制备两种二抗共轭物及其用于同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原的方法与流程

本发明涉及医学肿瘤标志物检测领域，具体是一种1,1’—二茂铁二甲酸/金@铂（Fc/Au@Pt）纳米复合物和硫堇/金@铂（Thi/Au@Pt）纳米复合物的制备及其同时对甲胎蛋白和癌胚抗原进行特异性检测的方法。

背景技术：

现代肿瘤学认为恶性肿瘤是一种全身性的疾病，除心脏等个别器官较少发病外, 几乎在人体各个器官、组织皆可出现，且部分癌症从发病直至晚期无明显自觉症状, 因而给早期诊断增加了难度。鉴于此，人们期望通过对肿瘤标志物的检测实现癌症的早期诊断及治疗。对肿瘤标志物的高灵敏度检测对癌症的检测和治疗具有较高的研究价值。(Freedland S., 2011. Cancer 117, 1123–1135.).然而，对单一肿瘤标志物检测由于在肿瘤标志物与肿瘤间的特异性较低，从而面临巨大的挑战。（Chikkaveeraiah B.V., Bhirde A.A., Morgan N.Y., Eden H.S., Chen X.Y., 2012. ACS Nano 6, 6541–6546.）例如，癌胚抗原（CEA）与肺癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌和结肠直肠癌有联系，而甲胎蛋白（AFP）与肝癌和卵巢癌有关。一些研究证明同时检测多种肿瘤标志物可以有效的提高检测灵敏度和特异性，而且可以降低总成本，提高测试效率。（Hu M., Yan J., He Y., Lu H., Weng L., Song S., Fan C., Wang L. ACS Nano 4 (2009) 488–494.）对肿瘤标志物的检测方法主要有酶联免疫法（Wan, Y., Qi P., Zhang D.,Wu J.J., Wang Y. 2012. Biosens.Bioelectron. 33, 69–74.和Jia, C.P.,Zhong, X.Q., Hua, B., Liu, M.Y., Jing, F.X., Lou, X.H., Yao, S.H., Xiang, J.Q., Jin, Q.H., Zhao, J.L. 2009. Biosens.Bioelectron. 24, 2836–2841.）、化学发光免疫法（Zhang A.M., Xiang H.K., Zhang X., Guo W.W., Yuan E.H., Huang C.S., Jia N.Q., 2016. Biosens. Bioelectron. 75,206–212.和Xu S.J., Liu Y., Wang T.H., and Li J.H. 2011.Anal. Chem., 83 (10), 3817–3823.）和荧光免疫法（Xie, Q.F., Weng X.H., Lu L.J., Lin Z.Y., Xu X.W., Fu C.L.2015. Biosens. Bioelectron. 77, 46–50. 和Hua, W.H., Liua, Y.S., Yang, H.B., Zhou, X.Q., Li, C.M. 2011. Biosens. Bioelectron.26,3683–3687.）等，虽然这些方法具有灵敏、准确、特异性高等特点, 但其在环保防护、操作速度、定量检测等方面各有不足之处; 尽管有的已实现了自动化，但由于专用仪器、专用试剂价格昂贵，目前尚不能在实验室普及应用。因而发展新的免疫检测技术，降低检测成本，加快检测速度和在线能力以适应大规模筛查已成为亟待解决的问题。为了满足现代生物检测需求，免疫传感器应运而生。它是将高灵敏的传感技术与特异性免疫反应结合起来，监测抗原抗体反应的生物传感器，具有快速、灵敏、选择性高、操作简便等优点，广泛应用于临床检测与诊断。其中，电化学免疫传感器由于其设备小型化，简化分析过程，测量过程自动化等独特优点已经成为检测肿瘤标记物的有力的方法。

纳米材料的构建是电化学免疫传感器的关键问题，纳米材料具有很强的吸附能力、良好的定向能力和生物兼容性，并能有效解决敏感材料的固定及再生问题，大大地提高了传感器的灵敏度及稳定性，能缩短检测时间并实现高通量实时检测。

本文选择制备1,1’—二茂铁二甲酸/金@铂（Fc/Au@Pt）纳米复合物和硫堇/金@铂（Thi/Au@Pt）纳米复合物用作标记物分别修饰两种二抗来制备电化学免疫传感器，并用于同时对两种肿瘤标记物（以甲胚蛋白AFP和癌胚抗原CEA为例）进行特异性检测。两种纳米复合物材料的制备方法简单、快速、成本低，以此为标记物的免疫传感器具有较好的选择性、稳定性和重现性。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种同时对甲胎蛋白和癌胚抗原快速检测的纳米材料，该材料能在常规条件下实现对甲胎蛋白和癌胚抗原同时进行检测，并具有较低的检测限，且能用于实际血清样品的检测。

