例如Harlow和Lane,《抗体：实验室手册》Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988；Weir,D.M.,《实验免疫学手册》Handbook of Experimental Immunology,1986,Blackwell Scientific,Boston。例如，分析可以用Western印迹的方式进行，其中将来自生物样品的蛋白制备物进行凝胶电泳、转移到适当的膜上并使其与抗体反应。然后可以使用适合的检测试剂来检测膜上抗体的存在，这是本技术领域中熟知的并将在下面描述。
在另一个实施方案中，分析包括使用固定在固相支持物上的抗体来结合靶HE4a多肽并将其从其余的样品中取出。然后可以使用与独特的HE4a多肽抗原性决定簇反应的第二抗体，例如，含有可检测的报告部分的试剂，来检测结合的HE4a多肽。作为非限制性的例子，根据本实施方案，识别独特的抗原性决定簇的固定抗体和第二抗体可以是本文描述的选自单克隆抗体2H5、3D8和4H4的任何两种单克隆抗体。或者，可以使用竞争性分析，其中HE4a多肽用可检测的报告部分标记，并在将固定抗体与样品孵育之后令其与固定HE4a多肽特异性抗体结合。样品的成分对标记的多肽与抗体的结合的抑制程度表明了样品与固定抗体的反应性，因此表明了样品中HE4a的水平。
固相支持物可以是本领域的普通技术人员已知的可以结合抗体的任何材料，例如微量滴定板中的测试孔、硝酸纤维素滤膜或其它适合的膜。或者，支持物可以是珠子或圆盘，例如玻璃、纤维玻璃、胶乳或塑料例如聚苯乙烯或聚氯乙烯。抗体可以使用本技术领域中已知的各种不同的技术固定在固相支持物上，这些技术在专利和科学文献中有充分的描述。
在某些优选实施方案中，检测样品中HE4a抗原多肽的分析方法是双抗体夹心分析方法。该分析方法可以如下进行，首先将固定在固相支持物、通常为微量滴定板的孔上的HE4a多肽特异性抗体(例如单克隆抗体如2H5、3D8或4H4)与生物样品进行接触，从而使得样品中天然存在的并具有可与抗体反应的抗原性决定簇的可溶性分子与固定抗体结合(例如在室温下30分钟的孵育时间一般就足够了)以形成抗原-抗体复合物或免疫复合物。然后从固定的免疫复合物中除去未结合的样品组分。接下来，加入特异性针对HE4a抗原多肽的第二抗体，其中第二抗体的抗原结合位点不会竞争性地抑制固定的第一抗体的抗原结合位点与HE4a多肽(例如，与固定在固相支持物上的单克隆抗体不同的单克隆抗体例如2H5、3D8或4H4)的结合。第二抗体可以按照本文提供的方法可检测地标记，以便它可以被直接检测。或者，第二抗体可以通过使用可检测地标记的第二(或“第二阶段”)抗-抗体、或通过本文提供的特异性检测试剂间接地检测。本文所述的方法不限于任何特定的检测步骤，因为熟悉免疫分析的人员将会认识到，在双抗体夹心免疫分析中有大量的试剂和安排可用于免疫学检测特定的抗原(例如间皮素多肽)。
在使用上面描述的双抗体夹心分析的本文所公开方法的某些优选实施方案中，第一种特异性针对HE4a抗原多肽的固定抗体是多克隆抗体，第二种特异性针对HE4a抗原多肽的抗体是多克隆抗体。任何非竞争性HE4a抗体的组合都可以与本文所述的方法一起使用。包括单克隆抗体、多克隆抗体及其组合。在本文公开的方法的某些其它实施方案中，第一种特异性针对HE4a抗原多肽的固定抗体是单克隆抗体，第二种特异性针对HE4a抗原多肽的抗体是多克隆抗体。在本文所述方法的某些其它实施方案中，第一种特异性针对HE4a抗原多肽的固定抗体是多克隆抗体，第二种特异性针对HE4a抗原多肽的抗体是单克隆抗体。在本文所述方法的某些其它的高度优选实施方案中，第一种特异性针对HE4a抗原多肽的固定抗体是单克隆抗体，第二种特异性针对HE4a抗原多肽的抗体是单克隆抗体。例如，在这些实施方案中，应该注意的是本文提供的单克隆抗体2H5、3D8和4H4识别HE4a多肽上不同的和非竞争性的抗原性决定簇(例如表位)，因此这些单克隆抗体的任何成对组合都可以使用。在本文所述方法的其它优选实施方案中，第一种特异性针对HE4a抗原多肽的固定抗体和/或第二种特异性针对HE4a抗原多肽的抗体可以是本技术领域中已知的和本文提到的任何种类的抗体，作为说明性而非限制性的例子是Fab片段、F(ab')2片段、免疫球蛋白V区融合蛋白或单链抗体。熟悉本技术领域的人员将会认识到，本文公开的方法包含了在本文公开和要求权利的方法中其它的抗体形式、片段、衍生物等的应用。
