一种哺乳动物高原脑水肿生物标志物及其应用的制作方法

本发明属于高原脑水肿的生物标志物，具体涉及脂多糖在检测哺乳动物高原脑水肿中的应用。

背景技术：

急性高原病主要包括急性高山病、高原肺水肿和高原脑水肿，其中急性高山病发病率最高，影响范围最广，其发病与低氧血症引起的水钠潴留和脑血管通透增高导致脑水肿，颅内压增高等有关，其中脑血管通透性增加，血管收缩舒张失衡是急性高原病的重要机制，此类疾病发展迅猛、极易导致扩大的炎症反应、死亡率高，严重危及急进高原人群的健康。因此，寻找高原脑水肿的生物标志物对于此类疾病的预测和预警具有十分重要的意义。

研究发现：炎症介质是血管通透性增加,血管收缩舒张失衡的重要调节因素。机体的炎症状态是急性高原病的重要诱发因素，但目前关于其具体机制仍不清楚。低氧可影响和启动炎症免疫反应，模拟急性高原暴露可引起健康志愿者外周血白细胞升高，血清中IL-6显著升高；低氧性肺动脉高压小鼠肺血管周围有大量炎症细胞浸润，肺组织中炎症因子(IL-1β、IL-6、MCP-1等)表达显著增高；肺血管组织中ICAM-1、VCAM-1和E-selectin等细胞粘附分子表达也显著增多；缺氧诱导的内皮细胞ICAM1、整合素家族等细胞粘附分子表达上调。由此可见，炎症是影响高原病发生、发展的关键环节。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是大肠杆菌细胞壁上的主要成分，也是其主要的致病成分，与脑水肿的发生密切相关。LPS为革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分，释放入血后被称为内毒素，可与动物体内CD14/TLR4/MD2受体结合，对血脑屏障功能的破坏具有重要作用，短时间内可引发强烈的外周和脑部炎症反应。同时，革兰氏阴性细菌感染产生的内毒素造成机体组织细胞损害和功能障碍，对肠黏膜的屏障功能造成破坏，黏膜通透性增加，导致细菌易位。此外，LPS注射可导致脑内IL-1β和TNF-α在mRNA和蛋白水平均明显升高，出现意识障碍及抑郁样行为，因此常被用为脑内炎症因子升高的模型。

因此，通过血浆内毒素的定量测定，能较早地预示患者体内存在相应的病原菌感染，连续检测还能反映病程的发展及预后并评估临床疗效，可作为哺乳动物高原脑水肿的生物标记分子，用于高原脑水肿发生的预测和预警。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测哺乳动物高原脑水肿的生物标志物脂多糖及其应用

脂多糖(LPS)的用途，用于检测哺乳动物高原脑水肿的生物标志物。

所述脂多糖在哺乳动物血浆中的含量，当血浆中LPS的含量超过0.5EU/ml时，哺乳动物脑组织含水量增加，判定为高原脑水肿症状。

所述哺乳动物为鼠，人，狗，猫，羊，牛或鹿。

本发明的有益效果：本发明的实验结果证明血浆LPS的含量增加与高原脑水肿的发生有明显的相关性。脂多糖可以作为高原脑水肿的发生检测的标志物，其灵敏性和准确性均能达到检测的要求。

附图说明

图1是正常小鼠与高原脑水肿小鼠血浆LPS含量柱形图；每组n＝20,**p＜0.01。

图2是血浆中LPS含量增加后，高原低氧小鼠脑含水量柱形图，每组n＝20，**p＜0.01。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

取雄性C57BL/6小鼠100只，其中50只小鼠放入低压低氧舱进行高原低氧处理(模拟海拔高度6,000m)，6小时后取血浆和脑组织进行小鼠血浆内毒素含量及脑组织含水量测定及的测定，小鼠血浆内毒素采用厦门鲎试剂实验试剂厂生产的鲎试剂进行检测。

1)血浆内毒素含量的检测参照试剂盒说明书进行操作，步骤为：

1.细菌内毒素标准溶液的配置

标准曲线所采用的内毒素溶度为0.1，0.25，0.5，1.0EU/ml。稀释方法如下：取细菌内毒素工作品1支，按细菌内毒素工作品使用说明书稀释为10EU/ml的内毒素溶液，在稀释为1EU/ml，以1EU/ml的内毒素溶液为母液稀释成0.1，0.25，0.5EU/ml的浓度梯度，配制好的标准液在4小时内用完。2.阴性对照为细菌内毒素检查用水

鲎试剂：按照示量加细菌内毒素检查用水于鲎试剂中，轻轻震荡使其完全溶解，10min内用完。

显色基质：按照标示量加细菌内毒素检查用水于显色基质中，轻轻振摇使其完全溶解，在4℃条件下贮存8h内用完。

偶氮化试剂1：按标示量加反应终止剂盐酸于偶氮化试剂1中，

偶氮化试剂2：按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂2中，

偶氮化试剂3：按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂3中，

偶氮化试剂溶液可于4℃环境中贮存1周。

2.具体操作过程

a)取无热原试管，加入100ul细菌内毒素检查用水，内毒素标准溶液以及待测样品，待测样品为正常小鼠血浆及高原脑水肿小鼠血浆，再加入100ul鲎试剂溶液，混匀，37℃温育60分钟

b)温育结束,加入100ul显色基质溶液，混匀，37℃温育6分钟

c)温育结束，加入500ul偶氮化试剂1溶液，混匀

d)加入500ul偶氮化试剂2溶液，混匀

e)加入500ul偶氮化试剂3溶液，混匀，静置5min，于545nm波长处读取吸光度值。

f)数据处理：建立标准曲线：Y＝bX+a，r≥0.980，根据曲线计算内毒素含量。

结果如图1所示，高原低氧小鼠血浆LPS含量显著高于正常小鼠，血浆中LPS含量可作为小鼠高原脑水肿发生的标志物，该检测方法简单适用。

2)小鼠脑组织含水量的测定

每组取20只鼠于高原低氧后处死,即刻取脑组织用电子天平称重(湿重,精确到0.1mg),然后置于100℃恒温箱烘烤24h后称重(干重)。按Blliot公式计算,脑组织含水量＝(湿重-干重)/湿重×100％。

根据多次试验确定，当血浆中LPS的含量超过0.5EU/ml时，哺乳动物脑组织含水量增加(如图1所示)，判定为高原脑水肿症状。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。