本发明所采用的技术方案是：使用1,1’—二茂铁二甲酸/金@铂和硫堇/金@铂分别制备两种二抗共轭物，按照如下的步骤进行：

步骤一、将硝酸钴Co(NO₃)₂·6H₂O和聚乙烯吡咯烷酮PVP加入到水中溶解，在纯氮气条件下振荡15min，然后加入硼氢化钠NaBH₄，在氮气氛围下搅拌30min，确保NaBH₄全部反应完毕，溶液由无色变为深棕色，说明溶液中形成了钴纳米颗粒CoNP_S；

步骤二、氯金酸HAuCl₄ · 4H₂O溶液和氯铂酸钾K₂PtCl₆溶液逐滴加入到生成CoNP_S颗粒的溶液中，搅拌15min，使得CoNP_S与HAuCl₄、K₂PtCl₆充分反应。关闭氮气，离心除去Co模板，即得到溶有Au@Pt纳米壳核材料的溶液；

步骤三、将2-氨基乙醇酸溶液加入到制得的Au@Pt纳米材料水溶液中，室温下振荡反应5h，接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS固体颗粒在室温下反应30min，然后将1,1’—二茂铁二甲酸FcDC溶液加到上述溶液中室温下过夜振荡，制得Fc/Au@Pt纳米复合物的溶液；

步骤四、将硫代乙醇酸溶液加入到制得的Au@Pt纳米材料水溶液，室温下振荡反应5h，接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS固体颗粒在室温下反应30min，然后将硫堇Thi溶液加到上述溶液中室温下过夜振荡，制得Thi/Au@Pt纳米复合物的溶液；

步骤五、将甲胎蛋白AFP和癌胚抗原CEA的二抗Ab₂分别加入到步骤三和步骤四制备的Fc/Au@Pt纳米复合物、Thi/Au@Pt纳米复合物中，在4℃的环境下过夜孵育12h，对生成产物离心，用磷酸缓冲溶液PBS清洗后，离心清洗分别得到了Fc/Au@Pt/Ab₂和Thi/Au@Pt/Ab₂两种二抗共轭物。

作为一种优选方式：步骤一中，Co(NO₃)₂·6H₂O 的量为6.85-8.22a毫克，PVP为100-120a毫克，二者同时溶于50-60a毫升的蒸馏水中，NaBH₄溶液的量为10-12a毫升，浓度为1毫克/毫升，步骤二中，HAuCl₄ · 4H₂O 的量为80-96a微升，浓度为25毫摩尔/升，K₂PtCl₆溶液的量为320-385a微升，浓度为25毫摩尔/升，步骤三，2-氨基乙醇酸水溶液的量为1-1.2a毫升，浓度为100毫摩尔/升，Au@Pt纳米材料水溶液的浓度为3.5毫摩尔/升，量为1-1.2a毫升，EDC的加入量为19.17-23a毫克，NHS的量是11.51-13.81a毫克，1,1’-二茂铁二甲酸的量为2-2.4a毫升，浓度是100毫摩尔/升，步骤四中，硫代乙醇酸溶液的量为1-1.2a毫升，浓度为100毫摩尔/升，Au@Pt纳米材料水溶液的浓度为3.5 毫摩尔/升，量为1-1.2 a毫升，EDC的加入量为19.17-23a毫克，NHS的量为11.51-13.81a毫克，硫堇的量为2-2.4a毫升，浓度是100毫摩尔/升，步骤五中，甲胎蛋白二抗和癌胚抗原二抗的浓度都为1微摩尔/升，加入量都为250-400a微升，Fc/Au@Pt纳米复合物和Thi/Au@Pt纳米复合物的浓度分别为3毫摩尔/升，量都为1-1.2a毫升，a为正整数。

