本发明涉及利用生物敏感标志物检测水体污染，更具体地说，本发明涉及一种利用鱼的GPX活性检测水体污染程度的方法。
背景技术：
随着城镇化和工农业的迅猛发展，水体污染日益加剧。水域中的水体污染物也各有不同，有的为单一污染物，也有多种污染物混合污染。对于未知水域中，不管是单一污染物的污染，还是多种污染物的污染，怎样获悉水体是否被污染，甚至知道其污染程度，并能直观判断该水域的污染对生物的危害已达到何种程度。对于水体中受到重金属或菲一种或两种污染时，用化学方法可以定性、定量检测到污染，但是无法检测其危害性和危害程度以及污染程度的准确性。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的就是提供一种利用鱼的GPX活性检测水体污染程度的方法，本方法利用鱼的GPX作为敏感生物标记物，可敏感地监测多氯联苯污染的污染程度和危害程度，还可以敏感检测菲(Phe)等多环芳烃污染的污染程度和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。
为了实现根据本发明的这些目的和其他优点，提供了一种利用鱼的GPX活性检测水体污染程度的方法。本检测方法为获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的GPX作为敏感生物标记物。其中，GPX为谷胱甘肽过氧化物酶的简写。
优选的是，所述鱼的GPX活性与水体中菲的浓度呈负相关。
优选的是，所述鱼的GPX活性与水体中多氯联苯的浓度呈负相关。
优选的是，建立鱼的GPX活性与污染物浓度关系的标准曲线，然后将待检测水域中的同种同大小的鱼的GPX活性与所述标准曲线比对，得到待检测水域中水体污染物浓度。
优选的是，所述标准曲线为鱼的GPX活性与菲浓度关系的曲线，或者鱼的GPX活性与多氯联苯浓度关系的曲线。
优选的是，所述鱼的GPX活性测定包括如下步骤：
步骤一、待测样本处理：制备全鱼匀浆，然后离心分层，取上层清液为待测样本；
步骤二、待测样本蛋白浓度的测定：分别将等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本加入1、2、3号管中，并分别向各管加入等量的考马斯亮蓝显色剂，分别混匀，静置，预热，用分光光度计并用双蒸水调零后，于1cm光径，在波长595nm处，测定1、2、3号管中物质的光密度(OD)，分别记为1号OD值，2号OD值，3号OD值，然后代入如下公式计算得待测样本蛋白浓度：
步骤三、酶促反应：使用谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒进行测定，分别在对照管和测定管中加入0.2mL浓度为1mmol/L的谷胱甘肽(GSH)，只在测定管中加入0.2mL待测样本，然后将所述对照管和测定管置于37℃水浴预温5分钟后，分别各加入试剂一应用液0.1mL，于37℃反应2.5-5分钟，再分别各加入试剂二应用液2mL，只在对照管中加入待测样本0.2mL，然后分别混匀，用冷冻离心机，1000g，4℃，离心10分钟，分别取上清液稀释n倍作显示反应；
步骤四、显色反应：在空白管中加入1mL浓度为1mmol/L的GSH,在标准管中加入1mL浓度为20umol/L的GSH标准品应用液，在对照管中是其稀释n倍的上清液1mL，在测定管中是其稀释n倍的上清液1mL，然后分别在空白管、标准管、对照管和测定管中各加入试剂三应用液1mL，试剂四应用液0.25mL和试剂五应用液0.05mL，然后分别混匀，室温静置5-10分钟，于412nm处，用1cm光环比色杯和双蒸水调零后，测各管OD值，分别记为空白管OD值，标准管OD值，对照管OD值和测定管OD值，然后代入如下公式计算得鱼的谷胱甘肽过氧化物酶活性：
优选的是，所述步骤一中全鱼匀浆为全鱼与浓度0.65％的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，且所述离心分层用冷冻离心机，11028g，4℃，离心10min。
优选的是，所述步骤二中等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本均为0.05ml，蛋白标准品的浓度为0.563g/L，分别加入考马斯亮蓝显色剂的量均为3ml，静置10min；所述步骤三中反应时间为2.5分钟，稀释倍数n＝5；所述步骤四中室温静置10分钟。
