利用鱼的Ca2+‑ATP酶活性检测水体污染的方法与流程

本发明涉及利用生物敏感标志物检测水体污染，更具体地说，本发明涉及一种利用鱼的Ca²⁺-ATP酶活性检测水体污染的方法。

背景技术：

随着城镇化和工农业的迅猛发展，水体污染日益加剧。水域中的水体污染物也各有不同，有的为单一污染物，也有多种污染物混合污染。对于未知水域，只有测知水体是否被污染，是单一污染物的污染，还是多种污染物的污染，其污染程度如何，对生物的危害达到何种程度，才能调控和防治。对于水体中受到重金属或多环芳烃一种或两种污染时，用化学方法可以定性、定量检测到污染，但是无法检测其危害性和危害程度。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的就是提供一种利用鱼的Ca²⁺-ATP酶活性检测水体污染的方法，本方法利用鱼的Ca²⁺-ATP酶作为敏感生物标记物，可敏感地监测镉等重金属污染的污染程度和危害程度，还可以敏感地检测菲(Phe)等多环芳烃污染的污染程度和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。

为了实现根据本发明的这些目的和其他优点，提供了一种利用鱼的Ca²⁺-ATP酶活性检测水体污染的方法。本检测方法为获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的Ca²⁺-ATP酶作为敏感生物标记物。其中，Ca²⁺-ATP是三磷酸腺苷-钙的简写。

优选的是，所述鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与水体中重金属镉的浓度呈负相关。

优选的是，所述鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与水体中多环芳烃的浓度呈负相关。

优选的是，建立鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与污染物浓度关系的标准曲线，然后将待检测水域中的同种同大小的鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与所述标准曲线比对，得到待检测水域中水体污染物的浓度。

优选的是，所述标准曲线为鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与重金属镉浓度的关系曲线，或者鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与多环芳烃浓度的关系曲线。

优选的是，所述鱼的Ca²⁺-ATP酶活性测定包括如下步骤：

步骤一、待测样本处理：制备全鱼匀浆，然后离心分层，取上清液为待测样本；

步骤二、待测样本蛋白浓度的测定：分别将等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本对应加入1、2、3号管中，并分别向各管加入等量的考马斯亮蓝显色剂，分别混匀，静置。预热待用分光光度计并用双蒸水调零后，于1cm光径，波长595nm处，测定1、2、3号管中溶液的光密度，分别记为1号OD值，2号OD值，3号OD值，然后代入如下公式计算得待测样本蛋白浓度：

步骤三、酶促反应：在对照管和测定管中各加入等量的试剂盒之试剂一、试剂三、试剂四和试剂五，然后在所述测定管中加入待测样本，混匀，37℃准确反应10min；

步骤四、终止反应：在所述对照管和测定管中各加入试剂盒的同样量的试剂七终止反应，然后在所述对照管中加入与步骤三等量的待测样本，混匀，分别离心分层取4号上清液和5号上清液；试剂七为反应终止剂，加试剂七后再加入样品则不继续反应，故对照管为后加样品使之不起反应，以平衡其他样品管，减少测定误差。

步骤五、定磷：将等量的4号上清液、5号上清液和磷标准品应用液分别对应加入4、5、6号管中，然后分别加入等量的定磷剂混匀，于37℃水浴30min后凉至常温，预热待用分光光度计并用双蒸水调零后，于1cm光径，波长660nm处，逐管测定其光密度，分别记为对照OD值，测定OD值，标准OD值，然后代入如下公式计算得鱼的Ca²⁺-ATP酶活性：

优选的是，所述步骤一中全鱼匀浆为全鱼与浓度0.65％的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，且所述离心分层用冷冻离心机，11028g，4℃，离心10min。

优选的是，所述步骤二中等量的双蒸水、蛋白标准品和待测样本都是0.05ml，蛋白标准品的浓度为0.563g/L，分别加入考马斯亮蓝显色剂的量均为3ml，静置10min。

优选的是，所述步骤三中，在对照管和测定管中各加入试剂盒的试剂一130μl、试剂三40μl、试剂四40μl和试剂五40μl，然后在所述测定管中加入浓度为1％的待测样本200μl，反应温度为37℃；所述步骤四中，在对照管和测定管中各加入试剂盒的试剂七50μl，然后在所述对照管中加入浓度为1％的待测样本200μl；所述步骤五中等量的4号上清液、5号上清液和磷标准品应用液均为200ul，加入定磷剂的量均为2000ul。优选的是，所述鱼为海水青鳉或淡水青鳉。

