以HOXB9和PBX1作为生物标志物的胃癌检测试剂盒及应用的制作方法

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种以HOXB9和PBX1作为生物标志物的胃癌检测试剂盒及应用。

背景技术：

胃癌是消化道常见的恶性肿瘤，其发病率占全球每年新发肿瘤第四位，死亡率高居第二位。胃癌诊断和治疗方案的制定有赖于病理和分子病理诊断结果。分子病理可借助免疫组化检测技术，为胃癌的诊断、鉴别诊断、分型分期、化疗、靶向治疗和预后提供依据。免疫组化技术是利用标记的特异性抗体对组织细胞内肿瘤相关抗原的表达量和分布进行原位检测的技术。目前，已知有10多种胃癌相关标志物免疫组化指标应用于临床。

由于胃癌的发病机制不明，现有的胃癌相关标志物临床判断胃癌的生长及预后效果欠佳。每个胃癌标志物检测需要至少一张切片，对组织消耗量大，无法判断标志物间彼此相关性，准确度不高。

技术实现要素：

为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供HOXB9和PBX1联合作为胃癌生物标志物在制备或筛选胃癌检测试剂中的用途。

本发明的另一目的在于提供一种以HOXB9和PBX1联合作为生物标志物的胃癌检测试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种检测胃癌的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一方面，提供了HOXB9和PBX1联合作为胃癌生物标志物在制备或筛选胃癌检测试剂中的用途。

优选地，所述HOXB9和PBX1联合作为胃癌组织生物标志物。

优选地，所述胃癌检测试剂以HOXB9和PBX1联合作为检测对象。

优选地，所述胃癌检测试剂中，含有HOXB9和PBX1联合作为标准品或阳性对照。

所述标准品或阳性对照，用于检测样本组织中的HOXB9和PBX1含量。

将HOXB9和PBX1联合作为胃癌生物标志物用于筛选胃癌检测试剂，是指将HOXB9与PBX1作为靶标应用于胃癌检测试剂的筛选。在一优选例中，基于所述的HOXB9与PBX1，筛选特异性识别HOXB9的试剂和特异性识别PBX1的试剂，从而作为检测胃癌的试剂，来检测样本组织中的HOXB9与PBX1水平。

在一优选例中，基于所述的HOXB9与PBX1，筛选特异性识别HOXB9的抗体和特异性识别PBX1的抗体，从而作为从而作为检测胃癌的试剂。

优选地，所述胃癌检测试剂中，含有特异性识别HOXB9的试剂和特异性识别PBX1的试剂。

优选地，所述胃癌检测试剂用于胃癌的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。

本发明的第二方面，提供了特异性识别HOXB9的试剂和特异性识别PBX1的试剂在制备胃癌检测试剂盒中的用途。

在一优选例中，特异性识别HOXB9的试剂选自特异性识别HOXB9的抗体。特异性识别PBX1的试剂选自特异性识别PBX1的抗体。

所述抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。

本发明的第三方面，提供一种胃癌检测试剂盒，包括特异性识别HOXB9的试剂和特异性识别PBX1的试剂。

优选地，所述胃癌检测试剂盒以HOXB9和PBX1作为胃癌生物标志物。

优选地，所述胃癌检测试剂盒以HOXB9和PBX1作为检测对象。

在一优选例中，特异性识别HOXB9的试剂选自特异性识别HOXB9的抗体。特异性识别PBX1的试剂选自特异性识别PBX1的抗体。

所述抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。

在一优选例中，特异性识别HOXB9的抗体包括用于检测HOXB9的第一抗体和用于检测所述第一抗体的第二抗体。特异性识别PBX1的抗体包括用于检测PBX1的第一抗体和和用于检测所述第一抗体的第二抗体。

进一步地，所述第二抗体为荧光分子标记的第二抗体。

在一优选例中，所述的试剂盒中还包括免疫荧光染色技术常用的试剂，免疫荧光染色技术常用的试剂包括：福尔马林固定液、石蜡、二甲苯、柠檬酸钠、封闭液中的一种或多种。

在一优选例中，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照。所述阳性对照包括HOXB9和PBX1。所述阴性对照包括ddH₂O。

优选地，所述胃癌检测试剂盒用于胃癌的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。

在本发明的第四方面，提供了一种检测胃癌的方法，包括检测样本组织中HOXB9和PBX1的水平。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明基于发明人研究成果，通过检测两个新发现且彼此关联的胃癌标志物，更准确的判断胃癌的生长及预后；通过免疫荧光双染法，精确判断标志物间彼此关系，节约组织消耗量。HOXB9和PBX1同时作为新的胃癌标志物，可为胃癌的分子病理诊断提供依据。在胃癌组织细胞原位同时观察胃癌标志物HOXB9和PBX1的表达，易于观察评价两者之间的相关性。一张切片上同时检测两个相关的胃癌标志物，有助于节约标本用量，可应用于胃镜等取材较少的检测。