优选的是，所述鱼为海水青鳉或淡水青鳉。
本发明至少包括以下有益效果：本发明以水域中鱼的GPX作为敏感生物标记物，通过对比GPX活性就可以检测出水体是否受到污染，不但检测准确和敏感，而且直观反映该水域的污染对生物的危害程度。特别是鱼的GPX活性与水体中菲或多氯联苯的一种或一种以上的浓度均呈负相关，所以检测到鱼的GPX活性越低，其的水域受污染的程度越大，并且明示受到菲或多氯联苯的一种或一种以上的污染。通过建立鱼的GPX活性与菲浓度关系的曲线，或者鱼的GPX活性与多氯联苯浓度关系的曲线，可以将待检测水域中与建立标准曲线同种同大小的鱼的GPX活性比对，获得水域中菲或多氯联苯浓度或综合污染浓度值，并且能反映出目前的污染程度对生物是否在安全范围或受到危害。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书能够据以实施。
实施例1
本方案利用鱼的GPX活性检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的GPX作为敏感生物标记物，通过检测鱼的GPX活性，然后比对同类同大小的鱼的GPX活性与某污染物浓度关系的标准曲线，就可以检测出水体是否受到某污染物的污染，不但检测准确，且敏感度高，而且能直观反映该水域的某污染物的污染程度及其对生物的危害程度。
实施例2
本方案利用鱼的GPX活性检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的GPX作为敏感生物标记物，根据鱼的GPX活性与水体中菲(Phe)等多环芳烃的浓度呈负相关，通过测定鱼的GPX活性，然后比对同类同大小的鱼的GPX活性与菲浓度关系的标准曲线，如果检测样本鱼的GPX活性比正常情况下的同类同大小的鱼的GPX活性低，则判断水域受到菲的污染；如果比正常情况下的同类同大小的鱼的GPX活性越低，则判断水域的菲污染越严重，甚至可判断是否达到危害水体生物的程度。
实施例3
本方案利用鱼的GPX活性检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的GPX作为敏感生物标记物，根据鱼的GPX活性与水体中多氯联苯的浓度呈负相关，通过测定鱼的GPX活性，然后比对与建立标准曲线的鱼同类同大小的鱼的GPX活性与多氯联苯浓度关系的标准曲线，如果检测样本鱼的GPX活性比正常情况下的同类同大小的鱼的GPX活性低，则判断水域受到多氯联苯的污染；如果比正常情况下的同类同大小的鱼的GPX活性越低，则判断水域的多氯联苯污染越严重，甚至可判断是否达到危害水体生物的程度。
实施例4
本方案利用鱼的GPX活性检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的GPX作为敏感生物标记物。首先通过实验建立鱼的GPX活性与某污染物浓度关系的标准曲线，然后将待检测水域中的同种同大小的鱼的GPX活性与所述标准曲线比对，得到待检测水域中某污染物的浓度。
通过实验建立鱼的GPX活性与菲(Phe)浓度关系的标准曲线如下：
本实验的检测样本以海水青鳉为例，分5组，每组3个平行进行养鱼实验，实验结束每个平行取3尾鱼样品测定，每组测定3x3＝9个数据，将每组9个数据数理统计后得到每组鱼的GPX活性大小。各组菲浓度分别为0、250、500、750、1000μg/L，养殖条件是盐度30±2，水温为28±2℃，pH为8.10，溶氧量≥6.10mg/L，光暗比为14h:10h，各组实验操作均相同。每天三次投喂饲料，总投喂量为投喂时鱼体湿重的5％。每天仔细观察和记录仔稚鱼活动、摄食、畸形、死亡等，并跟踪检测水体和鱼体菲的变化，7天后随机采集鱼样品，分别称重，存于-80℃冰箱中(暂存待测)用于分子、基因、生理、毒理和生化测定。测定并经数理统计的各组GPX活性分别是：85.870、52.804、35.697、28.583、11.334U/mgprot。海水青鳉的GPX活性与水体中菲(Phe)的浓度呈负相关，然后根据实验结果绘制标准曲线。
通过实验建立鱼的GPX与多氯联苯(PCB)浓度关系的标准曲线如下：