使用1,1’—二茂铁二甲酸/金@铂和硫堇/金@铂分别制备两种二抗共轭物，用于构建的电化学免疫传感器对甲胎蛋白AFP和癌胚抗原CEA同时检测的方法，：将用氧化石墨烯/金复合物GO/Au修饰的玻碳电极放入甲胎蛋白和癌胚抗原的抗体混合溶液中，在4℃孵育6-12小时，然后取出玻碳电极放在牛血清蛋白BSA中孵育2-6小时封闭未特异性结合的活性位点，取出玻碳电极后依次用不同浓度的甲胎蛋白抗原和癌胚抗原混合物修饰玻碳电极，使得抗原与抗体特异性结合，然后将修饰好的玻碳电极在Fc/Au@Pt/Ab₂和Thi/Au@Pt/Ab₂两种二抗共轭物的混合物中保持25℃下孵育0.5-1小时，然后用PBS溶液清洗2-5次，构建成夹心免疫传感器；将夹心免疫传感器使用差分脉冲伏安法DPV检测甲胎蛋白和癌胚抗原的浓度。

作为一种优选方式：用GO/Au纳米颗粒进行修饰的玻碳电极是指将玻碳电极用Al₂O₃粉末打磨，然后分别在去离子水，丙酮，乙醇中超声清洗，最后将GO/Au纳米颗粒滴到玻碳电极上。

作为一种优选方式：依次用不同浓度的甲胎蛋白抗原和癌胚抗原修饰玻碳电极是指将玻碳电极依次在甲胎蛋白和癌胚抗原都分别为0.01纳克/毫升、0.05纳克/毫升、0.1纳克/毫升、0.5纳克/毫升、1纳克/毫升、5纳克/毫升、10 纳克/毫升、50纳克/毫升、80纳克/毫升的混合物中，在25℃下孵育0.5-1小时。

作为一种优选方式：将夹心免疫传感器使用差分脉冲伏安法DPV检测甲胎蛋白和癌胚抗原混合物的浓度是指，将夹心免疫传感器在过氧化氢H₂O₂浓度为0.25 毫摩尔/升、磷酸浓度为0.2毫摩尔/升、PH为7的待测溶液中以100 mV/s的扫描速率在-0.6到0.8V进行测试，夹心免疫传感器对抗原是非线性吸附，甲胎蛋白抗原和癌胚抗原的浓度检测范围都分别是0.01纳克/毫升到80纳克/毫升，在此范围内，甲胎蛋白浓度的对数与电流信号成线性相关性，对应的线性方程为y=-0.79157lg(x)-2.57736，其中，x是甲胎蛋白抗原的浓度，单位是纳克/毫升，y是检测的电流信号，单位是微安，同样可得到在0.01纳克/毫升到80纳克/毫升的检测范围内，癌胚抗原浓度的对数和电流信号强度成线性相关性，对应的线性相关方程为y’=-0.78802lg(x’)-3.65705，其中，x’是癌胚抗原的浓度，单位是纳克/毫升，y’是检测的电流信号，单位是微安。

本发明的有益效果是：1、1,1’—二茂铁二甲酸/金@铂和硫堇/金@铂两种二抗共轭物混合物的制备，构建的电化学免疫传感器对甲胎蛋白（AFP）和癌胚抗原(CEA)同时检测的方法。此电化学免疫传感器具有较好的灵敏度，并且检测速度快，准确率高，检测甲胎蛋白有较好的专一性。

附图说明

图1是GO/Au透射电子显微镜（TEM）图（50nm）；

图2是Au@Pt透射电子显微镜（TEM）图(100nm)；

图3是Fc/Au@Pt透射电子显微镜（TEM）图(100nm)；

图4是Thi/Au@Pt透射电子显微镜（TEM）图(200nm)；

图5用差分脉冲伏安法DPV检测甲胎蛋白和癌胚抗原的浓度的电流和电势图；

图6使用差分脉冲伏安法DPV检测甲胎蛋白的浓度的电流与甲胎蛋白的浓度对数图；

图7使用差分脉冲伏安法DPV检测癌胚抗原的浓度的电流与甲胎蛋白的浓度对数图。

具体实施方式

使用1,1’—二茂铁二甲酸/金@铂和硫堇/金@铂分别制备两种二抗共轭物，用于构建的电化学免疫传感器对甲胎蛋白（AFP）和癌胚抗原(CEA)同时检测的方法，按照如下的步骤进行

步骤一、将6.85-8.22毫克硝酸钴（Co(NO₃)₂·6H₂O）和100-120毫克聚乙烯吡咯烷酮（PVP）加入到50-60毫升水中溶解，纯氮气条件下振荡15min。然后加入10-12毫升，浓度为1毫克/毫升的硼氢化钠（NaBH₄），在氮气氛围下搅拌30min，确保NaBH₄全部反应完毕，溶液由无色变为深棕色，说明溶液中形成了钴纳米颗粒（CoNP_S）。