本发明至少包括以下有益效果：本发明以水域中鱼的Ca²⁺-ATP酶作为敏感生物标记物，通过对比Ca²⁺-ATP酶活性就可以检测出水体是否受到污染，不但检测准确和敏感，而且直观反映该水域的污染对生物的危害程度。特别是鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与水体中重金属镉或多环芳烃的一种或两种的浓度均呈负相关，所以检测到鱼的Ca²⁺-ATP酶活性越低，其的水域受污染的程度越大，并且明示受到重金属镉或多环芳烃的一种或多种的污染。通过建立鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与重金属镉浓度关系的标准曲线，或者鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与菲等多环芳烃浓度关系的标准曲线，可以将待检测水域中与建立标准曲线同种同大小的鱼的Ca²⁺-ATP酶活性比对，获得水域中重金属镉浓度或菲等多环芳烃浓度或综合污染浓度值，并且能反映出目前的污染程度对生物是否在安全范围或受到危害。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书能够据以实施。

实施例1

本方案利用鱼的Ca²⁺-ATP酶活性检测水体污染的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并用所述鱼的Ca²⁺-ATP酶作为敏感生物标记物，通过检测鱼的Ca²⁺-ATP酶活性，然后比对同类同大小的鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与某污染物浓度关系的标准曲线，就可以获悉水体是否受到某污染物的污染，不但检测准确和敏感，而且能直观反映该水域的某污染物的污染程度及其对生物的危害程度。

实施例2

本方案利用鱼的Ca²⁺-ATP酶活性检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的Ca²⁺-ATP酶作为敏感生物标记物，根据鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与水体中重金属镉的浓度呈负相关，通过测定鱼的Ca²⁺-ATP酶活性，然后比对同类同大小的鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与镉浓度关系的标准曲线，如果检测样本鱼的Ca²⁺-ATP酶活性比无污染的同类同大小的鱼的Ca²⁺-ATP酶活性低，则判断水域受到镉的污染；如果比无污染的同类同大小的鱼的Ca²⁺-ATP酶活性越低，则判断水域的镉污染越严重，甚至可判断是否达到危害水体生物的程度。

实施例3

本方案利用鱼的Ca²⁺-ATP酶活性检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的Ca²⁺-ATP酶作为敏感生物标记物，根据鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与水体中菲(Phe)等多环芳烃的浓度呈负相关，通过测定鱼的Ca²⁺-ATP酶活性，然后比对同类同大小的鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与某多环芳烃浓度关系的标准曲线，如果检测样本鱼的Ca²⁺-ATP酶活性比无污染的同类同大小的鱼的Ca²⁺-ATP酶活性低，则判断水域受到某多环芳烃的污染；如果比无污染的同类同大小的鱼的Ca²⁺-ATP酶活性越低，则判断水域的某多环芳烃污染越严重，甚至可判断是否达到危害水体生物的程度。

实施例4

本方案利用鱼的Ca²⁺-ATP酶活性检测水体污染的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的Ca²⁺-ATP酶作为敏感生物标记物。首先通过实验建立鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与某污染物浓度关系的标准曲线，然后将待检测水域中的同种同大小的鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与所述标准曲线比对，得到待检测水域中某污染物的浓度。

通过实验建立鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与重金属镉浓度关系的标准曲线如下：

本实验的检测样本以海水青鳉为例，从养殖10天龄的仔鱼开始，分10组，每组3个平行进行，实验结束每个平行取3尾鱼样品测定，每组测定3x3＝9个数据，将每组9个数据数理统计后得到各组鱼的结果。10组仔鱼分别养殖在镉浓度为0，80，160，240，320，400，480，560，640，720μg/L的水体中，养殖条件均是盐度30±2，水温为28±2℃，pH为8.10，溶氧量≥6.10mg/L，光暗比为14h:10h，各组实验操作均相同。每天投喂饲料三次，总投喂量为投喂时鱼体湿重的5％。每天仔细观察和记录仔稚鱼活动、摄食、畸形、死亡等，并跟踪检测水体和鱼体镉的变化，7天后随机采集鱼样品，分别称重，存于-80℃冰箱中(因忙未能即测)用于分子、基因、生理、毒理和生化测定。测定并经数理统计后的各组鱼Ca²⁺-ATP酶活性分别是：0.272、0.260、0.223、0.203、0.152、0.112、0.095、0.083、0.068、0.063μmolPi/mgprot/hour。海水青鳉的Ca²⁺-ATP酶活性与水体中重金属镉的浓度呈负相关，然后根据实验结果绘制关系标准曲线。