本实验的检测样本以海水青鳉为例，分6组，每组3个平行进行养鱼实验，实验结束每个平行取3尾鱼样品测定，每组测定3x3＝9个数据，将每组9个数据数理统计后得到每组鱼的GPX活性大小。各组多氯联苯浓度分别为0、50、100、150、200、250μg/L，养殖条件是盐度30±2，水温为28±2℃，pH为8.10，溶氧量≥6.10mg/L，光暗比为14h:10h，各组实验操作均相同。每天三次投喂饲料，总投喂量为投喂时鱼体湿重的5％。每天仔细观察和记录仔稚鱼活动、摄食、畸形、死亡等，并跟踪检测水体和鱼体多氯联苯的变化，7天后随机采集鱼样品，分别称重，存于-80℃冰箱中(便于长期有效保存)用于分子、基因、生理、毒理和生化测定。测定并经数理统计的各组GPX活性分别是：79.405、63.073、59.506、50.728、37.959、38.203U/mgprot。海水青鳉的GPX与水体中多氯联苯(PCB)的浓度呈负相关，然后根据实验结果绘制标准曲线。
测定待测水域中的海水青鳉的GPX活性的具体步骤如下：
步骤一、待测样本处理：制备全鱼匀浆，然后离心分层，取上层清液为待测样本；
步骤二、待测样本蛋白浓度的测定：分别将等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本加入1、2、3号管中，并分别向各管加入等量的考马斯亮蓝显色剂，分别混匀，静置，预热，用分光光度计并用双蒸水调零后，于1cm光径，在波长595nm处，测定1、2、3号管中物质的光密度(OD)，分别记为1号OD值，2号OD值，3号OD值，然后代入如下公式计算得待测样本蛋白浓度：
步骤三、酶促反应：使用谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)测定试剂盒进行测定，分别在对照管和测定管中加入0.2mL浓度为1mmol/L的谷胱甘肽(GSH)，只在测定管中加入0.2mL待测样本，然后将所述对照管和测定管置于37℃水浴预温5分钟后分别各加入试剂一应用液0.1mL，于37℃反应时间5分钟，再分别各加入试剂二应用液2mL，只在对照管中加入待测样本0.2mL，然后分别混匀，用冷冻离心机，1000g，4℃，离心10分钟，分别取上清液稀释5倍作显示反应；
步骤四、显色反应：在空白管中加入1mL浓度为1mmol/L的GSH,在标准管中加入1mL浓度为20umol/L的GSH标准品应用液，在对照管中是其稀释n倍的上清液1mL，在测定管中是其稀释5倍的上清液1mL，然后分别在空白管、标准管、对照管和测定管中各加入试剂三应用液1mL，试剂四应用液0.25mL和试剂五应用液0.05mL，然后分别混匀，室温静置5分钟，于412nm处，用1cm光环比色杯和双蒸水调零后，测各管OD值，分别记为空白管OD值，标准管OD值，对照管OD值和测定管OD值，然后代入如下公式计算得鱼的GPX活性：
然后将计算得海水青鳉的GPX活性大小与标准曲线比对，不但可以知道水体是否受到污染，而且从标准曲线中可以知道水体中菲浓度的大小或多氯联苯浓度大小或综合污染的大小，更能知道水体对生物体危害程度。
实施例5
利用实验可以建立任何水体任何鱼种的鱼的GPX活性与多氯联苯浓度关系的标准曲线，或者建立不同种类的鱼的GPX活性与菲浓度的标准曲线，然后取待测水域中的鱼做样本，只要做样本的鱼与建立标准曲线的鱼是同类同大小的即可进行比对。
测定待测水域中的鱼的GPX活性具体步骤如下：
步骤一、待测样本处理：取与建立标准曲线用鱼一样和大小相当的鱼制备全鱼匀浆，全鱼匀浆为全鱼与0.65％浓度的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，然后用冷冻离心机，11028g，4℃，离心10min分层，取上层清液为待测样本；
步骤二、待测样本蛋白浓度的测定：分别将等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本加入1、2、3号管中，并分别向各管加入等量的考马斯亮蓝显色剂，分别混匀，静置，预热，用分光光度计并用双蒸水调零后，于1cm光径，在波长595nm处，测定1、2、3号管中物质的光密度(OD)，分别记为1号OD值，2号OD值，3号OD值，然后代入如下公式计算得待测样本蛋白浓度：