步骤二、将80-96微升，浓度为25毫摩尔/升的氯金酸（HAuCl₄ · 4H₂O）溶液和 320-385微升，浓度为25毫摩尔/升的氯铂酸钾（K₂PtCl₆）溶液逐滴加入到生成的CoNP_S溶液中，搅拌15min，使得CoNP_S与HAuCl₄、K₂PtCl₆充分反应。关闭氮气，离心除去Co模板，即得到Au@Pt纳米壳核材料的溶液，图2是对Au@Pt纳米壳核材料的TEM图谱，图中可以发现形成了直径大概有100-150nm的Au@Pt纳米团簇，纳米簇大小均一，分散性好。

步骤三、将1-1.2毫升，浓度为100毫摩尔/升的2-氨基乙醇酸溶液加入到制得的1-1.2毫升，浓度为3.5毫摩尔/升的Au@Pt纳米材料水溶液，室温下振荡反应5h,用二次水离心清洗三次后溶于水中，接着加入19.17-23毫克的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和11.51-13.81毫克的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）固体颗粒在室温下反应30min。然后将1,1’—二茂铁二甲酸（FcDC）加到上述溶液中室温下过夜振荡，制得Fc/Au@Pt纳米复合物的溶液，图3是Fc/Au@Pt纳米复合物的透射电镜图，在FcDC的连接作用下，纳米团簇发生了聚集，形成较大的纳米簇。

步骤四、将1-1.2毫升，浓度为100毫摩尔/升的硫代乙醇酸溶液加入到制得的1-1.2毫升，浓度为3.5毫摩尔/升的Au@Pt纳米材料水溶液，室温下振荡反应5h,用二次水离心清洗三次溶于水中，接着加入19.17-23毫克的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和11.51-13.81毫克的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）固体颗粒在室温下反应30min。然后将硫堇加到上述溶液中室温下过夜振荡，制得Thi/Au@Pt纳米复合物，图3是Thi/Au@Pt纳米复合物的透射电镜图，在Thi的连接作用下，纳米团簇发生了聚集，形成较大的纳米簇。

步骤五、将甲胎蛋白（AFP）和癌胚抗原(CEA)的二抗Ab₂（二抗Ab₂浓度都为1微摩尔/升，加入量都为250-400 微升）分别加入到步骤三和步骤四制备的1-1.2毫升，浓度为3毫摩尔/升的Fc/Au@Pt纳米复合物1-1.2毫升，浓度为3毫摩尔/升的Thi/Au@Pt纳米复合物中，在4℃的环境下孵育12h，对生成产物离心，用磷酸缓冲溶液PBS清洗后，离心得到的Fc/Au@Pt/Ab₂二抗共轭物和Thi/Au@Pt/Ab₂二抗共轭物。