采用本发明的检测试剂盒对组织样本中的HOXB9和PBX1进行联合检测，从而诊断和检测胃癌，检测结果灵敏度好，特异性高。可有效用于胃癌的早期筛查和/或预后评估，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1：左图表示HOXB9在正常组织中高表达，右图表示HOXB9在胃癌组织中低表达。

图2：左图表示PBX1在正常组织中低表达，右图表示PBX1在胃癌组织中高表达。

图3：HOXB9和PBX1的表达在胃癌组织中的相关性。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECμLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECμLAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECμLAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

术语、缩略语

qRT-PCR：quantitative real-time polymerase chain reaction，实时荧光定量PCR

灵敏度：即真阳性率，真阳性与真阳性+假阴性的比例。

特异性：即真阴性率，真阴性与真阴性+假阳性的比例。

实施例1.通过免疫荧光双染法对胃癌组织内HOXB9和PBX1的表达水平和部位进行检测

一、本实施例通过免疫荧光双染法对胃癌组织内HOXB9和PBX1的表达水平和部位进行检测，步骤如下：

(1)胃镜取材或手术切除胃癌组织，常规10％福尔马林固定，石蜡包埋，5mm切片。

(2)烤片：60摄氏度，1小时。

(3)脱腊：二甲苯溶液I中15分钟，二甲苯溶液II中15分钟，无水乙醇I中5分钟，无水乙醇II中5分钟，90％乙醇I中5分钟，90％乙醇II中5分钟，70％乙醇中5分钟，双蒸水洗2次。

(4)抗原修复：高压修复法，加入0.01mol/L柠檬酸钠(Ph 6.0)，加热10分钟后缓慢冷却至室温。

(5)封闭：加10％正常驴血清，室温孵育封闭30分钟。

(6)加一抗：滴加含小鼠抗HOXB9和大鼠抗PBX1的一抗抗体，4度孵育过夜，PBS震荡洗涤3遍。

(7)加二抗：滴加FITC和APC标记的兔血清来源的二抗，室温孵育1小时，PBS震荡洗涤3遍。

(8)将盖玻片放于纸巾上，滴加Gelvatol一滴于盖玻片中央。翻过载玻片于盖玻片上，用铝箔避光放置30分钟。

(9)显微镜下观察。

二、本实施例首次发现：在胃癌组织中，HOXB9和PBX1的表达水平与胃癌生长和淋巴转移密切相关；HOXB9和PBX1之间有负相关性：

(1)如表1和图1所示，HOXB9在正常胃粘膜组织中表达较高，而胃癌组织中表达水平降低。

表1：HOXB9表达水平降低可导致胃癌生长及淋巴转移密切

(2)如图2和表2所示，PBX1在正常胃粘膜组织中表达较低，而胃癌组织中表达水平升高：

表2：PBX1表达水平升高可导致胃癌生长及淋巴转移密切

(3)如图3所示，HOXB9和PBX1的表达在胃癌组织中的相关性：HOXB9表达降低时，PBX1的表达水平会升高，两者之间为负相关性。

实施例2.以HOXB9和PBX1作为生物标志物的胃癌检测试剂盒的构建及应用

本实施例构建以HOXB9和PBX1作为生物标志物的胃癌检测试剂盒，所述试剂盒包括：用于检测HOXB9的试剂和用于检测PBX1的试剂。用于检测HOXB9的试剂包括用于检测HOXB9的第一抗体和用于检测所述第一抗体的第二抗体。用于检测PBX1的试剂包括用于检测PBX1的第一抗体和用于检测所述第一抗体的第二抗体。

具体地，本实施例的胃癌检测试剂盒通过免疫荧光双染法对胃癌组织内HOXB9和PBX1的表达水平进行检测。用于检测HOXB9的第一抗体采用小鼠源HOXB9抗体，用于检测所述第一抗体的第二抗体采用FITC标记的兔源抗体。用于检测PBX1的第一抗体采用大鼠源PBX1抗体，用于检测所述第一抗体的第二抗体采用APC标记的兔源抗体。

采用构建好的以HOXB9和PBX1作为生物标志物的胃癌检测试剂盒，参照实施例1的方法，检测100个临床样本，以判断是否为胃癌样本以及是否有淋巴转移。

以样本中：HOXB9表达量和PBX1表达量的比值作为诊断指标，当HOXB9表达量和PBX1表达量的比值<1(荧光信号以PBX1占主导)算为胃癌阳性样本；当HOXB9表达量和PBX1表达量的比值>1(荧光信号以HOXB9占主导)作为胃癌阴性样本。

其中，43个样本算为胃癌阳性样本；57个样本算为阴性样本。

本实例首次发现，在胃癌组织中同时检测HOXB9和PBX1，并以HOXB9表达量和PBX1表达量的比值作为诊断指标，在没有明显降低灵敏度的同时显著增加了特异性，见表3：

表3：HOXB9和PBX1三种检测方式灵敏度和特异性的比较

综上所述，采用本发明的检测试剂盒对组织样本中的HOXB9和PBX1进行联合检测，从而诊断和检测胃癌，检测结果灵敏度好，特异性高。可有效用于胃癌的早期筛查和/或预后评估，具有良好的临床应用前景。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。