步骤三、酶促反应：使用谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒进行测定，分别在对照管和测定管中加入0.2mL浓度为1mmol/L的GSH，只在测定管中加入0.2mL待测样本，然后将所述对照管和测定管置于37℃水浴预温5分钟后分别各加入试剂一应用液0.1mL，于37℃反应4分钟，再分别各加入试剂二应用液2mL，只在对照管中加入待测样本0.2mL，然后分别混匀，用冷冻离心机，1000g，4℃，离心10分钟，分别取上清液稀释4倍作显示反应；
步骤四、显色反应：在空白管中加入1mL浓度为1mmol/L的GSH,在标准管中加入1mL浓度为20umol/L的GSH标准品应用液，在对照管中是其稀释n倍的上清液1mL，在测定管中是其稀释4倍的上清液1mL，然后分别在空白管、标准管、对照管和测定管中各加入试剂三应用液1mL，试剂四应用液0.25mL和试剂五应用液0.05mL，然后分别混匀，室温静置10分钟，于412nm处，用1cm光环比色杯和双蒸水调零后，测各管OD值，分别记为空白管OD值，标准管OD值，对照管OD值和测定管OD值，然后代入如下公式计算得鱼的谷胱甘肽过氧化物酶活性：
将计算得鱼的GPX活性大小与标准曲线比对，不但可以知道水体是否受污染，而且从标准曲线中可以知道水体中多氯联苯浓度或菲浓度的大小或综合污染的大小，更能知道水体对生物体危害程度。
实施例6
利用实验建立20日龄的淡水青鳉的GPX活性与多氯联苯浓度关系的标准曲线和GPX活性与菲浓度的标准曲线，然后取待测水域中的鱼做样本，只要取得样本的鱼与建立标准曲线的鱼是同类同大小的即可进行比对。
取得待测水域中20日龄的淡水青鳉做样本，然后测定待测水域中的该鱼的GPX活性具体步骤如下：
步骤一、待测样本处理：取与建立标准曲线用鱼一样和大小相当的鱼制备全鱼匀浆，全鱼匀浆为全鱼与0.65％浓度的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，然后用冷冻离心机，11028g，4℃，离心10min分层，取上层清液为待测样本；
步骤二、待测样本蛋白浓度的测定：分别将双蒸水、浓度为0.563g/L的蛋白标准品和待测样本各0.05ml加入1、2、3号管中，并分别向各管加入考马斯亮蓝显色剂3ml，分别混匀，静置10min，预热到35℃，预热待用分光光度计并用双蒸水调零后，于1cm光径，波长595nm处，测定1、2、3号管中溶液的光密度，分别记为1号OD值，2号OD值，3号OD值，然后代入如下公式计算得待测样本蛋白浓度：
步骤三、酶促反应：使用GPX测定试剂盒进行测定，分别在对照管和测定管中加入0.2mL浓度为1mmol/L的GSH，只在测定管中加入0.2mL待测样本，然后将所述对照管和测定管置于37℃水浴预温5分钟后分别各加入试剂一应用液0.1mL，于37℃反应2.5分钟，再分别各加入试剂二应用液2mL，只在对照管中加入待测样本0.2mL，然后分别混匀，用相对离心力为1225g，离心10分钟，分别取上清液稀释5倍作显示反应；
步骤四、显色反应：在空白管中加入1mL浓度为1mmol/L的GSH,在标准管中加入1mL浓度为20umol/L的GSH标准品应用液，在对照管中是其稀释n倍的上清液1mL，在测定管中是其稀释5倍的上清液1mL，然后分别在空白管、标准管、对照管和测定管中各加入试剂三应用液1mL，试剂四应用液0.25mL和试剂五应用液0.05mL，然后分别混匀，室温静置5分钟，于412nm处，用1cm光环比色杯和双蒸水调零后，测各管OD值，分别记为空白管OD值，标准管OD值，对照管OD值和测定管OD值，然后代入如下公式计算得鱼的GPX活性为45.500U/mgprot：
将计算得鱼的GPX活性大小与GPX活性与菲浓度的标准曲线，以及GPX活性与多氯联苯浓度的标准曲线分别比对，得到待测水域的菲浓度为194μg/L，多氯联苯浓度为173μg/L，这样既可以知道水体已受到污染，而且从标准曲线中可以知道水体中菲或多氯联苯浓度的大小，更能知道水体对生物体危害程度。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列应用范例，它完全适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地改作他用，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。