使用1,1’—二茂铁二甲酸/金@铂和硫堇/金@铂分别制备两种二抗共轭物，用于构建的电化学免疫传感器对甲胎蛋白（AFP）和癌胚抗原(CEA)同时检测的方法，首先将玻碳电极用三氧化二铝Al₂O₃粉末打磨，然后分别在去离子水，丙酮，乙醇中超声清洗，GO/Au纳米颗粒附着于玻碳电极上，然后将用GO/Au纳米颗粒进行修饰的玻碳电极放入甲胎蛋白抗体和癌胚抗原的抗体混合溶液中，在4℃孵育6-12小时，然后取出玻碳电极放在牛血清蛋白BSA中孵育2-6小时封闭未特异性结合的活性位点，取出玻碳电极后依次用不同浓度的甲胎蛋白抗原和癌胚抗原修饰玻碳电极是指依次在不同浓度的甲胎蛋白和癌胚抗原混合物中保持25℃下孵育0.5-1小时，两种抗原在混合物中的浓度都分别为0.01纳克/毫升、0.05纳克/毫升、0.1纳克/毫升、0.5纳克/毫升、1纳克/毫升、5纳克/毫升、10 纳克/毫升、50纳克/毫升、80纳克/毫升，使得抗原与抗体特异性结合，然后将修饰好的玻碳电极在Fc/Au@Pt纳米复合物、Thi/Au@Pt纳米复合物 Ab₂共轭物的混合物中保持25℃下孵育0.5-1小时，然后用PBS溶液清洗2-5次，构建成夹心免疫传感器；将夹心免疫传感器使用差分脉冲伏安法DPV检测甲胎蛋白和癌胚抗原的浓度。（使用CHI-660E电化学工作站的差分脉冲伏安法DPV）检测甲胎蛋白抗原和癌胚抗原的浓度；将夹心免疫传感器使用差分脉冲伏安法DPV检测AFP和CEA的浓度是指，将夹心免疫传感器在过氧化氢H₂O₂浓度为0.25 毫摩尔/升、磷酸浓度为0.2毫摩尔/升、PH为7的待测溶液中以100 mV/s的扫描速率在-0.6到0.8V进行测试（如图5），夹心免疫传感器对AFP和CEA是非线性吸附，当甲胎蛋白的浓度在0-0.1 pg/ml时，观察到空白缓冲液的电流信号近似-1微安，当甲胎蛋白的浓度在0.01纳克/毫升时，得到的电流信号开始大于-1微安，随着甲胎蛋白浓度的增大，电流信号也在逐渐增大，甲胎蛋白抗原的浓度检测范围是0.01纳克/毫升到80纳克/毫升，如图6所示，在此范围内，甲胎蛋白浓度的对数与电流信号成线性相关性，其线性相关系数平方是0.994，对应的线性方程为y=-0.79157lg(x)-2.57736，其中，x是甲胎蛋白抗原的浓度，单位是纳克/毫升，y是检测的电流信号，单位是微安。同理，当癌胚抗原的浓度在0-0.1 pg/ml时，观察到空白缓冲液的电流信号近似-2微安，当甲胎蛋白的浓度在0.01纳克/毫升时，得到的电流信号开始大于-2微安，可得到癌胚抗原浓度的检测范围是0.01纳克/毫升到80纳克/毫升，如图7所示，癌胚抗原浓度的对数与电流信号的线性关系为y’=-0.78802lg(x’)-3.65705，线性相关系数的平方是0.993，甲胎蛋白和癌胚抗原的最低检测限分别为2.6皮克/毫升和3.2皮克/毫升(信噪比为3)，与其它检测方法相比，构建的电化学免疫传感器具有较低的检测限和较宽的检测范围（图6和图7中，R是线性回归的线性相关系数，R²是线性相关系数的平方，n代表的是实验次数）。

甲胎蛋白抗原浓度与电流信号的对应关系如下表所示

癌胚抗原浓度与电流信号的对应关系如下表所示

为了检测在该实验中目标免疫传感器的选择性和特异性，我们采用了回收实验进行验证，在胎牛血清样品中同时加入不同浓度的CEA和AFP，通过检测样品中CEA和AFP的回收率以检测目标免疫传感器的选择性和特异性，检测结果如下表所示：

序号 标准量(ng/mL) 回收量 (ng/mL) 回收率(%)

CEA AFP CEA AFP CEA AFP

1 60 60 57.04 65.11 95 108

2 30 30 29.73 27.84 99.1 92.8

3 10 10 9.45 9.83 94.5 98.3

4 5 5 4.82 5.34 96.4 107

5 1 1 0.988 0.965 98.8 96.5

6 0.5 0.5 0.492 0.493 98.4 98.5

7 0.1 0.1 0.0968 0.0952 96.8 95.2

8 0.05 0.05 0.0502 0.0485 100.3 97

9 0.01 0.01 0.0091 0.0011 91.3 106

通过上表可以看出，胎牛血清中加入不同浓度CEA和AFP抗原，CEA的回收率在94.5%～100.3%的合理范围，说明血清中的其他蛋白对CEA测定干扰很小，AFP的回收率在92.8～108范围内，该目标免疫传感器对两种肿瘤标志物选择性特异性较好。

特异性

为了验证免疫传感器的特异性，1ng/mL的CEA和AFP抗原混合物与100ng/mL的干扰物质（抗坏血酸，牛血清蛋白，葡萄糖，尿素，前列腺特异性抗原）混合，对电化学信号进行检测，发现与纯1ng/mL的CEA和AFP的抗原混合物比较，干扰物质引起的电流强度变化低于3%，证明1,1’—二茂铁二甲酸/金@铂（Fc/Au@Pt）纳米复合物和硫堇/金@铂（Thi/Au@Pt）纳米复合物构建的电化学免疫传感器对甲胎蛋白和癌胚抗原具有较强的特异性。