纸基电化学发光转化器的制备及在癌胚抗原检测中的应用的制作方法

本发明涉及一种电化学发光分析检测技术领域，更具体地说是一种以适合于电化学发光分析的三维纸基转化器的制备。

背景技术：

正常细胞在致癌因素作用下，细胞内基因会发生改变，细胞的生长调控也因此发生改变，进而会导致单克隆性异常增生，引起正常细胞的癌变。近几年来，癌症发病率以及死亡率日增不减，人们对其充满着恐惧与担忧，因此，癌症的早期预警成为科研工作者的重大研究目标。

肿瘤标志物，是一类反应肿瘤存在与否的物质，其存在和量变可以提供肿瘤的性质，因此，肿瘤标志物的检测在基础医疗研究领域以及在临床诊断中发挥着重要作用。目前，肿瘤标志物的检测方法主要有：荧光方法、化学发光方法、表面等离子体共振法、电化学方法以及电化学发光方法等。电化学发光方法是电化学方法和化学发光方法有效结合产生的一种方法，它具有灵敏度高、线性范围宽以及操作简单等特点。目前肿瘤标志物识别包含适配体、肽类以及蛋白质。由于筛选与肿瘤标志物相关的特异性的适配体和肽类过程中存在很多困难，因此，抗体成为肿瘤标志物中常用的识别元素。通常采用抗体作为识别元素所构建的体系导电性能不佳以及测试过程中信号放大方式有限使得测试灵敏度较低，因此急需寻找和建立一种新的研究手段来提高肿瘤标志物检测的灵敏度，扩大其检测范围。

分子转化技术通常应用于核酸的检测中，也就是将输入的目标DNA或RNA信号转化为特定的单链DNA的输出，通过测定分子转化过程中相应信号的改变，来实现目标物的检测。此种研究方法具有测定结果准确度高，线性范围宽等优点。

为了解决蛋白质检测过程中存在的导电性差且缺少特定的目标识别元素的问题，进一步扩大肿瘤标志物的检出限，我们将分子转化技术引入到肿瘤标志物的检测中，将输入的蛋白质信号转化为输出的适配体链的信号，同时联合纸芯片的廉价、便于携带、易于修饰等特点，借助电化学发光手段实现低浓度肿瘤标志物的检测。

技术实现要素：

针对目前存在的问题，本发明制作了一种低成本便携式的纸基电化学发光转化器并将其应用到肿瘤标志物的检测中。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：一种纸基电化学发光转化器的制备及在癌胚抗原检测中的应用，其特征是包括以下步骤：

(1)在计算机上设计如附图1和附图2所示的纸基电化学发光转化器的疏水蜡批量打印图案，分别定义为纸芯片1和纸芯片2；

(2)利用蜡打印机在A4大小的纸芯片1和纸芯片2上打印上疏水蜡批量图案，随后将打印有疏水蜡批量图案的纸芯片放置到烘箱中加热直至蜡融化，使其在纸芯片上形成疏水区域；

(3)采用丝网印刷的方法将参比电极、对电极印刷图案依次印刷到步骤(2)中所得纸芯片1的正面左侧亲水区域上，样式如附图3所示，其中正面右侧为亲水的工作区，正面左侧为参比区，纸芯片1的正面右侧工作区的反面印有工作电极，样式如附图4所示；

(4)对纸芯片2的亲水区域功能化，在纸芯片上完成由蛋白质输入信号转化为特定适配体链输出信号的转变；

(5)对纸芯片1的亲水区域功能化，完成由特定适配体链引发的电化学发光信号的变化，实现癌胚抗原的检测，实验步骤如附图5所示。

步骤（4）中所述对纸芯片2的亲水区域功能化，在纸芯片上完成由蛋白质输入信号转化为特定适配体链输出信号的转变，其特征在于：

首先在纸芯片上生长Au纳米花：在纸芯片上重复三次滴加Au纳米粒子的种子溶液，等待干燥后，将15 µL 1%的HAuCl₄和15µL 20 mM的抗坏血酸混合，立即滴加到纸芯片表面，待反应完成后，去离子水冲洗电极表面，室温下干燥即可；其次，将适配体链固定在电极表面：将5 µL修饰有一抗的适配体序列，定义为S0，其碱基序列如核苷酸序列表所示，其中，其5’端修饰上巯基，其3’端修饰上羧基，固定在亲水区域，将5 µL另一适配体序列，定义为S1，其碱基序列如核苷酸序列表所示，其中，其3’端修饰上六个亚甲基以及巯基，固定在亲水区域，室温下孵育20 min，随后用巯基己醇封锁活性位点，然后再向电极表面滴加与S1碱基互补配对的适配体链，定义为S2，其碱基序列如核苷酸序列表所示；最后将目标抗原，也就是癌胚抗原连接在电极表面，引发分子转化反应：向电极表面滴加不同浓度的癌胚抗原，室温下孵育40 min，而后向电极表面滴加二抗功能化的适配体链，定义为S3，其碱基序列如核苷酸序列表所示，其中，其3’端修饰上氨基，室温下反应50 min。