在某些特别优选的实施方案中，第二抗体可以含有可检测的报告部分或标记例如酶、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团或生物素等。任何报告部分或标记都可以与本文所述方法一起使用，只要其信号与清洗后保留在支持物上的抗体的量直接相关或成比例就行。然后使用适合于特定的可检测的报告部分或标记的方法确定仍然结合在固相支持物上的第二抗体的量。对于放射活性基团来说，一般来说闪烁计数或放射自显影方法是适合的。可以使用各种偶联技术来制备抗体-酶偶联物(综述参见例如Scouten,W.H.,Methods in Enzymology135:30-65,1987)。光谱方法可用于检测染料(包括例如酶反应的比色产物)、发光基团和荧光基团。生物素可以使用与不同的报告基团(通常为放射活性或荧光基团或酶)偶联的亲和素或链亲和素来检测。酶报告基团一般可以通过加入底物(一般进行特定的时间段)，然后对反应产物进行光谱、分光光度法或其它分析来检测。标准品或标准添加物可用于使用众所周知的技术确定样品中抗原的水平。
在另一个实施方案中，本文所述方法包括使用本文提供的HE4a抗原多肽，通过检测来自生物来源或对象的生物样品中的免疫特异性反应性抗体来筛查恶性肿瘤病症的存在。根据本实施方案，HE4a抗原多肽(或其包含本文提供的截短的HE4a抗原多肽的片段或变异体)被可检测地标记，并与生物样品相接触，以检测样品中以可溶形式天然存在的抗体与HE4a抗原多肽的结合。例如，可以使用本文公开的序列配合众所周知的方法例如在体外翻译过程中掺入易于检测的(例如放射性标记的)氨基酸、或者通过使用其它可检测的报告部分例如在上面描述的那些，以生物合成来标记HE4a抗原多肽。不希望受到理论的束缚，本文所述方法的本实施方案考虑到了，本文公开的某些HE4a多肽例如HE4a融合多肽可以提供具有特定免疫原性的肽，因此产生了特异性的和可检测的抗体。例如，根据该理论，某些HE4a融合多肽可以代表能够唤起强烈的免疫反应的“非自身”抗原，而缺少融合结构域的HE4a多肽可能被免疫系统视为更类似“自身的”抗原，不容易引发体液或细胞介导的免疫。
正如上面注意到的那样，本文所述的方法部分涉及了令人吃惊的发现，即可溶形式的HE4a抗原多肽在对象中天然存在，包括在患有某些癌症的对象中这类可溶性的HE4a多肽的水平升高了。
根据本文公开的方法，筛查恶性肿瘤病症存在的方法可以通过在对象的生物样品中检测一个以上肿瘤相关标记物来进一步加强。因此，在某些实施方案中，本文所述方法提供了筛查的方法，该方法除了检测天然存在的可溶性样品成分与特异性针对HE4a抗原多肽的抗体的反应性之外，还包括了使用本技术领域中已知的和本文提供的已建立的方法检测至少一种恶性肿瘤病症的其它可溶性标记物。正如前面注意到的那样，目前有许多可溶性肿瘤相关抗原可以在容易获得的生物流体样品中检测到。例如，本文所述方法的某些实施方案涉及人类间皮素多肽，其包括多肽，例如新的可溶间皮素相关抗原(MRA)多肽，它们被描述在Scholler等(1999Proc.Nat.Acad.Sci.USA 96:11531)以及也描述在美国专利No.6,770,445中。
正如本文提供的那样，“间皮素多肽”是可溶性的多肽，具有含有多肽序列EVEKTACPSGKKAREIDES(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列，此外还具有至少一个与至少一种具有抗原结合位点的抗体具有反应性的抗原性决定簇，该抗体竞争性抑制MAb K-1(Chang等1996Proc.Nat.Acad.Sci.USA 93:136；MAb K-1可以从例如Signet Laboratories,Inc.,Dedham,Mass.获得)或在美国专利No.6,770,445中提供的单克隆抗体OV569、4H3、3G3或1A6的免疫特异性结合。