通过实验建立鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与菲(Phe)浓度关系的标准曲线如下：

本实验的检测样本以海水青鳉为例，从养殖10天龄的仔鱼开始，分6组进行，每组3个平行进行，实验结束每个平行取3个样品测定，每组测定3x3＝9个数据，将每组9个数据数理统计后得到各组鱼的结果。6组中的1组仔鱼作为0周样品存于-80℃冰箱中，待测定用作对照；另外5组仔鱼分别养殖在菲浓度为0、250、500、750、1000μg/L的水体中，养殖条件均是盐度30±2，水温为28±2℃，pH为8.10，溶氧量≥6.10mg/L，光暗比为14h:10h，各组实验操作均相同。每天三次投喂饲料，总投喂量为投喂时鱼体湿重的5％。每天仔细观察和记录仔稚鱼活动、摄食、畸形、死亡等，并跟踪检测水体和鱼体菲的变化，7天后随机采集鱼样品，分别称重，存于-80℃冰箱中(暂存待测)用于分子、基因、生理、毒理和生化测定。测定并经数理统计后的各组鱼Ca²⁺-ATP酶活性分别是：0.203、0.133、0.095、0.054、0.036μmolPi/mgprot/hour。海水青鳉的Ca²⁺-ATP酶活性与水体中菲(Phe)的浓度呈负相关，然后根据实验结果绘制关系标准曲线。

测定待测水域中的海水青鳉的Ca²⁺-ATP酶活性之具体步骤如下：

步骤一、待测样本处理：取与建立标准曲线用鱼一样大小的海水青鳉制备全鱼匀浆，然后离心分层，取上层清液为待测样本；

步骤二、待测样本蛋白浓度的测定：分别将等量的双蒸水(空白对照)、蛋白标准品和待测样本对应加入1、2、3号管中，并分别向各管加入等量的考马斯亮蓝显色剂，分别混匀，静置。预热待用分光光度计并用双蒸水调零后，于1cm光径，波长595nm处，测定1、2、3号管中溶液的光密度(OD)，分别记为1号OD值，2号OD值，3号OD值，然后代入如下公式计算得待测样本蛋白浓度：

步骤三、酶促反应：在对照管和测定管中各加入等量的试剂盒之试剂一、试剂三、试剂四和试剂五，然后在所述测定管中加入待测样本，混匀，37℃准确反应10min；

步骤四、终止反应：在所述对照管和测定管中各加入试剂盒的同样量的试剂七终止反应，然后在所述对照管中加入与步骤三等量的待测样本，混匀，分别离心分层取4号上清液和5号上清液；试剂七为反应终止剂，加试剂七后再加入样品则不继续反应，故对照管为后加样品使之不起反应，以平衡其他样品管，减少测定误差。

步骤五、定磷：将等量的4号上清液、5号上清液和磷标准品应用液分别对应加入4号管、5号管和6号管中，然后分别加入等量的定磷剂混匀，于37℃水浴30min后凉至常温，预热待用分光光度计并用双蒸水调零后，于1cm光径，波长660nm处，逐管测定其光密度，分别记为对照OD值，测定OD值，标准OD值，然后代入如下公式计算得鱼的Ca²⁺-ATP酶活性：

然后将计算得海水青鳉的Ca²⁺-ATP酶活性大小与标准曲线比对，不但可以知道水体是否受到污染，而且从标准曲线中可以知道水体中镉浓度或菲浓度的大小或综合污染的大小，更能知道水体对生物体的危害程度。

实施例5

利用实验可以建立任何水体任何鱼种的鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与重金属镉浓度关系的标准曲线，或者建立不同种类的鱼的Ca²⁺-ATP酶活性与菲浓度关系的标准曲线，然后取待测水域中的鱼做样本，只要做样本的鱼与建立标准曲线的鱼是同类同大小的即可进行比对。

测定待测水域中的鱼的Ca²⁺-ATP酶活性具体步骤如下：

步骤一、待测样本处理：取与建立标准曲线用鱼一样和大小相当的鱼制备全鱼匀浆，全鱼匀浆为全鱼与0.65％浓度的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，然后用冷冻离心机，11028g，4℃，离心10min分层，取上层清液为待测样本；