步骤（5）中所述对纸芯片1的亲水区域功能化，完成由特定适配体链引发的电化学发光信号的变化，实现癌胚抗原的检测，其特征在于：

首先在纸芯片上生长Pt纳米粒子层：向纸芯片1的亲水区域上重复三次滴加Pt纳米粒子，室温下干燥后，将20 mM的NaBH₄和200 mM的H₂PtCl₆等体积混合后，快速滴加到电极表面，等待反应完成后，用二次水冲洗电极表面；其次将多巴胺修饰的适配体链连接到电极表面：将5 µL适配体链，定义为S4，其碱基序列如核苷酸序列表所示，其中，其5’端修饰上巯基，固定在亲水区域，随后用巯基己醇封锁活性位点，而后将纸芯片2放置到纸芯片1上，两纸芯片亲水区域上下重叠且紧密接触，向纸芯片2亲水的工作区域内滴加10 µL二次水，将纸芯片2亲水的工作区域内通过分子转化法置换出来的适配体链转移到纸芯片1的工作区域内，随后将两纸芯片分开，向纸芯片1的工作区域上滴加30 µL多巴胺功能化的适配体链，定义为S5，其碱基序列如核苷酸序列表所示，其中，其5’端修饰上羧基，室温下反应20 min；最后测定鲁米诺的发光强度，实现癌胚抗原的检测：将纸芯片2折叠，向工作区域上滴加40 µL含有发光试剂鲁米诺和H₂O₂的磷酸盐电解液，连接电化学工作站，测定鲁米诺的发光强度，绘制鲁米诺与癌胚抗原浓度关系曲线，完成癌胚抗原的检测。

本发明的有益效果

（1）分子转化法与纸基检测平台相结合，使得目标物的检测具有所需费用低且测定结果准确度高的特点。

（2）功能化纸芯片作为电化学发光检测基底，具有易于功能化、活性位点多、导电性能好的特点。

（3）整个纸基电化学发光转化器制备过程简单，便于携带且灵敏度高，有望实现癌胚抗原的早期预警。

附图说明

图1：纸芯片1的疏水蜡批量打印图案；

图2：纸芯片2的疏水蜡批量打印图案；

图3：纸芯片1的正面丝网印刷上参比电极和对电极后所得纸芯片示意图；

图4：纸芯片1反面的亲水区，也就是图3中工作区的反面区域上丝网印刷上工作电极后所得纸芯片示意图；

图5：实验操作步骤示意图，其中，a代表工作区域上生长Pt纳米粒子；b代表工作区域上生长花状Au纳米粒子；c代表一抗修饰的S0; d代表二抗修饰的S3；e代表癌胚抗原；f代表分子转换法置换出来的S2; g代表多巴胺修饰的S5。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面通过实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

纸基电化学发光转化器的制备及在癌胚抗原检测中的应用：

（1）在计算机上设计纸基电化学发光转化器的疏水蜡批量打印图案，分别定义为纸芯片1和纸芯片2；

（2）利用蜡打印机在A4大小的纸芯片1和纸芯片2上打印上疏水蜡批量图案，随后将打印有疏水蜡批量图案的纸芯片放置到烘箱中加热直至蜡融化，使其在纸芯片上形成疏水区域；

（3）采用丝网印刷的方法将参比电极、对电极印刷图案依次印刷到步骤(2)中所得纸芯片1的正面左侧亲水区域上，其中正面右侧为亲水的工作区，正面左侧为参比区，纸芯片1的正面右侧工作区的反面印有工作电极；

（4）对纸芯片2的亲水区域功能化，在纸芯片上完成由蛋白质输入信号转化为特定适配体链输出信号的转变；

（5）对纸芯片1的亲水区域功能化，完成由特定适配体链引发的电化学发光信号的变化，实现癌胚抗原的检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 济南大学

<120> 纸基电化学发光转化器的制备及在癌胚抗原检测中的应用

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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