因此，这些可根据本文所述方法应用的额外的可溶性肿瘤相关抗原可以包括但不必限于间皮素和间皮素相关抗原、CEA、CA125、唾液酸化TN、SCC、TPS和PLAP(参见例如Bast等，1983N.Eng.J.Med.309:883；Lloyd等，1997Int.J.Canc.71:842；Sarandakou等，1997Acta Oncol.36:755；Sarandakou等，1998Eur.J.Gynaecol.Oncol.19:73；Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):2945；Kudoh等，1999Gynecol.Obstet.Invest.47:52；Ind等，1997Br.J.Obstet.Gynaecol.104:1024；Bell等，1998Br.J.Obstet.Gynaecol.105:1136；Cioffi等，1997Tumori 83:594；Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):2949；Meier等，1997Anticanc.Res.17(4B):3019)，还可以包括任何已知的标记物，所述标记物在生物样品中的存在可以与本文提供的至少一种恶性肿瘤病症的存在相关联。
或者，编码HE4a多肽的核酸序列可以使用标准的杂交和/或聚合酶链反应(PCR)技术来检测。本领域的普通技术人员可以根据本文提供的HE4a的cDNA序列来设计适合的探针和引物。分析一般来说可以使用从生物来源获得的各种样品中的任何一种来进行，这些生物来源例如真核细胞、细菌、病毒、从这些生物体制备的提取物以及在活生物体中发现的流体。
实施例
一般方法
在实施例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本技术领域中是众所周知的，描述在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.的《分子克隆：实验室手册》Molecular Cloning:A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,(1989)(Maniatis)和T.J.Silhavy,M.L.Bennan,和L.W.Enquist的《基因融合实验》Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1984)以及Ausubel,F.M.等的《分子生物学现代方法》Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版(1987)中。
缩写的意义如下："h"表示小时，"min"表示分钟，"sec"表示秒，"d"表示天，"mL"表示毫升，"L"表示升，"U"表示单位，"pM"表示皮摩尔。
现在将参考下面的实施例对本公开的主题进行描述。提供这些实施例的目的仅仅是为了说明，主题不限于这些实施例，而是应该包括明显是本文提供的指导的结果的所有变化。
实施例1
开发使用新的血清肿瘤标记物的多标记物分析方法用于检测卵巢癌
在美国，所有女性中有20％将被诊断出有附件肿块或囊肿，其中有一小部分表现为恶性。卵巢癌通过外科手术进行分期，研究显示，由妇科肿瘤医生进行手术的患者比由非妇科肿瘤医生进行手术的患者更常得到适当的分期和去除肿块。CA125肿瘤标记物可帮助预测哪些有骨盆肿块的患者可能患有卵巢癌。但是，许多良性妇科症状也能升高CA125，这降低了它的特异性。需要更精确的检测来帮助对这些患者进行分诊，以集中专门经验来治疗该疾病。本方法应用几种新的肿瘤标记物以开发了多标记物分析方法，用于预测卵巢癌的风险并帮助妇科肿瘤医生对有骨盆肿块的患者分诊。
现在描述在本实施例的实验中使用的方法。
这是一项IRB批准的前瞻性试验。在获得知情同意书后，从要接受附件肿块手术的女性中在手术前获得血清样品，并分析CA125、SMRP、HE4、CA72-4和骨桥蛋白的水平。所有的病理结果与肿瘤标记物进行了比较。对于每种单独的标记物以及这些标记物的所有组合估算了对数回归模型。进行交叉验证分析以获得在95％和98％特异性下的灵敏度。
现在描述从本实施例的实验获得的结果。
分析了179位患者：50例卵巢癌(14例I期)和129例良性卵巢肿块。在良性肿块和癌症之间HE4、SMRP、CA125和CA72-4的值都不相同。组合所有的标记物，HE4、SMRP和CA125保持有预测性，AUC为92％。当在95％的特异性下对所有可能的标记物组合进行比较时，CA125和HE4的组合具有最高的灵敏度，为74.5％。向CA125加入HE4将测试的灵敏度增加了7.4％。
这些数据概括在表1中。
表1
实施例2
下面是在本实施例中使用的方法。