步骤二、待测样本蛋白浓度的测定：分别将双蒸水、浓度为0.563g/L的蛋白标准品和待测样本各0.05ml加入1、2、3号管中，并分别向各管加入考马斯亮蓝显色剂3ml，分别混匀，静置10min，预热到35℃，预热待用分光光度计并用双蒸水调零后，于1cm光径，波长595nm处，测定1、2、3号管中溶液的光密度，分别记为1号OD值，2号OD值，3号OD值，然后代入如下公式计算得待测样本蛋白浓度：

步骤三、酶促反应：在对照管和测定管中各加入等量的试剂盒试剂一130μl、试剂三40μl、试剂四40μl和试剂五40μl，然后在所述测定管中加入待测样本200μl，混匀，37℃准确反应10min；

步骤四、终止反应：在所述对照管和测定管中各加入试剂盒的同样量的试剂七50μl终止反应，然后在所述对照管中加入待测样本200μl，混匀，分别离心分层取4号上清液和5号上清液；

步骤五、定磷：将4号上清液、5号上清液和浓度为0.5umol/ml的磷标准品应用液各200ul分别加入4、5、6号管中，然后分别加入2000ul定磷剂混匀，于37℃水浴30min后，凉至常温，预热待用分光光度计并用双蒸水调零后，于1cm光径，波长660nm处，测定各管光密度，分别记为对照OD值，测定OD值，标准OD值，然后代入如下公式计算得鱼的Ca²⁺-ATP酶活性：

将计算得鱼的Ca²⁺-ATP酶活性大小与标准曲线比对，不但可以知道水体是否受污染，而且从标准曲线中可以知道水体中镉浓度或菲浓度的大小或综合污染的大小，更能知道水体对生物体危害程度。

实施例6

利用实验建立20日龄的淡水青鳉的Ca²⁺-ATP酶活性与重金属镉浓度关系的标准曲线和Ca²⁺-ATP酶活性与多环芳烃菲浓度关系的标准曲线，然后取待测水域中的鱼做样本，只要取得样本的鱼与建立标准曲线的鱼是同类同大小的即可进行比对。

取得待测水域中20日龄的淡水青鳉做样本，然后测定待测水域中的该鱼的Ca²⁺-ATP酶活性具体步骤如下：

步骤一、待测样本处理：取与建立标准曲线用鱼一样和大小相当的鱼制备全鱼匀浆，全鱼匀浆为全鱼与0.65％浓度的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，然后用冷冻离心机，11028g，4℃，离心10min分层，取上层清液为待测样本；

步骤二、待测样本蛋白浓度的测定：分别将双蒸水、浓度为0.563g/L的蛋白标准品和待测样本各0.05ml加入1、2、3号管中，并分别向各管加入考马斯亮蓝显色剂3ml，分别混匀，静置10min，预热到35℃，预热待用分光光度计并用双蒸水调零后，于1cm光径，波长595nm处，测定1、2、3号管中溶液的光密度，分别记为1号OD值，2号OD值，3号OD值，然后代入如下公式计算得待测样本蛋白浓度：

步骤三、酶促反应：使用南京生物工程研究所生产的试剂盒将对照管和待测样本酶促反应后，分别离心分层取得4号上清液(对照管)和5号上清液(待测样本管)，其中酶促反应具体操作如表1：

表1酶促反应的具体操作

步骤四、定磷：将4号上清液、5号上清液和浓度为0.5umol/ml的磷标准品应用液各200ul分别加入4、5、6号管中，然后分别加入2000ul定磷剂混匀，于37℃水浴30min后，冷却至常温，预热，用分光光度计并用双蒸水调零后，于1cm光径，波长660nm处，测定各管光密度，分别记为对照OD值，测定OD值，标准OD值，然后代入如下公式计算得鱼的Ca²⁺-ATP酶活性为0.255μmolPi/mgprot/hour：

将计算得鱼的Ca²⁺-ATP酶活性大小与Ca²⁺-ATP酶活性与重金属镉浓度关系的标准曲线以及Ca²⁺-ATP酶活性与多环芳烃菲浓度关系的标准曲线分别比对，得到待测水域的镉污染浓度为90μg/L，多环芳烃菲浓度为0；这样既可以知道水体已受到污染，而且从标准曲线中可以知道水体中镉浓度或菲浓度的大小，更能知道水体对生物体危害程度。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列应用范例，它完全适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地另行修改他用，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。