血清和尿样经过同意后在手术前获得。尿液也从手术前没用的导管插入术样品中收集。收集30mL的全血样品和大于10mL的尿样。全血被收集在三个10mL的血清分离管(SST)中。将SST管离心、分离，在收集后3个小时内将上清液冷冻在-80℃。将10mL尿样收集到或转移到适当的用于运输和储存的试管中，也在收集的当天冷冻在-80℃。血清和尿样成批运送到Fujirebio诊断实验室进行检验和长期储存。分析了下列血清肿瘤标记物的水平：CA125、HE4、SMRP、CA72-4、激活素、抑制素和骨桥蛋白的水平以及尿SMRP。
手术后，对所有患者的病理报告进行浏览，并分类成良性或恶性。恶性肿瘤的组织学类型和良性疾病的具体诊断也被记录，所有患有卵巢癌的患者的疾病阶段也被记录。所有的肿瘤标记物与最终的病理学结果进行比较。如果合适，使用t-检验和卡方检验在患有良性疾病和患有癌症的患者之间比较平均值和中值。也进行了仅比较患有I期癌症患者和患有良性疾病患者的亚组分析。对于每种单独的标记物以及标记物的所有组合估算了对数回归模型。进行了交叉验证分析，以获得每个单独的标记物以及标记物的组合在90％、95％和98％特异性下的灵敏度。对于I期亚组也进行了灵敏度分析。
下面是本实施例的结果。
征集了244名有附件肿块的患者。排除了两位在手术前没有获得血清的女性和排除了7位被发现有远处的原发性癌症的转移癌的女性。因此235位患者对于分析来说是合格的。这些女性的病理学结果表明有69例卵巢癌(14例I期)和166例良性卵巢肿块。患有和未患有恶性肿瘤的患者的年龄分布显示在表2中，患有癌症的患者意料之内地比患有良性疾病的患者年龄大。
在患有良性疾病的女性中发现的准确诊断显示在表3中。最常见的诊断是良性囊腺瘤或囊腺纤维瘤，占患有良性疾病的女性的大约三分之一。卵巢癌的组织学和阶段分布显示在表4中。与卵巢癌的流行病学一致，大部分的女性(71％)有血清肿瘤并被发现患有III期疾病(67％)。
在良性肿块和癌症之间，HE4、SMRP、CA125、CA72-4、活化素和抑制素的平均值和中值都明显不同。骨桥蛋白的水平没有发现有明显的差别。该数据显示在表5中。
然后对于所有的个体标记物以及标记物组合计算了在90％、95％和98％特异性下的灵敏度如表6所示。CA125和HE4是最好的恶性肿瘤的个体预测因子。正如在表1.5中显示的那样，它们彼此之间不紧密相关，表明它们识别不同的疾病亚群。当对可能的标记物组合进行比较时，CA125和HE4的组合在特异性设置为95％时灵敏度最高，为77％。包含其它的标记物不明显地增加灵敏度。
表1.5
然后进行了仅比较患有I期疾病和患有良性疾病的患者的亚组分析。平均值和中值显示在表7中。在卵巢癌患者和良性疾病患者之间HE4、CA125和SMRP明显不同。在不同的特异性设置下灵敏度显示在表8中。HE4是最灵敏的单个标记物，在95％特异性下灵敏度为50％。加入CA125或任何其它的标记物，没有明显地增加检测I期疾病的灵敏度。
表2
表3
表4
表5
表6
表7
表8
实施例3
下面是本实施例中使用的方法。
数据从两个研究机构进行的两项独立的IRB批准的前瞻性试验获得。在获得知情同意书之后，从要接受附件肿块外科手术的女性中在手术前获得血清样品，并分析CA125、SMRP、HE4和CA72-4的水平。所有的病理结果与肿瘤标记物进行了比较。对于每种单独的标记物以及所有2、3和4种标记物的组合使用对数回归确定了90％、95％和98％的设定特异性下的灵敏度。
下面是本实施例的结果。
分析了448份样品。其中有267例良性病例和181例卵巢癌(27例I期、20例II期、115例III期和19例IV期)。在良性肿块和癌症之间HE4、SMRP、CA125和CA72-4的中值都明显不同(p<0.001)。在良性肿块和I期恶性肿瘤的鉴别中，在CA125中加入HE4在90％的特异性下将灵敏度增加了22.2％。HE4和CA125的组合对于所有的阶段都优于单独使用HE4或CA125(p<0.003)。这里的结果概述在表9中。
表9
在本文中引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此以其全文引为参考。
尽管已经参考具体的实施方案公开了本发明的主题，但是显然本技术领域的其它专业人员可以设计出其它的实施方案和变化，而不背离本文描述的主题的真实精神和范围。权利要求包含了所有这样的实施方案和等同的变化。